专利名称：中成药中人参dna的pcr检测方法
技术领域：
本发明属于中成药真伪性的鉴定方法，具体地说是利用PCR技术检测中成药中人参的DNA的一种方法。
背景技术：
传统的中成药的质量控制仅限于对药品性状上的鉴别以及化合物的含量测定。中药材制成中成药，原药材经多种制剂工艺制成中成药时其本身的性状已难以辨别；而中药本身成分复杂，一味药就几十甚至数百个化合物，一个由多种中药组成的中成药，其中化学成分就更多了，目前仅选择有限的几种化学成分的鉴定来控制中成药的质量，就为中成药造假者提供了很大的空间，对于某种价格昂贵的中药材，例如人参，在制剂过程中不加入人参药材，仅加入被列为检测项目的化合物，或者以含有同样化合物的其他药材以假充真，本 方法通过PCR的扩增，对经过打粉、提取、过滤后的中成药仍可以检测出其中人参的DNA，克服了现有技术的不足，可以简便、快速、准确地判断出中成药中是否使用人参，保证药品质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种PCR检测中成药中人参DNA的方法.本发明上述方法是利用聚合酶链式反应(PCR)扩增中成药中人参特异性的DNA来检测中成药中的人参DNA。其中所检测中成药为含有拉丁学名为Panax ginseng C. A. Mey.、其别名或其炮制品的中成药。本发明上述方法包括下列步骤I)中成药中人参DNA的提取；2) PCR 反应；3) PCR扩增产物分析。上述方法中，步骤I)中对于中成药药材以药材粉末入药的剂型采用改良的CTAB法提取DNA;对于中成药药材以提取液入药的剂型采用乙醇重结晶的方法提取。其中所述的药材粉末入药的剂型包括片剂、胶囊和丸剂；所述的提取液入药的剂型包括口服液和注射液。上述方法中，步骤2)中对于DNA含量较高的样本采用普通PCR，对于DNA含量较低的样本采用巢式PCR。其中所述的普通PCR反应的正向引物和反向引物是以人参ITS2序列区域为模板设计的特异性引物，其目的条带可在80-224bp ;所述的巢式PCR对总基因组DNA依次进行第一轮PCR和第二轮PCR两次扩增，第一轮PCR扩增产物的DNA片段可在700-1500bp，第二轮PCR与普通PCR相同。具体地，本发明提供的一种PCR检测中成药中人参DNA的方法包括下列步骤I.中成药中人参DNA的提取
根据不同的剂型可选择合适的提取方法。药材粉末入药的药物包括片剂、胶囊、丸剂等剂型采用改良的CTAB法提取。①药材适量在研钵中研磨成细粉取粉末少量(1，5mL EP管的最小刻度O. ImL处)于I. 5mL EP管中，加入65°C预热的CTAB提取缓冲液700μ 1，充分振荡混匀，65°C温浴2h ;②样品冷却至室温后加氯仿-异戍醇(24 ；1)600 μ I,颠倒混勻5分钟！③7500r. mirT1离心10分钟，转移上清液至一新的EP管中；④加入等体积_20°C预冷的异丙醇，混匀，20°C放置30分钟；⑤10，000r. mirT1离心15分钟，弃上清液； 沉淀用70 %乙醇、无水乙醇各洗涤一次，10，OOOr. mirT1离心3分钟，弃上清液，室温挥干乙醇，无菌高纯水溶解DNA，备用。所述CTAB提取缓冲液含有2% CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，IOOmM Tris (pH 8. O), 20mMEDTA (pH
8.O) ,2. 5M NaCl。提取液入药的包括口服液、注射液等采用乙醇重结晶的方法提取。①IOmL药液加入 ImL 3M 醋酸钠(pH=5. 2), 30mL 无水乙醇，30 μ I 糖原(glycogen), _20°C放置 1.5h。②14, OOOr. mirT1离心10分钟,弃上清。③70%乙醇洗漆，16, OOOr. mirT1离心5分钟,弃上 清。④挥干乙醇，无菌高纯水溶解DNA，备用。2.普通PCR反应体系及条件IOXTaq buffer 5 μ I ； Taq 酶 5 个单位；正向引物ΙμΜ;反向引物 μΜ;dNTPs O. 2mM ；DNA 提取液 I μ I.95 °C解链3分钟；94 V变性30秒，55 °C复性30秒，72 °C延伸30秒，循环30次；72 °C延伸5分钟，得扩增样品。3.巢式PCR反应体系及条件第一轮PCR 10 X Taq buffer 5 μ I ； Taq 酶 5 个单位；正向引物O. 25μΜ;反向引物O. 25μΜ;dNTPs O. 2mM ；DNA 提取液 5 μ I.95°C解链3分钟；94°C变性30秒，60°C复性30秒，72°C延伸30秒，循环25次；72°C延伸5分钟，得扩增样品。第二轮PCR同普通PCR操作。4. PCR扩增产物分析取5 μ I扩增后的样品，与I μ I 6倍DNA上样缓冲液混合，在含有Gelview核酸染料的琼脂糖胶上进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，样品孔含有一条目的条带的为含有人参或污染的阳性样品。本发明原理为通过CTAB法或者乙醇重结晶的方法可以提取出中成药中植物的DNA, PCR反应试剂管中含有多聚酶链式反应试剂，可对试剂管中人参的DNA进行特异的扩增，由于本发明的引物为人参所特有，因此，如果样品中含有人参，那么它的DNA特异片段在经过扩增后，在含有Gelview核酸染料的琼脂糖胶上进行电泳和显色，紫外光检测就可以探测到一定长度片段的目的条带，如果没有人参，则不能扩增到同样长度片段的目的条带。本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括
新颖性。本方法是首次将PCR检测DNA的方法应用到中成药的真伪性的鉴别上。快速性。采用本发明方法检测十分快速，4-6小时即可得知检测结果。灵敏性。由于DNA本身的稳定性，通过各种制剂工艺的加工之后仍然不会被完全破坏，再通过PCR(聚合酶链式反应)指数型的扩增，以及巢式PCR作为辅助手段可以检测到极微量的DNA。
图I是具体实施例I检测结果琼脂糖胶图；其中A为阴性对照，B为片剂，C为阳性对照，D为Marker。图2是具体实施例2检测结果琼脂糖胶图；A为阴性对照，B为注射剂，C为阳性对照，D 为 Marker。
具体实施例方式下面结合附图，通过实例进一步说明本发明。本领域的技术人员应理解，这些实例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例I、检测人参北芪片中人参的DNA按照以下配方制备人参DNA提取试剂CTAB提取缓冲液2% CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，IOOmMTris (pH 8. O)，20mMEDTA(pH 8. O), 2. 5M NaCl0异丙醇、氯仿、无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。按照下列程序进行检测I.人参对照药材DNA的提取①药材适量在研钵中研磨成细粉取粉末少量(I. 5mL EP管的最小刻度O. ImL处)于1.5mL EP管中，加入65°C预热的CTAB提取缓冲液700μ 1，充分振荡混匀，65°C温浴2h ；②样品冷却至室温后加氯仿一异戊醇(24 ；1) 600 μ 1，颠倒混匀5分钟7500r. mirT1离心10分钟，转移上清液至一新的EP管中；④加入等体积-20°C预冷的异丙醇，混匀，20°C放置30分钟； 10，OOOr. mirT1离心15分钟，弃上清液； 沉淀用70%乙醇、无水乙醇各洗涤一次，10，OOOr. mirT1离心3分钟，弃上清液，室温挥干乙醇，无菌高水溶解DNA，备用。2.人参北芪片中植物DNA的提取(同对照药材DNA提取方法)3. PCR 扩增正向引物GGGGCGGATAATGGC反向引物ACGACATGAGAAGAGGGCPCR反应体系IOXTaq buffer 5 μ I ； Taq 酶 5 个单位；正向引物ΙμΜ;反向引物ΙμΜ;dNTPs O. 2mM ；DNA 提取液 I μ I ;超纯灭菌水将体系补足到50 μ I。并同时设置对照药材DNA提取液和超纯灭菌水分别作为阳性对照、阴性对照。PCR反应条件95 °C解链3分钟；94 V变性30秒，55 °C复性30秒，72 °C延伸30秒，循环30次；72°C延伸5分钟，得扩增样品。
4. PCR扩增产物分析将人参对照药材PCR产物送测序公司测序，序列正确。取5 μ I扩增后的样品，与I μ I 6倍DNA上样缓冲液混合，在含有Gelview核酸染料的琼脂糖胶上进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，样品孔含有一条与阳性对照相同位置的目的条带说明该药品中已加入人参药材。检测结果琼脂糖胶图如附图I所示。实施例2、检测参麦注射液中人参的DNA阳性对照的制备以及设置同实例I.按照下列程序进行检测 I.参麦注射液中人参DNA的提取①IOmL注射液加入ImL 3Μ醋酸钠(pH=5. 2), 30mL无水乙醇，30 μ I糖原(glycogen)，_20°C放置I. 5h。②14, OOOr. mirT1离心10分钟,弃上清。③70%乙醇洗漆,16，OOOr. mirT1离心5分钟，弃上清。④挥干乙醇，无菌高水溶解DNA，备用。2.巢式 PCR第一轮PCR 正向引物CACACC GCC CGT CGC TCC TAC CGA反向引物ACTCGC CGT TAC TAG GGG AAPCR反应体系IOXTaq buffer 5 μ I ； Taq 酶 5 个单位；正向引物O. 25μΜ; 反向引物O. 25μΜ;dNTPs O. 2mM ；DNA 提取液 I μ I ;超纯灭菌水将体系补足到50 μ I。并同时设置对照药材DNA提取液和超纯灭菌水分别作为阳性对照、阴性对照。PCR反应条件95°C解链3分钟；94°C变性30秒，60°C复性30秒，72°C延伸30秒，循环25次；72 0C延伸5分钟，得扩增样品。第二轮PCR正向引物GGGGCGGATAATGGC反向引物ACGACATGAGAAGAGGGCPCR反应体系10 X Taq buffer 5 μ I ； Taq 酶 5 个单位；正向引物ΙμΜ;反向引物 μΜ;dNTPs O. 2mM ；第一轮 PCR 产物 I μ I ;超纯灭菌水将体系补足到50 μ I。并取第一轮中等量的阴性对照和阳性对照同时扩增分别作为阴性对照、阳性对照。PCR反应条件95 °C解链3分钟；94 V变性30秒，55 °C复性30秒，72 °C延伸30秒，循环30次；72°C延伸5分钟，得扩增样品。3.巢式PCR扩增及产物分析取5 μ I扩增后的样品，与I μ I 6倍DNA上样缓冲液混合，在含有Gelview核酸染料的琼脂糖胶上进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，样品孔含有一条与阳性对照相同位置的目的条带说明该药品中已加入人参药材。 检测结果琼脂糖胶图如附图2所示。
权利要求
1.一种中成药中人参DNA的PCR检测方法，其特征在于，所述方法是利用PCR扩增中成药中人参特异性的DNA来检测中成药中的人参DNA。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于所检测中成药为含有拉丁学名为Panax ginseng C. A. Mey.、其别名或其炮制品的中成药。
3.根据权利要求I或2所述的检测方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤 1)中成药中人参DNA的提取； 2)PCR反应； 3)PCR扩增产物分析。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤I)中对于中成药药材以药材粉末入药的剂型采用改良的CTAB法提取DNA;对于中成药药材以提取液入药的剂型采用乙醇重结晶的方法提取。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，其中所述的药材粉末入药的剂型包括片齐U、胶囊和丸剂；所述的提取液入药的剂型包括口服液和注射液。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，对于DNA含量较高的样本采用普通PCR，对于DNA含量较低的样本米用巢式PCR。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的普通PCR反应的正向引物和反向引物是以人参ITS2序列区域为模板设计的特异性引物，其目的条带可在80-224bp。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的巢式PCR对总基因组DNA依次进行第一轮PCR和第二轮PCR两次扩增，第一轮PCR扩增产物的DNA片段可在700-1500bp，第二轮PCR与普通PCR相同。
全文摘要
本发明涉及分析检测技术领域，公开了一种利用聚合酶链式反应(PCR)检测中成药中人参的DNA从而鉴定中成药中人参真伪性的方法。具体包括中成药中人参DNA的提取、提取核酸的扩增、扩增产物琼脂糖凝胶检测、结果判断等一套检测操作程序。本发明在普通PCR的基础上，建立巢式PCR反应方法，可快速、准确、灵敏地检测中成药中的人参，为中成药的质量控制提供简单快速有效的方法。
文档编号C12Q1/68GK102827940SQ20121033870
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者唐卓, 陈蓉 申请人:中国科学院成都生物研究所