重组阳离子抗菌肽g13大肠杆菌基因工程菌及其构建方法

专利名称：重组阳离子抗菌肽g13大肠杆菌基因工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明涉及重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌及其构建方法，属于属于基因工程和生物技术领域。
背景技术：
抗菌肽是在诱导条件下，生物体免疫防卫系统产生的小分子活性肽类，广泛分布于植物，动物以及人类。抗菌肽是由基因编码、由核糖体合成的。目前已经发现、鉴定的抗菌肽已超过千种，大多带净正电荷。从结构上看可以分为α -螺旋型、β -折叠型、富含二硫键的、富含脯氨酸的等多种类型。抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有很强的杀灭作用，有些抗菌肽还可以特异性地抑制某些肿瘤细胞的生长。抗菌肽可以用于医药卫生、食品工业 等方面。在医药卫生方面，抗菌肽与抗生素最大的不同之处在于抗菌肽的应用可以解决抗药性的问题。具有与抗生素完全不同杀菌机理的抗菌肽的应用或许可以为这些问题的解决提供途径。在食品工业上抗菌肽的应用主要是食品添加剂。抗菌肽的杀菌能力很强，并且对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有广泛的杀菌作用，因此可以代替传统的食品防腐剂，起到保鲜作用。同时又由于它是一种肽，可以被消化道消化、吸收对人体无害。此外，抗菌肽在、畜牧业、农业等各个方都有十分广泛的应用。研究其大规模生产具有十分积极的意义。目前，生产抗菌肽的方法主要有三种1.直接从生物体中提取天然抗菌肽抗菌肽广泛存在于低等到高等动物的特定组织中，但是含量非常少，且提取工艺复杂，成本昂贵，难以满足大规模生产的要求；2.化学方法合成抗菌肽化学合成法成本高，同时难以保证合成肽类的天然结构和生物活性，严重影响其广泛应用；3基因工程方法采用该方法是如今研究的热点，也是获得抗菌肽的有效途径之一。

发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌，对于阳离子抗菌肽而言，融合蛋白所带的负电荷可以有效避免抗菌肽对宿主菌的毒性，有利于其产量的提高。本发明是通过以下技术方案来实现的。一种重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌，其含有核苷酸序列为SEQ ID N0 I CAGCGTTCTGTGTCTAACGCAGCAACTCGTGTGTGCCGTACTGGTCGTTCTCGTTGG ；SEQ ID N02 CACCATCATCATCATCATATGGCAGAACAAAGCGACAAGGATGTGAAGTACTACACTCTGGAGGAGATTCAGAAGCACAAAGACAGCAAGAGCACCTGGGTGATCCTACATCATAAGGTGTACGATCTGACCAAGTTTCTCGAAGAGCATCCTGGTGGGGAAGAAGTCCTGGGCGAGCAAGCTGGGGGTGATGCTACTGAGAACTTTGAGGACGTCGGGCACTCTACGGATGCACGAGAACTGTCCAAAACATACATCATCGGGGAGCTCCATCCAGATGACAGATCAAAGATAGCCAAGCCTTCGGAAACCCTT ；
编码的氨基酸序列为SEQ ID N03 QRSVSNAATRVCRTGRSRff ；SEQ ID N04 HHHHHHMAEQ SDKDVKYYTLEEIQKHKD SKSTffVILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLGEQAGGDATENFEDVGHSTDARELSKTYIIGELHPDDRSKIAKPSETL。本发明要解决的技术问题之二是提供一种构建上述工程菌的方法。一种构建上述重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的方法，其步骤为
(I)以含有G13基因序列的质粒为模板，在G13上游设置NcoI酶切位点进行PCR扩增，引物为G13F:5’ -CATGCCATGGATCAGCGTTCTGTGTCTAAC-3’，G13R: 5，-ACTGGTCGTTCTCGTTGG-3，；(2)以含有融合蛋白基因的质粒为模板，在序列下游设置EcoRI酶切位点进行PCR扩增，引物为CF :5，-CACCATCATCATCATCAT-3，，CR: :5，-GGAATTCTTAAGGGTTTCCGAAGGCTT-3，；(3)将G13基因PCR产物和融合蛋白基因PCR产物等量混合，磷酸化后进行连接，再引入(I)中的引物G13F和(2)中的引物CR进行PCR扩增；(4)将(3)的PCR产物通过DNA重组克隆至载体质粒pET-22b_G13C，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，氨苄青霉素筛选阳性重组子；(5)将(4)的产物振荡培养至对数期，通过诱导剂诱导后收集菌体。进一步地，上述PCR扩增反应条件均为94°C 45s，50°C 45s，72°C 30s, 30个循环，72°C lOmin，并且，反应产物均用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。进一步地，上述步骤(3)中，混合物是由T4PNK进行磷酸化后用T4DNA连接酶连接。进一步地，上述步骤(4)中，PCR产物用EcoRI和NcoI酶切，经纯化后用T4DNA连接酶连接得到载体质粒pET-22b-G13C。进一步地，上述步骤(5)，将步骤(4)产物接种至含有50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中37°C过夜振荡培养，按1%量接入新鲜的LB培养基，37°C振荡培养至0D600 ^ O. 5时,加入终浓度lmmol/L的IPTG,30°C诱导6h,9000r/min离心Imin,收集菌体。采用融合表达的办法有效得解决了本发明要解决的技术问题。在诱导表达后，可以除去融合蛋白，恢复其活性。这样可以大量获得抗菌肽。融合蛋白的大小、氨基酸类型、与抗菌肽的位置关系，影响着融合表达的效率。对于阳离子抗菌肽而言，融合蛋白所带的负电荷可以有效避免抗菌肽对宿主菌的毒性，有利于其产量的提高，根据不同抗菌肽的结构特点，融合头可能位于抗菌肽N端或C端而起到效果。本发明在阳离子抗菌肽G13的C端添加融合头序列。本发明的科学原理为阳离子抗菌肽的正电荷有利于其与细胞膜的结合，融合蛋白的所带的负电荷则有利于中和这些正电荷，降低其对宿主菌的毒性。融合蛋白设计在其尾端，也可以对抗菌肽的毒性起到一定的抑制作用，从而提高其产量。本发明的有益效果在于高效稳定表达，表达的融合蛋白为可溶状态，避免了尿素溶解包涵体这一步骤。可以在G13与融合头之间添加化学切割位点，使得切割与纯化成本低廉。


图1为诱导表达效果对比图；图2为质粒构建示意图。
具体实施例方式下面根据附图和实施例对本发明 作进一步详细说明。重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌，其含有核苷酸序列为SEQ ID N0 I CAGCGTTCTGTGTCTAACGCAGCAACTCGTGTGTGCCGTACTGGTCGTTCTCGTTGG ；SEQ ID N02 CACCATCATCATCATCATATGGCAGAACAAAGCGACAAGGATGTGAAGTACTACACTCTGGAGGAGATTCAGAAGCACAAAGACAGCAAGAGCACCTGGGTGATCCTACATCATAAGGTGTACGATCTGACCAAGTTTCTCGAAGAGCATCCTGGTGGGGAAGAAGTCCTGGGCGAGCAAGCTGGGGGTGATGCTACTGAGAACTTTGAGGACGTCGGGCACTCTACGGATGCACGAGAACTGTCCAAAACATACATCATCGGGGAGCTCCATCCAGATGACAGATCAAAGATAGCCAAGCCTTCGGAAACCCTT ；编码的氨基酸序列为SEQ ID N03 QRSVSNAATRVCRTGRSRff ；SEQ ID N04 HHHHHHMAEQSDKDVKYYTLEEIQKHKDSKSTWVILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLGEQAGGDATENFEDVGHSTDARELSKTYIIGELHPDDRSKIAKPSETL。本发明要解决的技术问题之二是提供一种构建上述工程菌的方法。一种构建上述重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的方法，其步骤为(I)以含有G13基因序列的质粒为模板，在G13上游设置NcoI酶切位点进行PCR扩增，PCR扩增反应条件均为94°C 45s, 50°C 45s, 72°C 30s，30个循环，72°C lOmin，反应产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，引物为G13F : 5 ’ -CATGCCATGGATCAGCGTTCTGTGTCTAAC-3，，G13R:5，-ACTGGTCGTTCTCGTTGG-3’ ；(2)以含有融合蛋白基因的质粒为模板，在序列下游设置EcoRI酶切位点进行PCR扩增，PCR扩增反应条件均为94V 45s, 50°C 45s, 72°C 30s, 30个循环，72°C lOmin，反应产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，引物为CF :5，-CACCATCATCATCATCAT-3，，CR: :5，-GGAATTCTTAAAGGGTTTCCGAAGGCTT-3，；(3)将G13基因PCR产物和融合蛋白基因PCR产物等量混合，混合物是由T4PNK进行磷酸化后用T4DNA连接酶连接，磷酸化后进行连接，再引入(I)中的引物Gl3F和(2 )中的引物CR进行PCR扩增；(4)将(3)的PCR产物用EcoRI和NcoI酶切，经纯化后用T4DNA连接酶连接得到载体质粒pET-22b-G13C，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，氨苄青霉素筛选阳性重组子；其中，图2为质粒构建示意图，参照图2，G13基因的3’端连接上CHERRY基因，插入到载体质粒pET22b (+)。(5)将步骤(4)产物接种至含有50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中37°C过夜振荡培养，按1%量接入新鲜的LB培养基，37°C振荡培养至0D600 ^ O. 5时，加入终浓度Immol/L 的 IPTG,30°C诱导 6h,9000r/min 离心 Imin,收集菌体。工程菌经IPTG诱导表达，破碎，取样做SDS-PAGE检测，图1为诱导表达效果对比图，参照图1，标记I为未诱导对照，标记2为诱导的基因工程菌，标记3为分子量标准。 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，其含有核苷酸序列为SEQ ID N0 I CAGCGTTCTGTGTCTAACGCAGCAACTCGTGTGTGCCGTACTGGTCGTTCTCGTTGG ；SEQ ID N02 CACCATCATCATCATCATATGGCAGAACAAAGCGACAAGGATGTGAAGTACTACACTCTGGAGGAGATTCA GAAGCACAAAGACAGCAAGAGCACCTGGGTGATCCTACATCATAAGGTGTACGATCTGACCAAGTTTCTCGAAGAG CATCCTGGTGGGGAAGAAGTCCTGGGCGAGCAAGCTGGGGGTGATGCTACTGAGAACTTTGAGGACGTCGGGCACT CTACGGATGCACGAGAACTGTCCAAAACATACATCATCGGGGAGCTCCATCCAGATGACAGATCAAAGATAGCCAA GCCTTCGGAAACCCTT ；编码的氨基酸序列为SEQ ID N03 QRSVSNAATRVCRTGRSRff ；SEQ ID N04 HHHHHHMAEQSDKDVKYYTLEEIQKHKDSKSTWVILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLGEQAGGDATENFEDVGHSTDARELSKTYIIGELHPDDRSKIAKPSETL。
2.—种构建如权利要求1所述的重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的方法， 其特征在于，步骤为(1)以含有G13基因序列的质粒为模板，在G13上游设置NcoI酶切位点进行PCR扩增， 引物为G13F :5’ -CATGCCATGGATCAGCGTTCTGTGTCTAAC-3’，G13R:5’ -ACTGGTCGTTCTCGTTGG-3’ ；(2)以含有融合蛋白基因的质粒为模板，在序列下游设置EcoRI酶切位点进行PCR扩增，引物为CF :5，-CACCATCATCATCATCAT-3，，CR: :5’-GGAATTCTTAAAGGGTTTCCGAAGGCTT-3，；(3)将G13基因PCR产物和融合蛋白基因PCR产物等量混合，磷酸化后进行连接，再引 A(I)中的引物G13F和(2)中的引物CR进行PCR扩增；(4)将(3)的PCR产物通过DNA重组克隆至载体质粒pET_22b_G13C，转化大肠杆菌BL21 感受态细胞，氨苄青霉素筛选阳性重组子；(5)将(4)的产物振荡培养至对数期，通过诱导剂诱导后收集菌体。
3.根据权利要求2所述的构建重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的方法， 其特征在于，所述PCR扩增反应条件均为94°C 45s, 50°C 45s, 72°C 30s，30个循环，72°C IOmin,并且，反应产物均用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。
4.根据权利要求2所述的构建重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，混合物是由T4PNK进行磷酸化后用T4DNA连接酶连接。
5.根据权利要求2所述的构建重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，PCR产物用EcoRI和NcoI酶切，经纯化后用T4DNA连接酶连接得到载体质粒pET-22b-G13C。
6.根据权利要求2所述的构建重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于，所述步骤(5)，将步骤(4)产物接种至含有50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中 37°C过夜振荡培养，按1%量接入新鲜的LB培养基，37°C振荡培养至0D600 ^ O. 5时，加入终浓度Immol /I,的IPTG,30°C诱导6h,9000r/min离心Imin,收集菌体。
全文摘要
本发明公开了重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌及其构建方法，本发明的原理为，阳离子抗菌肽的正电荷有利于其与细胞膜的结合，融合蛋白的所带的负电荷则有利于中和这些正电荷，降低其对宿主菌的毒性。融合蛋白设计在其尾端，也可以对抗菌肽的毒性起到一定的抑制作用，从而提高其产量。本发明的有益效果在于高效稳定表达，表达的融合蛋白为可溶状态，避免了尿素溶解包涵体这一步骤。可以在G13与融合头之间添加化学切割位点，使得切割与纯化成本低廉。
文档编号C12N1/21GK102994434SQ20121033841
公开日2013年3月27日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者查向东, 恽辉, 余忠丽, 程林春, 赵大伟 申请人:安徽希普生物科技有限公司