专利名称：大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmST1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及大豆圣豆9号NAC转录因子基因——GmSTl及其应用。
背景技术：
大豆是重要的经济作物，因此提高和优化大豆品质成为人们关注的热点。我国是世界上最缺水的国家之一，干旱是我国农业生产主要自然灾害，且盐碱地和次生盐碱化耕地的面积逐年增加，这些不利的环境条件严重制约了我国的农作物产量。为了适应这些不利的环境，植物内部发展一系列的防卫措施，也需要非生物胁迫应答基因参与。目前已经鉴 定了许多盐和干旱应答基因并验证了他们在非生物胁迫中的功能，但关于很多非生物胁迫相关的基因的生物学功能仍然是未知的。植物转录因子研究是功能基因组研究的一个重要方面。虽然转录因子在基因组中所占比例很少，但在调控植物的生长发育、响应外界环境胁迫中发挥重要作用。NAC转录因子是近十年来新发现的植物特有的转录调控因子。1997年Aida等首先报道了 NAC结构域，发现在矮牵牛NA M基因、拟南芥A TA F1/2和⑶C2基因编码蛋白的N端包含一段保守的氨基酸序列，取三基因首字母命名为NAC。第一个NAC转录因子是由Souer等于1996年从矮牵牛中克隆得到的，随后在拟南芥、水稻、小麦、大豆等物种中相继发现，目前在拟南芥中共发现了 105个NAC成员，而大豆中则发现了 226个。研究表明，NAC转录因子在植物的生长发育、器官建成、激素调节和防御抵抗多种生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用。植物的生存环境复杂多变，经常遭受干旱、高盐、低温和病虫害等逆境胁迫，影响植物的生长发育，甚至会造成植物死亡，严重影响农业生产和生态环境。NAC转录因子受多种生物胁迫和非生物胁迫的诱导表达，参与植物的胁迫应答。然而，还未见大豆NAC膜结合转录因子功能的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆圣豆9号NAC转录因子基因-GmSTl及其应用。本发明的技术方案是从圣豆9号中分离得到NAC转录因子基因-GmSTl，将该基因转到模式植物拟南芥中证明其功能，然后将该基因转到原植株大豆中得到抗盐/耐旱性提闻的转基因植株。本发明所述的大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmSTl，其特征在于所述基因GmSTl的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。本发明还提供了一种含上述的大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmSTl的植物表达载体PK2GW7: :GmSTl，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。本发明还提供了一种含上述的大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmSTl的植物表达载体PB2GW7: :GmSTl，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示。本发明所述圣豆9号NAC转录因子基因GmSTl在提高植株抗盐/耐旱性中的应用。
其中所述植株是大豆或拟南芥；进一步的，所述拟南芥是Col-O野生型，大豆品种是鲁豆11。具体的，本发明所述圣豆9号NAC转录因子基因GmSTl在拟南芥或大豆植株中表达GmSTl的应用。本发明首先在圣豆9号植株中克隆到了 NAC转录因子基因GmSTl ;利用gateway系统将GmSTl基因进行BP反应连接到pD0NR221 (见图I)，然后通过转化的方法在大肠杆菌DH5 α中得到大量克隆，接着进行LR反应把此基因GmSTl分别连接到表达载体pK2GW7 (见图2)和pB2GW7(见图3)上，并在大肠杆菌DH5a中表达；接着筛选转基因大肠杆菌，并提取转化质粒，最后将转化质粒转入农杆菌菌株GV3101中。将转化农杆菌菌株转入拟南芥和大豆中，从而验证表达的GmSTl的功能。本发明的有益效果利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了圣豆9号NAC转录因子基因GmSTl并在拟南芥中进行表达，使转基因拟南芥获得了非转基因拟南芥所不具备的提高抗盐/耐旱性的能力。通过大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方 法将该基因转入大豆中，经过比较分析证明，转基因植株比非转基因植株的抗盐/耐旱性提闻。本发明所述的基因可广泛用于培育抗盐/耐旱的植物品种。
图I为入门载体pD0NR221图谱。图2为植物表达载体pK2GW7图谱。图3为植物表达载体pB2GW7图谱。图4为圣豆9号NAC转录因子基因GmSTl的cDNA电泳图，其中M为Marker，泳道1、2、3为基因的cDNA。图5为转GmSTl基因的拟南芥纯系筛选。图6为圣豆9号NAC转录因子基因GmSTl在转基因拟南芥中RealTime-PCR表达分析。图7为转基因的拟南芥中抗盐性的分析。图8为转基因的拟南芥中耐旱性的分析。图9转GmSTl基因的大豆再生植株。图10为转基因圣豆9号NAC转录因子基因GmSTl鲁豆11 PCR检测图，其中泳道M为Marker，泳道阳性对照为阳性质粒对照；泳道阴性对照为阴性植株对照；泳道4、9、12均为转GmSTl基因阳性植株。图11为转基因圣豆9号NAC转录因子基因GmSTl鲁豆11 Southern-Blot分析图，其中泳道M为Marker，泳道+为阳性质粒对照；泳道-为阴性植株对照；泳道1、2、3均为转GmSTl基因阳性植株。图12为转基因的大豆中抗盐性的分析。
具体实施例方式实施例UGmSTl的克隆
I. I圣豆9号总RNA的提取(I)将圣豆9号植物材料放入研钵中，利用液氮将其研磨成粉末(直接应用于下面的实验或者冻于-80°C超低温冰箱保存备用)；(2)等液氮挥发后，立即将100_200mg植物粉末转入到I. 5ml离心管中，然后迅速的加入Iml Trizol提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温放置5min ；(3) 4°C，12，OOOrpm,离心lOmin，将O. 9ml上清液转移到新的I. 5ml离心管中，再加入O. 2ml氯仿剧烈振荡混勻15sec,室温放置2_5min ；(4) 4°C，12，OOOrpm,离心lOmin，将O. 4ml上清液转移到新的I. 5ml离心管中，再加入O. 4mI异丙醇,上下翻转15次混勻溶液,室温放置15mim ；(5)4°C, 12，OOOrpm,离心lOmin,弃上清，用Iml 75%的乙醇洗漆沉淀两次,4°C, 8, OOOrpm,离心 5min ；(6)弃上清，开盖于超净工作台中上干燥RNA约2_5min，加入40 μ I RNase-Free水，在60°C中充分溶解RNA IOmin ；(7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A26(l/A28(l达到I. 7-2. O为佳；琼脂糖凝胶电泳检测的质量。I. 2 RNA的反转录(I)向离心管中依次加入下列物质(40 μ I反应体系):
权利要求
1.ー种大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmSTl，其特征在于所述基因GmSTl的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。
2.ー种含有权利要求I所述大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmSTl的植物表达载体PK2GW7: =GmSTl，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
3.ー种含有权利要求I所述大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmSTl的植物表达载体PB2GW7: =GmSTl，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示。
4.权利要求I所述大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmSTl在提高植株抗盐/耐旱性中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述植株是大豆或拟南芥。
全文摘要
本发明公开了一种大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmST1及所述基因GmST1的植物表达载体。本发明还公开了所述基因GmST1在拟南芥和大豆植株中提高其抗盐/耐旱性的应用。实验证明，本发明所述转基因植株比非转基因植株的抗盐/耐旱能力得到了很大程度的提高，为通过基因工程手段提高作物抗盐/耐旱性提供了理论依据和实践基础。可广泛用于培育抗盐/耐旱的植物品种。
文档编号C12N15/84GK102660554SQ20121012827
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月27日 优先权日2012年4月27日
发明者向凤宁, 姬丹丹, 李朔 申请人:山东大学