专利名称：一种基于分裂锁式探针的多重rca方法
技术领域：
本发明涉及一种分子探针的RCA方法，具体说是一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法。
背景技术：
锁式探针(padlock probes)也称为环式寡核苷酸 探针(circularizingoligonucleotide probes, OCP),是一种能满足生命科学需要的敏感、准确、特异的分子诊断方法。滚环放大扩增(rolling circle amplification, RCA)是模仿卩遼菌体感染细菌后进行自我复制形式的一种扩增方法，这种复制形式可在恒温下对环状单链DNA进行相对无限单链扩增。在一定条件下，我们利用锁式探针形成的环状单链DNA，对其进行滚环复制，从而实现在恒温条件下的核酸扩增。近年来在一些基因检测技术研究中被广泛采用，并将与之有关的技术统称为滚环放大技术。核酸连接检测(Oligo ligation assay, 0LA)用于点突变和SNP (单核苷酸多态性)的检测，其特异性是由连接酶的高特异性决定的。当检测的DNA或者RNA样本中含有与两条相邻的直链探针(即探针两端的检测臂)互补的靶序列时(突变靶点即在两段探针相邻处，突变靶点互补碱基位于等位特异性探针3'上)，T4连接酶或E. coli连接酶在37°C恒温条件下可将杂交在DNA或者RNA样本上相邻的两条探针间的切口连接起来。然后利用线性RCA的放大作用，将这一点突变的特异信号扩增放大，然后通过生物传感器(表面等离子体共振传感器)等检测手段进行突变位点的无标记检测。滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)是一种恒温的核酸扩增方法。是模拟噬菌体感染细菌后进行自我复制普遍采取的一种形式，因为滚环复制的模板必须是封闭的单链环状DNA，我们将这种特性用于单核苷酸的检测研究中，与核酸连接检测(OLA)和生物传感器相结合，在具有链置换活性的DNA多聚酶(phi29DNA polymerase)作用下，将滚环的无限复制作为一种信号放大系统。目前常用的点突变检测技术主要有序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)法，该方法是针对等位基因设计特异性引物，仅扩增突变基因而不扩增其他等位基因，扩增产物仍需凝胶电泳检测以判断有无扩增，或者荧光等标记以判断扩增。对引物设计要求较高，多位点要设计多重引物，需要对不同反应进行条件优化；对空气中DNA气溶胶污染比较敏感，易造成假阳性或假阴性；对少量样品的多位点分型特别是低频率位点的特异性较低。单链构象多态性(SSCP)，该方法是基于相同长度的单链DNA碱基顺序或单碱基差异所形成的空间构想不同，导致凝胶电泳速度不同以检测。缺陷需PCR扩增后电泳，对仪器条件要求较高；不能检测变异的位置；随0嫩片段长度增加，检测的敏感性降低；假阴性高；对八丁检出率无CG好，有局限性。限制性片段长度多态性(RFLP)，该方法是需要和PCR技术联合应用(PCR扩增目的基因一限制性内切酶酶切目的基因片段一电泳分离)。缺陷序列多态性座位中大约只有1/3的碱基涉及限制酶识别序列，对多位点检测的范围有限；限制酶消化条件较高，步骤繁琐。测序技术(sequencing)该方法是多重PCR扩增含有检测位点的区域一分离PCR产物并变性为单链座位延伸反应的模板进行单链延伸一电泳分离延伸产物或者通过荧光等标记方法检测。缺陷成本较高，耗时较长。
发明内容
本发明提供了一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法，该方法是综合锁式探针技术和滚环复制的原理发明的一种新型的检测特定DNA序列的方法。使用该方法检测特定的DNA序列不需要设计特定的引物，通用引物即可实现扩增，反应过程不需要反复的升温降温，操作方便，特异性强，其扩增产物含有设计好的标签探针序列，可直接采用基因芯片进行检测。本发明中的新型分裂锁式探针(cleavable padlock probes, c-PLPs)长约IOObp,其结构如图I，包括4个部分I)检测臂探针的5'端和3'端为检测臂，检测臂与靶序列完全互补，只有当与靶序列完全碱基互补结合时，才可在连接酶作用下使探针两端连接环化；2)通用引物区探针的引物结合区为滚环扩增的通用引物区，实现混合靶序列的多重滚环扩增；3)酶切区域探针右侧的酶切区域包含一个硫代磷酸化的HhaI内切酶位点，生成的单链产物携带该位点，将在扩增的同时被HhaI内切酶切成与环状探针相同大小的单链DNA片段产物，而探针本身由于硫代磷酸化的保护而不会被酶切，从而始终作为模板进行复制；4)特异性标签序列探针左侧的标签序列区使RCA单链DNA产物带有各自的特异性标签序列，可与芯片表面固定的互补标签序列探针特异性碱基互补结合，实现多重扩增产物的特异性检测，部分特异性标签序列如序列表序列I-序列表序列9，其特性参数如表 Io表I特异性标签序列特性参数表
标签序列j溶解温度(Tm值;V)G+C含量(GC%)
序列表序列I63.660
序列表序列261.960
序列表序列362.960
序列表序列460.460
序列表序列558. I60
序列表序列660.660
序列表序列766. I60
权利要求
1.一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法，其特征在于具体操作步骤为步骤一、连接反应将靶序列DNA片段与终浓度为O. I μ mol/L的四种分裂锁式探针混合煮沸变性后，立即置于冰上冷却5min，升温至37°C，杂交15min，加入2. 5U的T4DNA连接酶和IyL的T4DNA连接酶缓冲液，去离子水补足IOuL反应体系，连接反应时间45min，再加入IOUexonuclease I和lOUexonuclease III，37°C,反应15min,制备出含有环状模板的连接产物；其中 T4DNA连接酶缓冲液的成份为 40mmol/L Tris-HCL, IOmmoI/L MgCL2, IOmmoI/L DTT和 O. 5mmol/L ATP ； 步骤二、滚环扩增反应反应取步骤一制得的混合连接产物IOyL,与通用引物，其碱基序列如序列表序列10，混合煮沸变性后，分别加入摩尔浓度为的10mmOl/LdNTP2l·! L，phi29DNA 聚合酶 10U, HhaI 限制性内切酶 IOU 和由 33mmol/Ltris-AcU0mmol/LMgAC2,6mmol/LKAC和O. I μ g/ μ LBSA组成的缓冲液2 μ L，去离子水补足20uLRCA反应体系，温度37°C，反应时间60min ； 步骤三、RCA单链DNA产物检测RCA反应结束后，取反应产物采用1%琼脂糖凝胶电泳、RCA单链产物测序、荧光定量RCA扩增或表面等离子体共振生物传感器检测方法中的一种方法进行检测。
2.如权利要求I所述的一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法，其特征在于所述的分裂锁式探针，包括以下4个部分 1)检测臂探针的5'端和3'端为检测臂，检测臂与靶序列完全互补，只有当与靶序列完全碱基互补结合时，才可在连接酶作用下使探针两端连接环化； 2)通用引物区探针的引物结合区为滚环扩增的通用引物区，实现混合靶序列的多重滚环扩增； 3)酶切区域探针右侧的酶切区域包含一个硫代磷酸化的HhaI限制性内切酶位点，生成的单链产物携带该位点，将在扩增的同时被HhaI限制性内切酶切成与环状探针相同大小的单链DNA片段产物，而探针本身由于硫代磷酸化的保护而不会被酶切，从而始终作为模板进行复制； 4)特异性标签序列探针左侧的标签序列区使RCA单链DNA产物带有各自的特异性标签序列，可与芯片表面固定的互补标签序列探针特异性碱基互补结合，实现多重扩增产物的特异性检测。
全文摘要
一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法，新型分裂锁式探针长约90bp左右，包括4个部分，即检测臂、通用引物区、的HhaI内切酶位点、标签序列区；其扩增系统由连接体系和RCA体系两部分组成，具体检测方法为，首先进行连接反应将靶序列DNA片段与终浓度为1mol/L的四种分裂锁式探针混合，煮沸变性后杂交15min，加入T4DNA连接酶和T4DNA连接酶缓冲液，补足10uL反应体系，37℃，45min，exonucleaseI和exonuclease III外切，制备出环状模板，然后RCA反应将10μL连接产物和通用引物混合煮沸变性后，分别加入dNTP，phi29DNA聚合酶和HhaI限制性内切酶和缓冲液，共20μL反应体系，置于37℃，60min；最后对携带特异性标签序列的RCA单链DNA产物检测，根据结果得出相应的实验结论。
文档编号C12Q1/68GK102719550SQ201210237758
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者向阳, 府伟灵, 黄庆 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院