以鸭病毒性肠炎病毒疫苗株为载体的重组病毒疫苗在鸡形目禽类中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种活病毒载体鸭病毒性肠炎病毒(DEV)弱毒疫苗载体在鸡形目禽类中的应用，所述DEV弱毒疫苗载体可以用于表达鸡形目禽类病原的相关基因，并能携带外源基因在鸡形目禽类中表达，在免疫动物体内诱导良好的针对此病原的保护。本发明通过表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株(其保藏编号为CCTCC?V201125，命名为rDEVus78Ha-Re6)和表达新城疫病毒F基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株(其保藏编号为CCTCC?V201220，命名为rDEV?F)在鸡中的应用证明了DEV弱毒疫苗株载体的以上特性。
【专利说明】以鸭病毒性肠炎病毒疫苗株为载体的重组病毒疫苗在鸡形
目禽类中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于重组病毒疫苗领域，更具体地属于重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗领域。本发明提供一种可以在鸡形目禽类中使用的活病毒载体，即鸭病毒性肠炎病毒(DEV)弱毒疫苗株载体，其可以表达鸡形目禽类病原的相关基因，并能携带此外源基因在鸡形目禽类中表达，在免疫动物体内诱导良好的针对此病原的保护。本研究分别以表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株(其保藏编号为CCTCC V201125，命名为rDEVus78Ha-Re6)和表达新城疫病毒F基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株(其保藏编号为CCTCC V201220，命名为rDEV F)为模式病毒，证明了 DEV弱毒疫苗株的以上特性。
【背景技术】
[0002]鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV),又称鸭病毒性肠炎病毒。能引起鸭、鹅和其它雁形目禽类发生急性 、热性、败血性为特征的烈性传染病。但对DEV的研究相对于其它疱疫病毒而言相对比较少。故第八次国际病毒学分类委员会报告将其分类为疱疫病毒[1]，而未能进一步将其进行分类。2009年，Li等报道了 DEV疫苗株全基因组的测序和分析结果，其基因组大小约为158Kb，约编码78个蛋白。通过对DEV疫苗株基因组基因构成及结构分析，DEV被认为是α疱疹病亚科中的中间型病毒，与水痘病毒属成员更为相近[2]。而同为禽类疱疫病毒的马立克病毒(MDV)和火鸡疱疫病毒(HTV)属于马立克病毒属,鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鹦鹉疱疹病毒(PsHV)为传染性喉气管炎病毒属。
[0003]目前，我国使用的DEV弱毒疫苗株是上世纪60年代在鸡胚联系传代研制成功。只用于预防鸭等雁形目禽类DEV。使用广泛，安全有效[3]。至今未见有报道其可作为活病毒载体表达鸡等鸡形目禽类传染病病源保护性抗原，并可用于预防鸡形目禽类传染病。
[0004]自上世纪80年代成功利用痘苗病毒为载体表达单纯疱疹病毒的TK基因以来，人们开始尝试用各种不同DNA病毒为载体，表达不同外源基因，并将构建的重组疫苗用于人和各种不同动物疾病的预防。大量的研究结果表明，疱疹病毒因其基因组大，可供外源基因插入或替代的非必需基因多，被认为是一种良好的构建重组活疫苗的病毒载体。截止目前，已有大量的相关研究报道。在常见畜禽疱疹病毒疾病中，如以伪狂犬病毒(PRV)为载体，分别在gD、gE、gG和TK等基因中插入CSF的E2等外源基因，并用其免疫猪，取得了良好的免疫效果&11]。用在鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的ULO和UL50中分别插入不同HA基因构建成功的重组病毒免疫鸡，均效果良好[12,]。同样,Sakaguchi M(1993 ；1994)和SonodaK (1996)等分别在MDVl的US10、US3、IRL中插入Lac Z基因，用其免疫I日龄无特定病原鸡(SPF鸡)，I周后用vMDV、vvMDV攻毒，其对SPF鸡的保护效率为80~100% [15_17];在MDVl的USlO中插入NDV F基因、在US2中插入IBDV VP2基因的重组病毒对MDV强毒的保护效率与对照MDVl相当[18’19] ；Tsukamoto K等(2002)以Pec作为传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因的启动子插入火鸡疱疹病毒(HVT)的UL45和UL46基因之间成功构建重组病毒，用其免疫的SPF鸡足以抵抗IBDV强毒的攻击[2°]。[0005]本研究室在前期研究中，在鸭病毒性肠炎病毒的基因组中鉴定出可供外源基因稳定插入的复制非必需区。在此基础之上，本研究将目前中国用于禽流感预防的疫苗株血凝素(HA)基因插入DEV基因组的US7和US8基因之间，用其免疫无特定病原鸭(SPF鸭)能使SPF鸭产生良好的对抗流感的抗体[21]。进一步研究发现，用其免疫鸡，可以诱导良好的HI抗体。攻毒试验表明，免疫后两周，免疫鸡均完全保护。证明DEV弱毒疫苗株能在鸡体内进行一过性复制，并能携带外源基因并表达，使外源蛋白诱导良好的抗体。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种可以在鸡形目禽类中使用的活病毒载体，即DEV弱毒疫苗株载体，其可以表达鸡形目禽类病原的相关基因，并能携带此外源基因在鸡形目禽类中表达，在免疫动物体内诱导良好的针对此病原的保护。本发明分别通过表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株(其保藏编号为CCTCC V201125(命名为rDEVus78Ha-Re6)和表达新城疫病毒F基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株(其保藏编号为CCTCC V201220，命名为rDEV F)在鸡中的应用证明了 DEV弱毒疫苗株载体的以上特性。
[0007]具体地，本发明人利用重组克隆技术，分别将包含禽流感病毒血凝素(HA)基因和SV40启动子序列的基因片段SV40-HA(SEQ ID NO:1)，和包含新城疫病毒F基因和SV40启动子序列的基因片段SV40-F(SEQ ID NO:2)插入到DEV的US7和US8基因之间的间隔区(US7和US8基因之间的间隔区的核苷酸序列见SEQ ID NO:6)中，分别构建获得在US7和US8基因之间插入SV40-HA表达框的粘粒pF0S5us78 SV40 HA,和插入SV40-F表达框架的 粘粒pF0S5us78 SV40 F。并拯救获得表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201125，命名为rDEVus78Ha_Re6 (该重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株已于2011年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学))；和表达新城疫病毒F基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201220，命名为rDEVF(于2012年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学，邮编:430072))。表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCCV201125已于2011年9月26日申请专利，申请号为201110286743.6，其中详细描述了表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的构建方法，并证明了该重组疫苗株能够有效地预防由鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒在鸭、鹅和其它雁形目禽类中引起的传染病。表达新城疫病毒F基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201220的构建方法参见下述实施例4。
[0008]按本领域现有技术的理解，DEV弱毒疫苗株载体是构建在包括鸭鹅的雁形目禽类中有预防活性的重组病毒疫苗株的广泛应用的病毒载体，由于雁形目与鸡形目之间的物种差异，目前还没有人将DEV弱毒疫苗株载体用于构建在鸡形目中有预防活性的重组病毒疫苗株。然而，本发明人在关于表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的后续研究中令人惊讶地发现上述由DEV弱毒疫苗株载体构建的表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株在鸡形目禽类中也具有有效活性。在此基础上，本发明人进一步研究发现鸭肠炎病毒(DEV)弱毒疫苗株载体也可以用于构建能够预防鸡形目禽类疾病的重组病毒疫苗株，进而完成了本发明。同时，发明人进一步构建了表达新城疫病毒F基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株rDEV F，并在鸡中进行了系统评价，进一步证明DEV弱毒疫苗株载体可用于构建在鸡形目中有预防活性的重组病毒疫苗株。
[0009]在本发明的一个实施方案中，本发明提供鸭病毒性肠炎病毒（DEV)弱毒疫苗株 载体用于构建能够预防鸡形目禽类疾病的重组病毒疫苗株的应用，该鸭病毒性肠炎病毒 (DEV)弱毒疫苗株载体可以表达鸡形目禽类病原的相关基因，并能携带外源基因在鸡形目 禽类中表达，在免疫动物体内诱导良好的针对此病原的保护。其中所述鸭病毒性肠炎病毒 弱毒疫苗株可以是CVCC AV1222。外源鸡形目病原基因一般插入到鸭病毒性肠炎病毒（DEV) 弱毒疫苗株载体的US7和US8基因之间的间隔区，本领域技术人员可以根据现有技术和经 验选择适当的插入位点，利用鸭病毒性肠炎病毒弱毒疫苗株构建重组病毒的方法可参见 CCTCC V201125的构建方法（可参见专利申请201110286743. 6)。
[0010]通过检测表达禽流感病毒血凝素（HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株和表 达新城疫病毒F基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株在鸡形目禽类中的预防活性证明鸭 病毒性肠炎病毒疫苗株以上特点。表达禽流感病毒血凝素（HA)基因的重组鸭病毒性肠炎 病毒疫苗株保藏编号为CCTCC V201125，命名为rDEVus78Ha-Re6，其于2011年7月15日保 藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，中国武汉，武汉大学）；表达新城疫病毒F基因的重 组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株保藏编号为CCTCC V201220，命名为rDEV F (于2012年5月24 日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，中国武汉，武汉大学，邮编：430072))。所述表 达禽流感病毒血凝素（HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201125在鸭肠炎 病毒DEV基因组的US7和US8基因之间的间隔区（SEQ ID NO ：6)中插入包含禽流感病毒血 凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段SV40-HA(SEQ ID NO ：1)0所述表达新城疫病 毒F基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201220在鸭肠炎病毒DEV基因组的US7 和US8基因之间的间隔区（SEQ ID N0：6)中插入包含新城疫病毒F基因和SV40启动子序 列的基因片段SV40-F(SEQ ID NO :2)。
[0011]因此，在本发明的另一个实施方案中，本发明提供表达禽流感病毒血凝素HA基因 的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201125在制备用于预防鸡形目禽类中的禽流感疾 病的重组病毒疫苗中的应用。本发明还提供表达新城疫病毒F基因的重组鸭病毒性肠炎病 毒疫苗株CCTCC V201220在制备用于预防鸡形目禽类中的新城疫疾病的重组病毒疫苗中的 应用。
[0012]在本发明的优选实施方案中，除禽流感病毒基因、新城疫病毒基因外，所述鸡形目 禽类的其它病原，包括禽法氏囊病病毒、禽传染性支气管炎病毒等其它可感染鸡形目禽类 的各类疾病病原。例如，可以是禽流感病毒血凝素HA基因，新城疫病毒的F基因或HN基因， 法氏囊病毒的VP2基因等。
[0013]在本发明的一个实施方案中，本发明提供一种可以在鸡形目禽类中使用的活病毒 载体，DEV弱毒疫苗株载体，其可以表达鸡形目禽类病原的相关基因，并能携带此外源基因 在鸡形目禽类中表达，在免疫动物体内诱导良好的针对此病原的保护。通过表达禽流感病 毒血凝素（HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株和表达新城疫病毒F基因的重组鸭病 毒性肠炎病毒疫苗株证明鸭病毒性肠炎病毒疫苗株以上特点。以及用此载体研制新的在鸡 形目禽类中使用的疫苗。本领域技术人员根据所述疫苗的应用目的、进行免疫的禽类等因 素，可以容易地选择适合的药用佐剂、赋形剂等。
[0014]在本发明的优选实施方案中，所述DEV弱毒疫苗株，可用做载体研制新型疫苗在鸡形目禽类中应用，有效用于预防由鸡形目禽类相关病原引起的传染病，例如，有效用于预防法氏囊病毒引起的法氏囊病、由禽流感病毒等引起的禽流感等、新城疫病毒引起的新城疫疾病等。因此，本发明提供下述:
[0015]1.鸭病毒性肠炎病毒弱毒疫苗株用于制备预防鸡形目禽类中疾病的重组病毒疫苗株的应用，其中所述鸭病毒性肠炎病毒弱毒疫苗株用作携带外源性鸡形目禽类病原基因在鸡形目禽类中表达的表达载体。
[0016]2.第I项的应用，其中所述鸭病毒性肠炎病毒弱毒疫苗株是CVCC AV1222。
[0017]3.第I项的应用，其中所述外源性鸡形目禽类病原基因选自禽流感病毒、新城疫病毒、禽法氏囊病病毒、或禽传染性支气管炎病毒等鸡形目禽类常见传染病病原的基因。
[0018]4.第3项的应用，其中所述外源性鸡形目禽类病原基因选自禽流感病毒血凝素HA基因、新城疫病毒的F基因或HN基因、或法氏囊病毒的VP2基因等。
[0019]5.第I项的应用，其中所述鸡形目禽类中的疾病选自由禽流感病毒引起的禽流感、由法氏囊病毒引起的法氏囊病、由新城疫病毒引起的鸡新城疫病、禽传染性支气管炎病毒引起的鸡传染性支气管炎病等。
[0020]6.一种表达新城疫病毒F基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCC V201220。
[0021]7.表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCCV201125在制备用于预防鸡形目禽类中的禽流感疾病的重组病毒疫苗中的应用。
[0022]8.表达新城疫病毒F基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201220在制备用于预防鸡形目禽类中的新城疫疾病的重组病毒疫苗中的应用。 【专利附图】
【附图说明】
[0023]从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中:
[0024]图1:PCClFos 粘粒图谱；
[0025]图2:拯救的病毒dDEV与亲本DEV疫苗株病毒基因组分别用BamH 1.EcoR 1.BbvCI酶切后的脉冲电泳图谱，其中DEV:亲本DEV疫苗株(即用于构建重组病毒的亲本病毒疫苗株)，dDEV:由本发明人构建和筛选的5粘粒系统(参见实施例1-3)拯救出的三株病毒，Ml:低范围PFG分子标记(Low Range PFG Marker) ；M2:DL15000分子标记；M3: λ -Hind III消化分子标记(λ-Hind III digest Marker)；
[0026]图3:pUC ccdB kan 质粒图谱；
[0027]图4:pF0S5 us78 Kan ccdB 粘粒图谱；
[0028]图5:pENTR MCS 质粒图谱；
[0029]图6:pSI HA⑷和pSI F⑶质粒图谱；
[0030]图7:pENTR sv40_ha(A)和 pENTR sv40_F(B)质粒图谱；
[0031]图8:pF0S5us78 SV40 HA(A)和 pF0S5us78 SV40F (B)粘粒图谱；
[0032]图9:鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆拯救重组病毒示意图；
[0033]图10:重组病毒HA基因和F基因在CEF中的表达免疫荧光检测结果图；
[0034]图11:免疫重组病毒后，在SPF鸡体内诱导HI抗体的情况；“^”:rDEVus78Ha-Re6免疫组，“O” =DEV免疫组，“〇” =PBS对照组。[0035]图12:SEQ ID NO:1:SV40_HA表达框架，其中斜体加下划线部分为来自H5N1型禽流感毒株A/duck/Guangdong/S1322/2010 (H5N1)的禽流感血凝素HA基因。
[0036]图13:SEQ ID NO:2:SV40_F表达框架，其中斜体加下划线部分为来自新城疫病毒LaSota毒株F基因。
[0037]序列描述
[0038]SEQ ID NO:1:SV40_HA 表达框架，即包含 A/duck/Guangdong/Sl322/2010 (H5Nl)禽流感病毒血凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段；
[0039]SEQ ID NO:2:SV40_F表达框架，其中斜体加下划线部分为来自新城疫病毒LaSota毒株F基因。[0040]SEQ ID NO:3:“RfA” 基因，其中基因为 aatRl-氯霉素-ccdB_aatR2 ；
[0041]SEQ ID NO:4 =RfKan 基因；
[0042]SEQ ID NO:5:A/duck/Guangdong/S1322/2010 (H5N1)禽流感病毒血凝素HA基因；
[0043]SEQ ID NO:6:US7和US8基因之间的间隔区的核苷酸序列；
[0044]SEQ ID NO:7:来源于新城疫病毒的LaSota毒株的新城疫病毒F基因。
【具体实施方式】
[0045]以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
[0046]实施例1.DEV疫苗株基因组Fosmid文库的构建
[0047]按EPICENTRE 公司“CopyControI Fosmid Library Production Kit，，试剂盒说明书构建DEV基因组的Fosmid文库。
[0048]方法如下:将DEV疫苗株病毒(CVCC AV1222) (GeneBank EU082088)(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，目录编号AV1222 ;购自中国兽医药品监察所)DNA用物理方法即用25号针头(购自上海治宇医疗器械有限公司)抽吸多次进行切断处理，用T4 DNA聚合酶(T4 DNA Polymerase,购自 New England Biolabs)及喊性憐酸酶(Alkaline Phosphatase,购自New England Biolabs)对DNA片段进行末端平滑化及去磷酸化处理,脉冲电泳(用Bio-Rad公司CHEF Mapper?XA Pulsed Field系统进行脉冲电泳，脉冲电泳的条件为:电泳缓冲液为0.5xTBE,琼脂糖胶浓度为I %，程序为2K-80K)，回收38kbp_48kbp之间的DNA片段。将回收后的DEV DNA片断两端用T4连接酶连接上Fse 1-Sbf 1-Pme I接头，精制后连接到pCCl Fos (购自EPICENTRE，图谱见图1)载体上，4°C过夜连接。对混和液进行包装，转染大肠杆菌EPI300-T1 (购自EPICENTRE)。对文库滴度进行确认，其试验过程如下:将包装好的混和液进行10倍梯度稀释，分别取10_2，ιοΛ ?ο-5, ?ο-6四个稀释度的稀释液10 μ I感染100 μ I ΕΡΙ300-Τ1细胞，将此菌涂于含12.5 μ g/ml氯霉素的LB平板，37°C过夜培养，统计菌落数量，并计算其滴度，结果为3.8xl05cfu/lib。即成功构建DEV的fosmid文库。
[0049]实施例2.用于拯救DEV病毒粘粒的选择
[0050]文库构建成功后，挑取286个克隆提取粘粒，用碱裂解法[5]提取粘粒，送大连宝生物公司对插入pCCl Fos中的DEV DNA片段末端进行测序，测序引物序列如下:
[0051]Primer 1:5’ -TAATACGACTCACTATAGGG-3’
[0052]Primer 2:5’ -GCCAAGCTATTTAGGTGAGA-3’[0053]经过末端测序的分析，共得到插入片段两端都连接有完整Fse 1-Sbf 1-Pme I接头的克隆250个。从这250个克隆中选取多组用于拯救DEV的5粘粒组合。其中每组中克隆的DEV DNA片段两端都含有Fse 1-Sbf 1-Pme I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖全DEV
基因组。
[0054]实施例3.病毒拯救
[0055]用Qiagen公司的中量提取试剂盒提取所选择的粘粒的DNA。用Fse 1、Sbf I或Pme I内切酶(均购自New England Biolabs)对所选择的粘粒进行线性化处理,反应条件如下:Sbf I内切酶20U (也可以使用Fse I或Pme I内切酶)，粘粒10 μ g，37°C作用I小时，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀制备转染用DEV DNA。 [0056]参照Reddy SM (2002)的磷酸钙方法将5段DEV DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞(CEF) [22]，经多次重复，其中有3组5粘粒组合转染4-6天后可见CEF出现DEV病毒典型病变，选取重复性较好的一组5粘粒组合进行后续实验。收获此组5粘粒共转染拯救的病毒，命名为dDEV，用此dDEV与亲本DEV病毒(即用于构建该感染性克隆的亲本病毒)分别接种次代CEF。
[0057]CEF的制备方法如下:取9-10日龄SPF鸡胚，用酒精棉球消毒后，用碘酊擦拭气室部位，脱碘后无菌取出鸡胚，放置到盛有Hank’ s液(购自HyClone)的平皿中洗涤，并去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎。用0.25%的胰酶(4mL/胚)在37°C水浴中消化4_5分钟，弃去胰酶，用Hank’s液洗涤2次。加入适量的含血清与双抗(青霉素100u/mL，链霉素IOOmg/mL)的M199营养液(购自HyClone)，吹打使细胞分散，用四层纱布过滤后制成IO6-1O7细胞/毫升的细胞悬液，最后分装于培养转瓶中37°C旋转培养。36-48小时后，按毒种:细胞培养液体积为1: 1000将病毒接种于CEF。待细胞病变达到100%时，收集培养液；4°C 6000g离心10分钟，去除细胞碎片；取上清50000g离心2小时富集病毒；然后经20%和60%蔗糖密度梯度离心，50000g离心2小时，回收20%和60%中间层；之后经50000g离心2小时超速离心脱糖处理获得纯化好的病毒。提取病毒全基因组DNAt23]，分别用BamH 1.EcoR I和BbvC 1(均购自New England Biolabs)对原疫苗株DEV和dDEV进行酶切。反应条件如下:分别取BamH I,EcoR I和BbvC I各20U，分别与DEV基因组DNA 8 μ g混和，于50 μ I体系中37°C作用I小时。用Bio-Rad公司CHEF Mapper(I) XA Pulsed Field系统进行脉冲电泳，脉冲电泳的条件为:电泳缓冲液位0.5x TBE，琼脂糖胶浓度为1%，程序为2K-70K。
[0058]拯获的病毒酶切图谱和亲本病毒相同，如图2所示。说明所选择的5粘粒组成功拯救DEV病毒。本发明人将所选择的5粘粒组成员分别命名为pFOSl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、PF0S5，该5粘粒克隆所包含的DEV DNA片段两端都含有Fse 1-Sbf 1-Pme I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖全DEV基因组(它们的重叠和覆盖模式可参见图9)，并且其中pF0S5包含DEV基因组的US7和US8基因以及它们之间的间隔区(US7和US8基因之间的间隔区的核苷酸序列参见SEQ ID N0:6)。关于该5粘粒系统本发明人已经申请专利，申请号为201010207207.8，题目为“鸭病毒性肠炎病毒疫苗株感染性克隆系统及其构建方法和应用”， 申请日期:为2010年6月13日。
[0059]实施例4.在DEV基因组的US7、US8基因之间的间隔区中分别插入SV40-HA表达框架(SEQ ID NO:1)和SV40-F表达框架(SEQ ID NO:2)的重组突变粘粒的构建
[0060]基于上述实施例1-3结果，在所选择的5粘粒组成员pF0S5中DEV基因组的US7和US8基因之间的间隔区(SEQ ID NO:6)中，具体地，US7和US8基因之间的间隔区共223bp，本研究中，该间隔区缺失了其中第108至111位的四个核苷酸，代之以分别插入SV40-HA和SV40-F表达框架(SV40-HA和SV40-F表达框架的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQID NO:2，其中包含SV40启动子，参见图12和图13，其中斜体加下划线部分分别来源于A/duck/Guangdong/S1322/2010 (H5N1)禽流感病毒血凝素 HA 基因(SEQ ID NO:5))和来源于新城疫病毒的LaSota毒株的新城疫病毒F基因(SEQ ID NO:7)。构建2个重组突变粘粒，分别是pF0S5us78 SV40 HA和pF0S5us78 SV40 F(该突变粘粒的图谱如图8所示，其构建模式可参见图9)。在本研究中，本发明人发现，HA基因的插入位置不影响其对鸭病毒性肠炎病毒的免疫效果。但HA基因插入其他位置，是否会影响其对鸭病毒性肠炎病毒的保护效果需要实验来证明。
[0061]F0S5us78 SV40 HA粘粒的构建过程简述如下:
[0062]4.1 pUC ccdB kan 的构建:
[0063]用表1所示的三对引物(由TaKaRa公司合成)分别对Invitrogen公司GatewayVector Conversion System with One Shot ccdB Survival 2 Tl Competent Cells 试剂盒中提供的“RfA”(其中基因为aatRl-氯霉素-ccdB-aatR2)基因(SEQ ID NO:3)进行多重PCR扩增。
[0064]表1:用于克隆“Rfkan” (其中基因为aatRl-卡那霉素-ccdB_aatR2)基因的PCR
引物
[0065]
【权利要求】
1.鸭病毒性肠炎病毒弱毒疫苗株用于制备预防鸡形目禽类疾病的重组病毒疫苗株的应用，其中所述鸭病毒性肠炎病毒弱毒疫苗株用作携带外源性鸡形目禽类病原基因在鸡形目禽类中表达的表达载体。
2.权利要求1的应用，其中所述鸭病毒性肠炎病毒弱毒疫苗株是CVCCAV1222。
3.权利要求1的应用，其中所述外源性鸡形目禽类病原基因选自禽流感病毒、新城疫病毒、禽法氏囊病病毒、或禽传染性支气管炎病毒等鸡形目禽类常见传染病病原的基因。
4.权利要求3的应用，其中所述外源性鸡形目禽类病原基因选自禽流感病毒血凝素HA基因、新城疫病毒的F基因或HN基因、或法氏囊病毒的VP2基因等。
5.权利要求1的应用，其中所述鸡形目禽类中的疾病选自由禽流感病毒引起的禽流感、由法氏囊病毒引起的法氏囊病、由新城疫病毒引起的鸡新城疫病、禽传染性支气管炎病毒引起的鸡传染性支气管炎病等。
6.一种表达新城疫病毒F基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCCV201220。
7.表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCCV201125在制备用于预防鸡形目禽类中的禽流感疾病的重组病毒疫苗中的应用。
8.表达新城疫病毒F基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCCV201220在制备用于预防鸡形目禽类中的新城疫 疾病的重组病毒疫苗中的应用。
【文档编号】C12R1/93GK103667351SQ201210331405
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月10日 优先权日:2012年9月10日
【发明者】陈化兰, 柳金雄, 步志高, 姜永萍 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所