专利名称：焦磷酸测序法检测oct2基因多态性的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体的是涉及焦磷酸测序法检测0CT2基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
双胍类药物常用的有苯乙双胍(降糖灵)、二甲双胍(降糖片，美迪康，迪化糖锭，格化止等)、丁二胍，是糖尿病病人有效的一线用药。其降糖机制是减少肝脏产生葡萄糖，促进肌肉摄取葡萄糖，增加胰岛素敏感性。有机阳离子转运蛋白(OCT)属于溶质转运家族，主要包括OCTI、0CT2和0CT33个异构体。0CT2多数分布于肾近端小管基底外侧膜，主要负责临床常用药物(如二甲双胍、顺 钼、西咪替丁等)，常见内源性物质(如多巴胺、去甲肾上腺素等)以及一些毒物的转运。0CT2对不同种族人群而言，多态性位点各不相同而且在等位基因频率上也有很大的种族差异，基因多态性导致转运功能升高或降低，进而影响双胍类药物清除速率，从而影响降糖效应。研究显示，0CT2变异降低了肾脏对二甲双胍的清除，使之体内药物浓度升高，从而增强机体对某些药物或毒物的敏感性。0CT2的转运功能是影响双胍类药物代谢动力学特征和毒副反应的关键因素之一，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测0CT2基因多态性的试剂盒将为双胍类等药物的临床个体化治疗起到积极的推动作用。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
本发明旨在提供一种焦磷酸测序法检测0CT2基因(SEQ ID NO. I)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测其底物(如双胍类降糖药物等)个体化用药相关基因SNP。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为一种焦磷酸测序法检测0CT2基因多态性的试剂盒，包括如下引物(I)扩增引物上游引物5'-TCG GAG AAC AGT GGG GAT TTT T-3' (SEQ ID NO. 2)；下游引物5'-AAT TGG GCT CTT TGT GAA ATG-3' (SEQ ID NO. 3)；其中，下游引物的5'进行生物素标记；(2)测序引物5' -TGG TTG CAG TTC ACA G-3/ (SEQ ID NO. 4)；试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。一种应用上述试剂盒检测0CT2基因多态性的方法，包括如下步骤(I) DNA 提取；
(2)聚合酶链反应配制50μ I PCR扩增体系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP I. 5 μ 1，上游引物0·5μ 1，下游引物 0·5μ l，rTaq0.5y 1，水 41μ 1，模板 1·0μ I ;循环程序为95° C 5min 预变性；依次在95° C 30S，50° C 30S，72° C 30S，进行40个循环；72° C保持5min，最终保持在4° C，得扩增产物；(3)焦磷酸测序单链样本纯化；(4)焦磷酸测序及结果分析。本发明的试剂盒对0CT2RS316019 (G>T)目标序列进行分析和检测，该目标序列包括野生型 GGTGGTTGCAGTTCACAGTTGCTCTGCCCAACTTCTTCTTCT (SEQ ID NO. 5)和突变型 GGTGGTTGCAGTTCACAGTTTCTCTGCCCAACTTCTTCTTCT (SEQID NO. 6)。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对0CT2基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上芳香化酶抑制剂个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
图I为本发明0CT2(rs316019)野生型纯合子(GG)焦磷酸测序结果；图2为本发明0CT2(rs316019)突变型杂合子(GT)焦磷酸测序结果；图3为本发明0CT2(rs316019)突变型纯合子(TT)焦磷酸测序结果。
具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I :0CT2-pyroF (上游引物)5' -TCG GAGAAC AGT GGG GAT TTT T-3' (SEQ IDNO. 2)；0CT2-pyroR (下游引物):5' -AAT TGG GCT CTT TGT GAA ATG-3' (SEQID NO. 3)；测序引物5'-TGG TTG CAG TTC ACA G_3' (SEQ ID NO. 4)；I. DNA 提取I. I实验前试剂材料准备与检查工作如下(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾V ； (2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；I. 6 盖上 Eppendorf 管盖，室温孵育 IOmin ；1.713，OOOrpm 室温离心 20 秒；
I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；1.11移取300111^ Nuclei Lysis Solution 入上述Eppendorf 管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13，OOOrpm室温离心3min ；I. 13移取上清转移到新的已灭菌I. 5mL Eppendorf管；
I. 14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；I. 1513, OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；I. 1813, OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；I. 20在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管，吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干；I. 21 目测沉淀大小，加入 50 IOOul DNA Rehydration Solution 至沉淀；I. 22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；I. 24保存核酸标本至4°C冰箱；2.聚合酶链反应2. I在试剂准备区配制50 μ I PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表
IOXPCRbuffer5. Ομ I
dNTPI. 5μ I
0CT2-pyroFO. 5 μ I
0CT2-pyroR (5，-Bio 标记)O. 5μ I
rTaq0. 5 μ I
41. Ομ I
2. 2在标本制备区对盛有gDNA模板短暂离心后添加I. Ομ I至扩增体系中，在PCR管壁上标记标本唯一'丨生标识，管盖上标记检测项目代号。PCR管震荡混勻,桌面离心机上短暂离心；2. 3在扩增区进行PCR扩增反应，按照下面的循环参数设置扩增仪
权利要求
1.一种焦磷酸测序法检测0CT2基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如下引物 (1)扩增引物 上游引物5/ -TCG GAG AAC AGT GGG GAT TTT T-3'； 下游引物5' -AAT TGG GCT CTT TGT GAA ATG-3'； 其中，下游引物的5'进行生物素标记； (2)测序引物5/-TGG TTG CAG TTC ACA G-3'。
2.一种应用权利要求I所述的试剂盒检测0CT2基因多态性的方法，包括如下步骤 (1)DNA 提取； (2)聚合酶链反应 配制 50 μ I PCR 扩增体系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP I. 5 μ 1，上游引物0·5μ 1，下游引物 0·5μ l，rTaq0.5y 1，水 41μ 1，模板 1·0μ I ;循环程序为95° C 5min 预变性；依次在95° C 30S，50° C 30S，72° C 30S，进行40个循环；72° C保持5min，最终保持在4° C，得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测OCT2基因多态性的试剂盒及方法。所述试剂盒OCT2基因多态性进行检查，具体是指rs316019(G>T)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.2—4所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量OCT2基因多态性的检测，从而达到对其底物实现安全合理有效的个体化给药。
文档编号C12Q1/68GK102876783SQ201210338529
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者周宏灏 申请人:周宏灏