专利名称：焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
B-raf是一种癌基因， 它编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学反应，如细胞生长、分化和凋亡等。研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、卵巢癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf基因突变，约66%恶性黑色素瘤和15%的结肠癌中B-raf基因存在体细胞错义突变。大约80-90%的B_raf基因突变发生在exonl5的1799核苷酸上，T突变为A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)。在结直肠癌中，B-raf突变率约为15%，其中约有90%以上的突变形式为T1799A(V600E)，这与K-ras突变互相排斥。最新研究认为，K-ras突变可能导致30%_40%的结直肠癌患者对EGFR靶向治疗无效，而B-raf突变可能导致10%_15%的K_raf野生型患者发生耐药。新上市的用于治疗晚期转移性或不能切除的黑色素瘤的药物Zelboraf，只能用于B-rafV600E突变患者因此，对B-raf基因V600E多态性进行分型检测可预测患者对抗表皮生长因子受体的单克隆抗体的反应性以及Zelboraf疗效，为临床医生给结直肠癌及黑色素瘤制定药物治疗方案提供依据。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测B-raf基因多态性的试剂盒将为抗表皮生长因子受体的单克隆抗体及Zelboraf的临床个体化治疗起到积极的推动作用。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
B-raf基因多态性是影响Zelboraf能否使用的最主要因素。本发明提供一种临床检测使用Zelboraf及抗表皮生长因子受体的单克隆抗体生物标志物的用药基因B_raf多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测Zelboraf及抗表皮生长因子受体的单克隆抗体个体化用药相关基因多态性。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为一种焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒，包括如下引物(I)扩增引物B-raf■上游引物5' -CTTTCTAGTAACTCAGCAGCAT-3' (SEQ ID NO. 2)；B-raf■下游引物5' -AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT-3' (SEQ ID NO. 3)；
其中，下游引物的5'进行生物素标记；(2)测序引物B-raf■测序引物5' -CCACTCCATCGAGATT-3' (SEQ ID NO. 4)；试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。一种应用上述试剂盒检测B-raf基因多态性的方法，包括如下步骤(I) DNA 提取；(2)聚合酶链反应 配制50μ1 PCR 扩增体系，包含10 X PCR buffer 5μ I, dNTP 3·0μ1，上游引物
O.5μ 1，下游引物O. 5μ l，rTaqO. 5μ 1，水39. 5μ 1，模板Ι.Ομ I ;按照下面的循环参数设置扩增仪95° C 5min预变性；然后依次在95° C30S，50° C30S，72° C30S，进行38个循环；再在72° C保持5min，最终保持在4° C，得扩增产物，扩增产物片段为163bp ；(3)焦磷酸测序单链样本纯化；(4)焦磷酸测序及结果分析。本发明的试剂盒对B-raf rsll3488022目标序列进行分析和检测，该目标序列包括野生型GTGAITTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGT(SEQ ID NO. 5)和突变型GTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGGT (SEQ ID NO. 6);扩增出的片段长为 163bp。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对抗表皮生长因子受体的单克隆抗体个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临床上抗表皮生长因子受体的单克隆抗体个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
图为本发明B-raf焦磷酸测序结果图，结果显示B_raf为野生型。
具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I :B-raf■上游引物5' -CTTTCTAGTAACTCAGCAGCAT-3' (SEQ ID NO. 2)；B-raf■下游引物5' -AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT-3' (SEQ ID NO. 3)；其中，下游引物的5'进行生物素标记；B-raf■测序引物5' -CCACTCCATCGAGATT-3' (SEQ ID NO. 4)；I. DNA 提取I. I实验前试剂材料准备与检查工作如下(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾V ； (2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；I. 6 盖上 Eppendorf 管盖，室温孵育 IOmin ；I. 713, OOOrpm 室温离心 20 秒；I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色
上清吸尽；I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；1.11移取300111^ Nuclei Lysis Solution 入上述Eppendorf 管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13，OOOrpm室温离心3min ；I. 13移取上清转移到新的已灭菌I. 5mL Eppendorf管；I. 14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；I. 1513, OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；I. 1813, OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；I. 20在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管，吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干；I. 21 目测沉淀大小，加入 50 IOOul DNA Rehydration Solution 至沉淀；I. 22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；I. 24保存核酸标本至4°C冰箱；2.聚合酶链反应2. I在试剂准备区配制50 μ I PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下
~IOXPCR buffer~5. Ομ I~
dNTP3. Ομ I~
上游引物O. 5μ权利要求
1.一种焦磷酸测序法检测B-raf·基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物 (I)扩增引物 上游引物5' -CTT TCT AGT AAC TCA GCA GCA T-3'； 下游引物5' -AGTAAAAATAGG TGAITT TGG TCT-3'； 其中，下游引物的5'进行生物素标记； (2 )测序引物5' -CCACTCCATCGAGATT-3'。
2.一种应用权利要求I所述的试剂盒检测B-raf基因多态性多态性的方法，包括如下步骤 (1)DNA 提取； (2)聚合酶链反应 配制50μ1 PCR扩增体系，包含10XPCR buffer 5 μ I, dNTP 3. Ομ ，上游引物O.5μ 1，下游引物O. 5μ l，rTaqO. 5μ 1，水39. 5μ 1，模板Ι.Ομ I ;按照下面的循环参数设置扩增仪95° C 5min预变性；然后依次在95° C30S，50° C30S，72° C30S，进行38个循环；再在72° C保持5min，最终保持在4° C，得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒及方法。具体是指B-rfa基因rs113488022(V600E)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.2—4所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量对B-raf基因突变进行检测，从而达到对抗表皮生长因子受体的单克隆抗体(如西妥昔单抗等)、黑色素瘤抑制剂Zelboraf等用药实现安全合理有效的个体化给药。
文档编号C12Q1/68GK102876784SQ201210338530
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者周宏灏 申请人:周宏灏