专利名称：一种基于微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法
技术领域：
本发明涉及将微流控芯片技术应用到实时监测的细胞生物学研究的技术领域，具体涉及一种基于微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法。
背景技术：
细胞生物学发展至今,主要的培养和研究依赖于是孔板和商品化的transwell小室，集中观察单一或者多种因素刺激下细胞形态变化、生长过程、迁移和增值行为等。而在众多的细胞行为研究中，细胞迁移作为生物体发育和形态建成等重要生命过程的基础，而备受关注。细胞迁移一般起始于细胞对其微环境刺激的感应，微环境刺激通过细胞表面受体激活一系列的胞内信号转导通路与基因转录，并进而通过细胞极性的改变、细胞的粘附及去粘附、细胞骨架的重排等多个环节，最终完成细胞形态和位置的改变。对于肿瘤细胞而言，其迁移过程与肿瘤转移密切相关，肿瘤转移是一个多步骤连续性很强的主动过程，可分 为以下几个步骤，即局部浸润、渗入血管、随血液循环系统转移并在其中存活、肿瘤细胞外渗移出血管、在新的部位定居并增殖。肿瘤细胞迁移涉及到肿瘤细胞从二维的血管微环境进入周围三维微组织的过程，也是肿瘤转移发生过程决速步的过程。孔板或者transwell小室很难在体外构建二维平面到三维空间的界面转换，所以想模拟和重现上述肿瘤细胞迁移过程是比较困难的。微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代细胞研究的重要平台。它对于实验结果能够实时追踪，不仅能够获得最终结果，也可以得到细胞迁移过程中出现的暂时性信息，为肿瘤细胞迁移过程提供常规分析中有可能缺失的重要生物学信息。而目前，利用微流控芯片进行肿瘤细胞迁移动力学过程监测，尤其是肿瘤细胞从二维平面迁移运动到三维基质过程的研究分析还处于空白阶段。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法，特别针对肿瘤细胞从二维平面迁移运动到三维基质中的过程，该方法具有对细胞运动实时追踪的特点，同时能够实现对细胞运动之初的准确定位。本发明提供了一种微流控芯片，该微流控芯片主要由细胞入口池(1)，胶原入口池(2 )，废液池(3 )，细胞培养室(4 )，细胞迁移室(5 )组成；细胞培养室(5 )上连细胞入口池(I )，细胞培养室(5)下连废液池(3)，一个细胞培养室横向与三个细胞迁移室相连。本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃。本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片的上下两层分别进行紫外过夜照射的灭菌处理，然后等离子体处理30-45S进行封接。
本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成(I)、(3)、(4)高度约为(2)和(5)高度的三倍；其中，(I)、(3)、(4)高度为210 iim，(2)和(5)高度为70 u m0本发明还提供了一种基于所述的微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法，方法过程如下(I)芯片胶原灌注用移液器将配制好的胶原工作液加入胶原入口池，每孔0. 4 i! L ;加ImLPBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育30min，促使胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶，凝胶过程结束后，从细胞入口池、胶原入口池分别顺序加入新鲜的细胞培养液；(2)芯片细胞接种及培养
细胞消化后，调整细胞密度为I X 106/mL,取10 ii L细胞悬液加入细胞入口池，并迅速从废液池吸走0. 5 ii L细胞培养液，促使细胞在重力流的作用下快速、均匀地进入细胞培养室；当在光学显微镜下观察到已经有部分细胞流入废液池，而细胞培养室中的细胞也均匀分布时，立即将芯片竖立，并移入37°C培养箱中放置。竖立方向为细胞培养室朝上，而细胞迁移室朝下；竖立放置IOmin后，取出观察，如果细胞紧贴在细胞培养室与迁移室的交汇处，说明细胞接种比较成功；将芯片放平移入37°C培养箱中继续培养、每隔24h换液一次，并拍照记录肿瘤细胞所在位置；(3)芯片细胞迁移实时监测采用活细胞工作站CO2显微载物台培养箱进行细胞长期观察，开启仪器，同时打开空气、二氧化碳气瓶，调节阀门，保持气体保持在刻度值0. 8，0. 04，两种空气在此比例下，可以保证载物台培养箱内5%的CO2浓度，调节其温度在37°C，仪器稳定30min左右，将固定芯片的培养皿放入载物台培养箱，调节焦距及拍摄参数，每隔60min拍照一张，实时记录细胞运动位置及形态改变；细胞迁移入13父原后蛋白表达检测肿瘤细胞接种到芯片上，培养3天后，进行细胞免疫荧光染色，具体步骤如下多聚甲醛固定，缓冲液冲洗；致孔剂作用，缓冲液冲洗；封闭血清作用，一抗4°C过夜孵育，缓冲液冲洗；二抗常温孵育，缓冲液冲洗后，加入细胞核标记染料，荧光显微镜下拍照，记录细胞内检测蛋白的表达情况。本发明提供的基于微流控芯片技术的肿瘤细胞迁移动力学监测方法，所述胶原为I型鼠尾胶原，常温下它是呈粘稠状的液体，当pH=7，温度达到37°C的情况下，孵育30min，即可呈现果冻状的凝胶。本发明提供的基于微流控芯片技术的肿瘤细胞迁移动力学监测方法，可采用生物学上常用的细胞检测手段对迁移运动到胶原中的细胞进行检测，包括细胞死活标记染色、细胞免疫荧光染色、PCR检测、蛋白质检测等。
图I本发明微流控芯片整体结构示意图；其中，黑色区域的芯片高度为65i!m，灰色区域的芯片高度为200 iim;图2微流控芯片胶原加入后形成的二维平面与三维基质的清晰界面；
图3芯片细胞接种后竖立IOmin时的细胞贴附情况；图4不同浓度的胶原在37 °C培养箱中孵育30min后的凝结情况；图5 HepG-2细胞在不同浓度胶原中迁移面积与培养时间的关系图；图6 HepG-2细胞迁移进入2. 5mg/mL浓度的胶原前后形态变化，Ca) 二维平面培养；(b)三维2. 5mg/mL浓 度的胶原中；图7 HepG-2细胞迁移进入胶原前后细胞比例的统计分析；图8 SMMC-7721细胞加入芯片后24h开始的实时监测分析；图9 SMMC-7721细胞迁移面积与培养时间的关系；图10加入松弛素D后SMMC-7721细胞迁移行为变化情况；图11加入松弛素D后SMMC-7721细胞迁移面积与培养时间的关系；图12 SMMC-7721细胞内F-actin表达情况，(a)明场对照图片，与下面荧光图片相对应；(b) 二维平面培养；(c)三维2. 5mg/mL浓度的胶原中。箭头标识处显示F-actin的清晰表达。
具体实施例方式下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。实施例IHepG-2细胞在不同浓度的胶原中的细胞迁移运动情况配制三种不同浓度的胶原工作液，浓度分别为lmg/mL,2. 5mg/mL, 5mg/mL,不同浓度胶原的胶丝分布如图4所示。利用实验室自行设计并制作的微流控芯片，构型如图I所示。将胶原灌注到芯片孵育30min后，可以看到胶原与二维平面的清晰界面(图2)。从细胞入口池加入10 ii LI X 106/mL HepG-2细胞悬液，竖立芯片lOmin，使细胞贴附在胶原一侧，如图3所示。拍照记录细胞初始位置,每隔24h换液一次,并拍照记录细胞移动情况。统计HepG-2细胞迁移进入胶原中的面积，可以发现随着胶原浓度的升高，HepG-2细胞侵入胶原的面积逐渐减小，其结果如图5所示。同时H印G-2细胞的形态在2. 5mg/mL胶原中发生明显改变，细胞由铺路石样逐渐变为细长的间质样形态，结果如图6所示。细胞比例的数据统计分析见图7所示。实施例2SMMC-7721在2. 5mg/mL胶原中迁移运动实时监测利用实验室自行设计并制作的微流控芯片，构型如图I所示。将2. 5mg/mL的胶原灌注到芯片凝结后，采用与实例I相同的细胞接种和培养方式。细胞接种到芯片24h后，将固定芯片的培养皿放入载物台培养箱。调节焦距及拍摄参数，每隔60min拍照一张，显微镜拍照实时记录细胞运动位置及形态改变，共拍摄19h,拍摄结果如图8所示。实施例3加入松弛素D后，SMMC-7721在2. 5mg/mL胶原中迁移运动分析。利用实验室自行设计并制作的微流控芯片，构型如图I所示。将2.5mg/mL的胶原灌注到芯片凝结后，采用与实例I相同的细胞接种和培养方式。SMMC-7721细胞迁移到胶原中的面积与培养时间的关系见图9所示。当细胞接种到芯片24h后，培养液中加入I ii g/mL松弛素D刺激细胞,记录细胞在松弛素D作用24h的形态变化及迁移行为，结果如图10所示，SMMC-7721细胞迁移面积与培养时间的关系见图11所示。实施例4SMMC-7721细胞迁移入胶原后F-actin的表达检测SMMC-7721细胞接种到芯片上，培养3天后，进行细胞免疫荧光染色，监测蛋白为肌动蛋白F-actin。方法如下4%多聚甲醛进行细胞固定，PBS缓冲液冲洗三次，每次IOmin ；0. 1% triton X-100致孔剂作用lOmin, PBS缓冲液冲洗三次，每次IOmin ;山羊封闭血清作用lh，一抗(兔抗人F-actin) I :100稀释，4°C过夜孵育，PBS缓冲液冲洗三次，每次IOmin ;二抗(FITC标记的山羊抗兔IgG) 1:100稀释，常温孵育lh，PBS缓冲液冲洗三次，每次IOmin ;冲洗完毕后加入1:2000稀释的DAPI工作液，荧光显微镜下拍照，记录细胞内 F-actin的表达情况，结果如图12所示。SMMC-7721迁移进入胶原后伴随着F-actin表达的升高，说明其运动能力在一定程度上得到提高。
权利要求
1.一种微流控芯片，其特征在于该微流控芯片主要由细胞入口池(1)，胶原入口池(2)，废液池(3)，细胞培养室(4)，细胞迁移室(5)组成；细胞培养室(5)上连细胞入口池(I )，细胞培养室(5)下连废液池(3)，一个细胞培养室横向与三个细胞迁移室相连。
2.按照权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃。
3.按照权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片的上下两层分别进行紫外过夜照射的灭菌处理，然后等离子体处理30-45S进行封接。
4.按照权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，(I)、(3)、(4)高度约为(2)和(5)高度的三倍。
5.按照权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于所述(1)、(3)、(4)高度为210i!m，(2)和(5)高度为70 Um0
6.一种基于权利要求I所述的微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法，其特征在于方法过程如下 (1)芯片胶原灌注 用移液器将配制好的胶原工作液加入胶原入口池，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育一段时间，促使胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶，凝胶过程结束后，从细胞入口池、胶原入口池分别顺序加入新鲜的细胞培养液； (2)芯片细胞接种及培养 细胞消化后，调整合适的细胞密度，取10 ii L细胞悬液加入细胞入口池，并迅速从废液池吸走0. 5-2 u L细胞培养液，促使细胞在重力流的作用下快速、均匀地进入细胞培养室；当在光学显微镜下观察到已经有部分细胞流入废液池，而细胞培养室中的细胞也均匀分布时，立即将芯片竖立，并移入二氧化碳培养箱中放置；竖立方向为细胞培养室朝上，而细胞迁移室朝下；竖立放置5-20min后，取出观察，如果细胞紧贴在细胞培养室与迁移室的交汇处，说明细胞接种比较成功；将芯片放平移入培养箱中继续培养、隔24h换液一次，并拍照记录肿瘤细胞所在位置； (3)芯片细胞迁移实时监测 采用活细胞工作站CO2显微载物台培养箱进行细胞长期观察，开启仪器，同时打开空气、二氧化碳气瓶，调节阀门，保证载物台培养箱内5%的CO2浓度，调节其温度在37°C，仪器稳定后，将固定芯片的培养皿放入载物台培养箱，调节焦距及拍摄参数，每隔一定时间拍照一张，实时记录细胞运动位置及形态改变；细胞迁移入胶原后蛋白表达检测。
7.按照权利要求6所述的基于微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法，其特征在于,芯片胶原灌注时,胶原工作液加入胶原入口池,每孔0.4 ii L ;之后再加ImL PBS缓冲液于培养皿中。
8.按照权利要求6所述的基于微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法，其特征在于，芯片细胞接种及培养时，所述细胞密度为lX106/mL。
9.按照权利要求6所述的基于微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法，其特征在于，芯片细胞迁移实时监测时，细胞实时监测每隔5-60min拍照一张，具体时间可依据细胞行为改变进行调整。
10.按照权利要求6所述的基于微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法，其特征在于，所述的蛋白表达检测的方 法为细胞死活标记染色、细胞免疫荧光染色、PCR检测、蛋白质检测。
全文摘要
一种基于微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法，特别针对肿瘤细胞从二维平面迁移运动到三维基质中的过程，该微流控芯片主要由细胞入口池(1)，胶原入口池(2)，废液池(3)，细胞培养室(4)，细胞迁移室(5)组成；细胞培养室(5)上连细胞入口池(1)，细胞培养室(5)下连废液池(3)，一个细胞培养室横向与三个细胞迁移室相连；基于该微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法具有对细胞运动实时追踪的特点，同时能够实现对细胞运动之初的准确定位。
文档编号C12M1/34GK102746986SQ201210243148
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月13日 优先权日2012年7月13日
发明者秦建华, 许慧, 马慧朋, 高兴华 申请人:中国科学院大连化学物理研究所