专利名称：焦磷酸测序法检测β1受体基因多态性的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体的是涉及焦磷酸测序法检测β I受体基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
β I肾上腺素受体阻断药是能选择性地与β I肾上腺素受体结合、从而拮抗神经递质和儿茶酚胺对β受体的激动作用的一种药物类型，临床常用的心血管药物如阿替洛尔(氨酰心安)、美托洛尔(美多心安)、比索洛尔等均属于此类。美托洛尔在临床上广泛用于治疗心绞痛、心律失常、高血压、甲状腺机能亢进、嗜铬细胞瘤、心肌梗塞，其血药浓度疗效具有显著的个体差异大。β I肾上腺素受体属于G蛋白偶联受体超家族，它们以肾上腺素和去甲肾上腺素 为内源性配体，与Gs偶联调节细胞内cAMP水平和L型Ca2+通道的开放频率，调节机体的生理功能。Ser49Gly与Gly389Arg多态性影响β 肾上腺素受体功能，从而影响美托洛尔等药物治疗高血压的疗效和不良反应的发生情况(Clin Pharmacol Ther 2003;73:366-71)。中国人群中4949Gly和389Arg的发生频率分别为16. 2%和76. 4%，此类患者对β I肾上腺素阻断药物更为敏感，疗效相对较好。查明患者β I肾上腺受体的基因型，确定患者对美托洛尔的敏感性，根据患者β I肾上腺受体基因不同单倍型调整剂量，对于不能耐受的患者，建议换药。研究结果表明，高血压病人收缩压与舒张压的降低均与肾上腺素受体单倍型相t匕，49Ser389Arg / 49Ser389Arg 与 49Ser389Arg / 49Gly389Arg 单倍型的患者对美托洛尔的反应良好，而 49Ser389Gly / 49Gly389Arg 和 49Ser389Gly / 49Ser389Gly 单倍型患者对美托洛尔治疗无降压效应。这一结果揭示，肾上腺素受体单倍型可作为美托洛尔抗高血压疗效的预测指标(Clin Pharmacol Ther 2006;80:23-32)。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测β I受体基因多态性的试剂盒将为其底物药的临床个体化治疗起到积极的推动作用。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
本发明旨在提供一种焦磷酸测序法检测β I受体(SEQ ID NO. I)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测其底物β I受体阻断药个体化用药相关基因SNP。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为一种焦磷酸测序法检测β I受体基因多态性的试剂盒，包括如下引物(I)扩增引物:
上游引物5/-TCA ACT GGC TGG GCT ACG C_3' (SEQ ID NO. 2)；下游引物5'-TCT CCG TGG GTC GCG TG-3' (SEQ ID NO. 3)；其中，下游引物的5'进行生物素标记；(2)测序引物5/ -GCA AGG CCT TCC AG-3' (SEQ ID NO. 4)；试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。一种应用上述试剂盒检测β I受体基因多态性的方法，包括如下步骤(I) DNA 提取；(2)聚合酶链反应配制50μ I PCR扩增体系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP 4. O μ 1，上游引物1·5μ 1，下游引物 1·5μ l，rTaq0.5y 1，水 35·5μ 1，模板 2·0μ I ;循环程序为:95。C 5min预变性；依次在95° C 30S，50° C 30S，72° C 30S，进行35个循环；72° C保持5min，最终保持在4° C，得扩增产物；( 3 )焦磷酸测序单链样本纯化；(4)焦磷酸测序及结果分析。本发明的试剂盒对β I受体RS1801253目标序列进行分析和检测，该目标序列包括野生型 CCGCAAGGCCTTCCAGCGACTGCTCTGCTGCGCGCGCA (SEQ ID NO. 5)和突变型 CCGCAAGGCCTTCCAGGGACTGCTCTGCTGCGCGCGCA (SEQ ID NO. 6)。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对β I受体基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上β I受体阻断药个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
图I为本发明β I受体(rsl801253)突变杂合子焦磷酸测序结果；图2为本发明β I受体(rsl801253)突变纯合子焦磷酸测序结果。
具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I :β 受体-pyroF (上游引物)5' -TCA ACT GGC TGG GCT ACG C-3/ (SEQ IDNO. 2)；β I 受体-pyroR (下游引物):5' -TCT CCG TGG GTC GCG TG-3' (SEQ ID NO. 3)；测序引物5'-GCAAGG CCT TCCAG-3' (SEQ ID NO. 4)；I. DNA 提取I. I实验前试剂材料准备与检查工作如下(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾V ； (2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。
I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；I. 6 盖上 Eppendorf 管盖，室温孵育 IOmin ；1.713，OOOrpm 室温离心 20 秒；I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；1.11移取300111^ Nuclei Lysis Solution 入上述Eppendorf 管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13，OOOrpm室温离心3min ；I. 13移取上清转移到新的已灭菌I. 5mL Eppendorf管；I. 14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；I. 1513, OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；I. 1813, OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；I. 20在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管，吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干；I. 21 目测沉淀大小，加入 50 IOOul DNA Rehydration Solution 至沉淀；I. 22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；I. 24保存核酸标本至4°C冰箱；2.聚合酶链反应2. I在试剂准备区配制50 μ I PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表
权利要求
1.一种焦磷酸测序法检测β I受体基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如下引物 (1)扩增引物 上游引物5' -TCA ACT GGC TGG GCT ACG C-3'； 下游引物5' -TCT CCG TGG GTC GCG TG-3'； 其中，下游引物的5'进行生物素标记； (2)测序引物5'-GCA AGG CCT TCC AG-3'。
2.一种应用权利要求I所述的试剂盒检测β I受体基因多态性的方法，包括如下步骤 (1)DNA 提取； (2)聚合酶链反应 配制 50 μ I PCR 扩增体系，包含10XPCRbuffer 5. O μ I, dNTP 4. O μ 1，上游引物I. 5μ 1，下游引物 I. 5 μ l,rTaqO. 5 μ I,/Jc 35. 5μ 1，模板 2. O μ I ;循环程序为95° C 5min预变性；依次在95° C 30S，50° C 30S，72° C 30S，进行35个循环；72° C保持5min，最终保持在4° C，得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测β1受体基因多态性的试剂盒及方法。所述试剂盒β1受体基因多态性进行检查，具体是指rs1801253单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.2—4所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量β1受体基因多态性的检测，从而达到对其底物实现安全合理有效的个体化给药。
文档编号C12Q1/68GK102876785SQ20121033876
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者周宏灏 申请人:周宏灏