专利名称：一种检测活动性肺结核病的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于血清生物学标志物研究，涉及检测活动性肺结核病特异的miRNA的试剂盒，通过一种能鉴定活动性肺结核病特异的miRNA去捕获血清生物学标志物，并用有定量控制的miRNA分析，在血清中检测活动性肺结核病。
背景技术：
肺结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性肺部感染性疾病，是严重威胁人类健康的疾病。中国流行形势十分严峻；现有活动性肺结核病患者约130万例，新发病例145万例/年，每年新发病例占全球人口总数的18%，死亡人数达13万例/年，超过了其他传染病死亡人数的总和。肺结核病的高发病和死亡率，以及通过空气传播,对病人、病人所接触的事物和社会都产生相当大的负担。因此，对肺结核病患者及时早期诊断是控制传染源，遏制肺结核病流行的最重要措施。目前，临床常规应用的诊断方法均有显著缺陷，如痰涂片检测一灵敏度低；结核分支杆菌培养一阳性率低(约30%)且耗时久(长达6-8周);胸部X线检查一无肺结核病特征性改变；PCR检测一假阳性和假阴性均高；结核菌素试验一不能区分结核自然感染和卡介苗接种；血清结核抗体检测一灵敏度和特异性均不理想。因此，迫切需要发现一种特异性强的新的生物学标志物，建立快速、敏感、高效的诊断技术，防止肺结核疾病蔓延。 近年来研究表明，血清中的miRNAs能作为诊断疾病的候选生物学标志物，研究涉及前列腺癌、肝癌、肺癌、大肠直肠癌、乳腺癌、白血病及卵巢癌等多种肿瘤，且血清是方便和容易得到的样品，从血清中寻找疾病生物标志物一直以来是人们研究的热点。由于miRNAs不易在血液中被各种酶降解，并且具有组织和细胞特异性，能够用于疾病分子诊断和疾病预后预测，适合作为疾病的候选生物学标志物。根据疾病生物标志物研究的要求，应用1-2个miRNAs作为疾病标志物，特异性低。同时由于不同患者的个体差异，使得仅用1-2个miRNAs判断疾病显得极不可靠。应该筛选出一组miRNAs,建立miRNAs的组合物可使结果更加可靠。所以，研究活动性肺结核病患者特异的血清miRNAs的组合物，作为生物标志物，对早期诊断肺结核病具有重要的意义。然而，目前尚无肺结核病特异血清miRNAs组合物的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测活动性肺结核病的诊断试剂盒，该试剂盒由RNA提取缓冲液，活动性肺结核病特异的血清miRNA组合物、内参反转录引物、PCR引物以及荧光定量RT-PCR反应液构成，其中活动性肺结核病特异的血清miRNA组合物由4个差异表达的血清 miRNAs 组成hsa_miR-29c、hsa-miR-22、hsa_miR-320b 和 hsa-miR-101。RNA提取缓冲液=QIAzof Lysis Reagent、氯仿、无水乙醇、RffT溶液、RPE溶液和RNAase-free 水。荧光定量RT-PCR反应液包括反转录和荧光定量PCR反应液；反转录反应液总RNA、反转录引物(2 μΜ)、5Χ反应缓冲液、dNTP (10 mM)、RNase抑制剂、反转录酶；荧光定量 PCR 反应液SYBR>re iz 位 Taq (Tli RnaseH Plus) (2X )、PCR 上游引物(10 μ Μ)、PCR 下游引物(10 μ Μ)、ROX Reference Dye (50X )、模板 cDNA 和 ddH20。逆转录引物序列为
hsa-miR-29c :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG-3’ ；hsa-miR-22 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT-3’ ；hsa-miR-320b :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCGTT-3’ ；hsa-miR-101 :5，-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAGT-3，；内参hsa-miR-16 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’。PCR上游引物序列
hsa-miR-29c :5’ -GGCGGTAGCACCATTTGAA-3’ ；hsa-miR-22 :5’ -CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA-3’ ；hsa-miR-320b :5’ -AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCA-3’ ；hsa-miR-101 :5’ -GGGTACTGTGATAACTGAAGG-3’ ；
内参 hsa-miR-16 :5，-CGCGCTAGCAGCACGTAAAT—3，。 PCR 通用的下游引物是5’ -AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。试剂盒的使用方法提取活动性肺结核病患者与健康对照者、肺炎、肺癌和慢性阻塞性肺病患者血清中的总RNA ;应用血清miRNA组合物hsa_miR-29c、hsa-miR-22、hsa-miR-320b和hsa-miR-101的特异反转录引物对样本的总RNA进行反转录得到cDNA ；应用PCR特异引物进行SYBR Green染料荧光定量PCR检测样本中血清miRNA的表达水平；应用MedCalc软件和Logistic逐步回归模型，分析血清组合物hsa-miR-29c、hsa_miR-22、hsa-miR-320b 和 hsa-miR-101 的 ROC 曲线，曲线下面积(AUC)是 O. 911 (P < O. 0001,95%Cl = O. 847-0. 954)，灵敏度为90. 2%、特异性为75. 0%，表明该特异血清miRNAs组合物诊断活动性肺结核病具有较高的准确性。本发明的另一个目的是提供所述的试剂盒在活动性肺结核病血清检测中的应用。本发明试剂盒具有以下优点(I)本发明采用活动性肺结核病的特异血清miRNAs组合，可应用于活动性肺结核病血清的早期检测，为活动性肺结核病的早期诊断提供了新的方法。并为开发miRNAs诊断试剂盒奠定了基础；(2)与以往传统的结核杆菌检测等方法相比，本发明是一种在血清miRNAs水平上的检测，对活动性肺结核病具有早期诊断价值；
(3)本发明对活动性肺结核病检测的灵敏度为90. 2%、特异性为75. 0%，具有较高的准确性。因此本发明可实现对活动性肺结核病的早期预警和早期诊断；(4)本发明血清miRNA的检测技术先进、高通量，组合物的构建方法设计精确、合理可行，为提高活动性肺结核病的早期诊断提供了一种新的评估方法。
图1是活动性肺结核病患者、健康对照者血清中hsa-miR-29c的表达水平。图2是活动性肺结核病患者、肺癌患者、肺炎患者及慢性阻塞性肺病患者血清中hsa-miR-29c的表达水平。图3是活动性肺结核病患者、健康对照者血清中hsa-miR-22的表达水平。
图4是活动性肺结核病患者、肺癌患者、肺炎患者及慢性阻塞性肺病患者血清中hsa-miR-22的表达水平。图5是活动性肺结核病患者、健康对照者血清中hsa-miR-320b的表达水平。图6是活动性肺结核病患者、肺癌患者、肺炎患者及慢性阻塞性肺病患者血清中hsa-miR-320b的表达水平。图7是活动性肺结核病患者、健康对照者血清中hsa-miR-101的表达水平。图8是活动性肺结核病患者、肺癌患者、肺炎患者及慢性阻塞性肺病患者血清中hsa-miR-101的表达水平。图 9 是血清 hsa_miR-29c, hsa-miR-22, hsa_miR-320b 和 hsa-miR-101 组合物诊断活动性肺结核病的ROC曲线。
具体实施例方式本发明将结合附图和具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例1
一种检测活动性肺结核病的诊断试剂盒，该试剂盒有RNA提取缓冲液，活动性肺结核病特异的血清 miRNA 组合物hsa_miR-29c、hsa-miR-22、hsa_miR-320b 和 hsa-miR-101 以及内参的反转录引物和PCR引物，荧光定量RT-PCR反应液。逆转录引物序列为
hsa-miR-29c :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG-3’ ；hsa-miR-22 :5， -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT-3，；hsa-miR-320b :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCGTT-3’ ；hsa-miR-101 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAGT-3’ ；
内参 hsa-miR-16 :5，-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3，。PCR上游引物序列为
hsa-miR-29c :5’ -GGCGGTAGCACCATTTGAA-3’ ；hsa-miR-22 :5’ -CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA-3’ ；hsa-miR-320b :5’ -AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCA-3’ ；hsa-miR-101 :5’ -GGGTACTGTGATAACTGAAGG-3’ ；
内参 hsa-miR-16 :5，-CGCGCTAGCAGCACGTAAAT—3，；
PCR 通用的下游引物序列是5’ -AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。试剂盒的使用方法提取活动性肺结核病患者与健康对照者、肺炎、肺癌和慢性阻塞性肺病患者血清中的总RNA ;应用血清miRNA组合物hsa_miR-29c、hsa-miR-22、hsa-miR-320b和hsa-miR-101的特异反转录引物对样本的总RNA进行反转录得到cDNA ；应用PCR特异引物进行SYBR Green染料荧光定量PCR检测样本中血清miRNA的表达水平；应用MedCalc软件和Logistic逐步回归模型，分析血清组合物hsa-miR-29c、hsa_miR-22、hsa-miR-320b 和 hsa-miR-101 的 ROC 曲线，曲线下面积(AUC)是 O. 911 (P < O. 0001,95%Cl = O. 847-0. 954)，灵敏度为90. 2%、特异性为75. 0%，表明该特异血清miRNAs组合物诊断活动性肺结核病具有较高的准确性。
试剂总RNA提取试剂盒购自Qiagen公司；反转录试剂盒购自Fermentas公司；荧光定量PCR试剂购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。材料96孔板及膜购自Axygen公司。RNA提取缓冲液=QIAzof Lysis Reagent、氯仿、无水乙醇、RffT溶液、RPE溶液和RNAase-free 水。荧光定量RT-PCR反应液包括反转录和荧光定量PCR反应液；反转录反应液总RNA、反转录引物(2 μΜ)、5Χ反应缓冲液、dNTP (10 mM)、RNase抑制剂、反转录酶；荧光定量 PCR 反应液=SYBRtrewiz 位 Taq (Tli RnaseH Plus) (2X )、PCR 上游引物(10 μ Μ)、PCR 下游引物(10 μ M)、ROX Reference Dye (50X )、模板 cDNA 和 ddH20。实施例2 试剂盒应用
检测活动性肺结核病患者、健康对照者、肺癌患者、肺炎患者及慢性阻塞性肺病患者血清中 hsa_miR-29c, hsa-miR-22, hsa_miR-320b 和 hsa-miR-101 的表达水平。样本收集活动性肺结核病患者82例、健康对照者108例,肺癌、肺炎和慢性阻塞性肺病患者各30例。取血清样本中的总RNA :在200 μ L血清样本中加入700 μ L Qiagen裂解液混匀，静置5分钟；加入140 μ L氯仿,剧烈震荡,静置3分钟；12000 rpm, 4°C尚心15分钟后取上清，加入1. 5倍体积的无水乙醇混匀；将上述混合物加到柱子中，8000 rpm离心18秒，弃收集液；加入700 μ L RffT溶液，8000 rpm离心18秒，弃收集液；加入500 μ L RPE溶液，8000rpm离心18秒，弃收集液，重复2次；全速，离心I分钟；加入30-60 μ L RNAase-free水，静置I分钟，8000 rpm离心I分钟。
引物设计
miRNAs反转录引物在通用莖环的3’端加上6个对应miRNAs的成熟序列3’端反向互补的碱基，通用茎环序列5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3’miRNAs反转录引物序列
hsa-miR-29c :5， -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG-3’ ；hsa-miR-22 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGT
T-3’ ；hsa-miR-320b :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCGTT-3’ ；hsa-miR-101 :5，-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAGT-3，；内参hsa-miR-16 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’。PCR上游引物序列
hsa-miR-29c :5’ -GGCGGTAGCACCATTTGAA-3’ ；hsa-miR-22 :5’ -CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA-3J ；hsa-miR-320b :5’ -AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCA-3J ；hsa-miR-101 :5’ -GGGTACTGTGATAACTGAAGG-3J ；
内参 hsa-miR-16 :5，-CGCGCTAGCAGCACGTAAAT—3，。PCR 下游通用弓 I 物序列5，-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3，。反转录反应体系2.5 UL总RNA，0. 5yL反转录引物(2 μΜ)，1.0μ 5X反应缓冲液，O. 5 μ L dNTP( IOmM), O. 25 μ L RNase抑制剂，O. 25 μ L反转录酶，总体积5 μ L。反应条件65°C反应5分钟；冰上放置10分钟；42°C延伸60分钟；70°C灭活15分钟。反应得到的cDNA用于荧光定量PCR检测。荧光定量PCR 反应体系10μ L SYBR Green Μ χ,Ο. 4μ L ROX染料，O. 8 μ L上游引物(10 μ Μ)，O. 8 μ L下游引物(10 μ Μ)，1. O μ L cDNA模板，补ddH20至总体积20 μ L。反应条件95°C预变性30秒；95°C变性5秒，60°C退火延伸31秒，40个循环。数据处理miRNA表达倍数的变化公式为RQ = 2_AAc\ RQ代表相对表达变化量；ΔΔ Ct = (CT miRNA -Ct miR-16)实验组-(CT miRNA_CT miR-16)对照组平均值；实验设立阴性对照和重复实验，阴性对照反应体系中加ddH20，所有荧光定量PCR均做3次重复
统计分析米用 GraphPad Prism 5 软件中 Nonparametric Mann-ffhitney test 进行统计(产< O. 05时，具有显著性差异，产< 0.01时，具有极显著性差异)，差异表达的miRNA数据处理结果以平均值土标准误表示，绘制含误差线的散点图(参见图1-图8)。实施例3活动性肺结核病的特异血清hsa_miR-29c, hsa-miR-22, hsa_miR-320b和hsa-miR-101组合物的建立
运用 MedCalc 软件计算单个血清 hsa_miR-29c, hsa-miR-22, hsa_miR-320b 和hsa-miR-101诊断活动性肺结核病的ROC曲线，包括灵敏度、特异性和曲线下面积(AUC)，结果显示血清 hsa-miR-29c，hsa-miR-22，hsa-miR-320b 和 hsa-miR-101 的 AUC 分别是(λ 723、O. 711,0. 702,0. 706，敏感性分别是 51. 2%,67. 5%,94. 9%,90. 1%，特异性分别是 87. 4%、70. 5,36. 4%,44. 2%。结果说明单个血清miRNA诊断活动性肺结核病敏感性和特异性都不闻。米用Logistic 逐步回归模型计算血清 hsa_miR-29c, hsa-miR-22, hsa_miR-320b和hsa-miR-101组合物诊断活动性肺结核病的ROC曲线，通过数据计算和分析，构建活动性肺结核病特异血清 hsa_miR-29c, hsa-miR-22, hsa-miR-320b 和 hsa-miR-101 组合物的Logistic逐步模型的回归方程Logit(p) = -O. 4975+1. 54103*(hsa_miR-29c)+ 0.35142*(hsa-miR-22)-2· 07802* (hsa_m`iR-320b) _2· 14771* (hsa-miR-101)(表 1)，4 个血清miRNAs组合物诊断活动性肺结核病的ROC曲线，灵敏度为90. 2%、特异性为75. 0%，曲线下面积(AUC)是 O. 911 0° < O. 0001,95% Cl = O. 847-0. 954)，并绘制图形(参见图 9)，比单个血清miRNA，4个血清miRNAs组合物AUC在O. 9以上时，诊断活动性肺结核病具有较高的准确性，同时敏感性高和特异性强。说明血清hsa-miR-29c、hsa-miR-22、hsa_miR-320b和hsa-miR-101组合物可用于制备活动性肺结核病的诊断试剂盒。
权利要求
1.一种检测活动性肺结核病的诊断试剂盒，由RNA提取缓冲液，活动性肺结核病特异的血清miRNA组合物、内参反转录引物和PCR引物以及荧光定量RT-PCR反应液构成，其中活动性肺结核病特异的血清miRNA组合物由4个差异表达的血清miRNAs组成hsa-miR-29c、hsa-miR-22、hsa_miR-320b 和 hsa-miR-101 ;所述的 RNA 提取缓冲液有QIAzol Lysis Reagent、氯仿、无水乙醇、RffT溶液、RPE溶液和RNAase-free水；所述的突光定量RT-PCR反应液，包括反转录和荧光定量PCR反应液；其中反转录反应液有总RNA、2剛反转录引物、5X反应缓冲液、10 mM dNTP、RNase抑制剂、反转录酶；荧光定量PCR反应液有SYBR7￥e iz 位 Taq , Tli RnaseH Plus、PCR 上游引物、PCR 下游引物、ROX ReferenceDye、模板 cDNA 和 ddH20 ； 逆转录引物序列为hsa-miR-29c :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG-3’，hsa-miR-22 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT-3’，hsa-miR-320b :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCGTT-3’，hsa-miR-101 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAGT-3’，内参 hsa-miR-16 :5，-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3，，PCR上游引物序列为hsa-miR-29c :5’ -GGCGGTAGCACCATTTGAA-3’，hsa-miR-22 :5’ -CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA-3’，hsa-miR-320b :5’ -AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCA-3’，hsa-miR-101 :5’ -GGGTACTGTGATAACTGAAGG-3’，内参 hsa-miR-16 :5，-CGCGCTAGCAGCACGTAAAT—3，； PCR 通用的下游引物序列是5’ -AGTGCAGGGTCCGAGGTAIT-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒在活动性肺结核病血清检测中的应用。
全文摘要
本发明提供一种检测活动性肺结核病的诊断试剂盒，由RNA提取缓冲液，活动性肺结核病特异的血清miRNA组合物、内参反转录引物、PCR引物以及荧光定量RT-PCR反应液构成，其中活动性肺结核病特异的血清miRNA组合物由4个差异表达的血清miRNAs组成hsa-miR-29c、hsa-miR-22、hsa-miR-320b和hsa-miR-101。本发明采用活动性肺结核病的特异血清miRNAs组合，在血清miRNAs水平上对活动性肺结核病检测，灵敏度为90.2%、特异性为75.0%，对活动性肺结核病具有早期诊断价值，可实现对活动性肺结核病的早期预警和早期诊断。
文档编号C12Q1/68GK103045723SQ20121033828
公开日2013年4月17日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者李继承, 张星 申请人:浙江大学