专利名称：微藻利用无机碳途径的定量方法
技术领域：
本发明涉及一种微藻利用无机碳途径的定量方法，属于生态环境治理和海洋生物工程领域。
背景技术：
微藻(microalgae)包括所有生活在水中营浮游生活方式的微小植物，通常就指浮游藻类。微藻结构简单，其生理过程也相对简单，有些种类是科学研究的模式植物，如莱茵衣藻、小球藻，很多种类还可以人工培养，这为我们的研究提供了便利。微藻对水体无机碳的利用有两种方式，(I)利用大气中的ニ氧化碳。CO2作为线性非极性分子，呈电中性，它可以自由扩散进入细胞双层脂膜，进入细胞中的CO2为微藻细胞的光合作用所利用；(2)利用溶液中碳酸氢根离子。碳酸氢根离子既可以直接转运也可间接转运到细胞中为微藻细胞 所利用。碳酸氢根离子的直接转运指的是经过细胞质膜表面载体蛋白或阴离子交換蛋白， 直接把碳酸氢根离子转运到细胞内，在胞内经碳酸酐酶转化为CO2或直接以碳酸氢根离子的形式由叶绿体膜蛋白主动运输到叶绿体内，经碳酸酐酶转化成CO2供核酮糖-1，5 ニ磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)固定；碳酸氢根离子的间接转运是指依赖于胞外碳酸酐酶的碳酸氢根离子的间接转运。碳酸酐酶(EC 4. 2. I. I)是ー种含锌的金属酶，催化CO2与HCO3-的可逆转化C02+H20 H++HCCV。碳酸酐酶分为质膜内和质膜外两种。质膜外碳酸酐酶(又称胞外碳酸酐酶)通过金属离子与细胞壁内表面相连接，催化细胞扩散层中碳酸氢根离子迅速水解成游离CO2,从而保证了细胞的CO2快速供应。有些藻类只利用CO2 ;有些藻类不仅能利用CO2,还能或直接利用碳酸氢根离子，或通过胞外碳酸酐酶间接利用碳酸氢根离子，或者两者兼而有之。但是现有技术无法定量微藻利用无机碳途径。了解微藻利用方式和份额将有助于微藻生物技术的发展，同吋，为水华赤潮的治理提供科学依据。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种微藻利用无机碳途径的识别方法，以克服现有技术无法定量微藻利用无机碳途径的不足。本发明采取以下技术方案它包括以下步骤第一，选择两种S13C值差值大于8%。的碳酸氢钠作为同位素标记I和同位素标记2分别添加到培养液中来培养待测微藻；同位素标记I的碳酸氢钠的δ 13C值为δ C1,同位素标记2的碳酸氢钠的δ 13C值为δ。2 ;同时测定未添加碳酸氢钠、完全来自空气的原始培养液中无机碳δ 13C值为δ C(l ；
第二，待测微藻同时在被考察的培养条件下和在16 mM碳酸氢钠和IOmM AZ的培养条件下培养4天后，分别测定两种同位素标记的培养液培养的相对应的各培养条件下的、被考察微藻的稳定碳同位素组成S 13C的值δη、δΤ2、δτ1_ΑΖ和δΤ2_ΑΖ;
第三，通过方程& =计算出微藻各培养条件下利用添加的无机碳源的份额
OCl-OQfB;
第四，依据在16 mM碳酸氢钠和IOmM AZ的培养条件下的待测微藻的稳定碳同位素值ST1-AZ或δΤ2_ΑΖ，依据方程Sa=STi- fBDi，计算微藻完全利用大气中的ニ氧化碳途径时藻体的δ 13C值为δ a ；
第五，依据在各培养条件下的待测微藻的稳定碳同位素值δτ1和δΤ2;微藻完全利用大气中的ニ氧化碳途径时藻体的S13C值Sa;微藻各培养条件下利用添加的无机碳源的份额も以及相应的同位素标记的碳酸氢钠的W3C值δα与未添加碳酸氢钠、完全来自空气的原始培养液中无机碳δ 13Cft 的差Di的信息，代入方程fb= 1000 ( δ Ti- δ a- fBDi)/9中，计算微藻利用碳酸氢根离子途径的份额fb，i-fb为微藻利用ニ氧化碳途径的份额；
本发明的优点如下
自然界中碳元素有两种稳定同位素=12C和13C,它们的天然平均丰度分别为98. 89%和 I.11%。稳定碳同位素组成通常用δ 13C (%。)表示，自然界中δ 13C的变化为-90%。、20%0。稳定碳同位素的強烈分馏特征是识别微藻无机碳来源的基础。质量平衡原理以及同位素混合模型和化学计量学方法，是定量识别微藻无机碳来源的基础。微藻两种无机碳利用途径造成的同位素分馏差异有明显不同。利用大气中的ニ氧化碳途径可造成最大的同位素分馏(S a)。碳酸氢根离子的直接转运和依赖于胞外碳酸酐酶的碳酸氢根离子的间接转运途径造成的同位素分馏比利用大气中的ニ氧化碳途径造成同位素分懼小9%。(PDB)0こ酰唑胺(acetazolamide,AZ)是含1，3, 4_噻ニ唑环的杂环磺酰胺类碳酸酐酶胞外酶抑制剂。利用碳酸酐酶胞外酶抑制剂能够专一地抑制碳酸酐酶胞外酶的特点，研究碳酸酐酶胞外酶活性被抑制下的微藻同位素变化，可以反向识别依赖于胞外碳酸酐酶的碳酸氢根离子的间接转运途径对无机碳利用的贡献和份额。在依赖于胞外碳酸酐酶的碳酸氢根离子间接转运途径被抑制同时，碳酸氢根离子的直接转运途径也同时被抑制。高浓度碳酸氢钠也对碳酸酐酶胞外酶有抑制作用，在高浓度碳酸氢钠和IOmM AZ的作用下，依赖于胞外碳酸酐酶的碳酸氢根离子的间接转运途径和碳酸氢根离子的直接转运途径将同时被完全抑制。本发明采取如下的思路分别添加两种δ 13C值差异悬殊的碳酸氢钠同时培养待测微藻，測定藻体δ 13C值，利用两端元的同位素混合模型获取微藻利用来自于空气的无机碳源和利用添加的无机碳源的份额，随后分别添加两种δ 13C值差异悬殊的、高浓度的碳酸氢钠，在IOmM AZ的条件下培养待测微藻,测定藻体δ 13C值,获取微藻完全利用大气中的ニ氧化碳途径造成的同位素分馏值(牝)，最后，根据上述信息，利用ニ端元的同位素混合模型，分别求出两种途径的份额。获取无机碳源份额的原理
水体中总溶解的无机碳(DIC)存在四种形式co2、hco3_、h2co3和CO广，并且它们存在着如下的化学平衡C02+H20 — H2CO3 — HC03_+H+ — C032_+2H+。无论是来源于空气的无机碳还是添加的无机碳都有两种无机碳——CO2和HCO3-供微藻利用。因此，可以利用两端元的同位素混合模型获取微藻利用来自于空气的无机碳源和利用添加的无机碳源的份额。两端元的同位素混合模型可以表示为
5 Ti= 5 Ai- fBi 5 Ai +fBi δ Bi (i=l，2,3，------) (I)这里δπ为微藻的S13C值，δΜ为假定为微藻完全利用空气的无机碳源时藻体的S13C值，S Bi为假定为微藻完全利用添加的无机碳源时藻体的S13C值，fBi为该考察微藻利用添加的无机碳源所占的份额。很显然，只知道δπ很难求出fBi，因此，本发明采用具有较大差异的S13C值碳酸氢钠分别同时培养微藻，以稳定碳同位素双标记来识别微藻利用添加的无机碳源的份额。对于同位素标记I (i=l)来说，方程(I)表示如下式
3 τι- δ A1_ fB1 δ A1 +fB1 δ B1 (2)
这里Sn为用第一种已知S13C值的碳酸氢钠培养的微藻藻体的S13C值，δΑ1为假定为微藻完全利用空气的无机碳源时藻体的S 13C值，δΒ1为假定为微藻完全利用添加的无机碳源时藻体的δ 13C值，fB1为该考察微藻利用添加的无机为碳源所占的份额。
3 T2- 3 A2 _ fB2 δ A2 +fB2 δ B2( 3 )
这里St2为用第一种已知S13C值的碳酸氢钠培养的微藻藻体的S13C值，δΑ2为假定为微藻完全利用空气的无机碳源时藻体的S 13C值，δΒ2为假定为微藻完全利用添加的无机碳源时藻体的δ 13C值，fB2为该考察微藻利用添加的无机碳源所占的份额。(2)和(3)两个方程中 δ Α1= δ A2，fB=fBi= fB1= fB2，联立求解
c δτ -δχ2,、
fB = -———(4)
OEl- OE2
(4)式中δΒ1-δΒ2_可以换算成同位素标记I的碳酸氢钠的S13C值与同位素标记2的碳酸氢钠的δ 13C值δ C2的差，则
P δτι-δτ2.ΓΛ
tB =--( 5 )
Oci - OC2
因此，可以通过測定同位素标记I的碳酸氢钠的S13C值Sci与同位素标记2的碳酸氢钠的S13C值，同时测定用对应的标记的碳酸氢钠培养的微藻的S13C值，即測定出δτ1和δ Τ2值，依(5)式计算出该考察微藻利用添加的无机碳源所占的份额。获取微藻无机碳利用途径份额的原理
无论是来源于空气的无机碳还是添加的无机碳都有两种无机碳一CO2和hco3_供微藻利用。因此，可以利用两端元的同位素混合模型来获取微藻两种利用无机碳途径的份额信
O两端元的同位素混合模型可以表示为
5Ti=(l-fB) [(l-fb) 5a+fb(5a +9%0)]+fB [(l-fb) 5bi+fb(5bi +9%。)] (i=l，2) (6)这里δ 为微藻的S13C值，Sa为微藻完全利用大气中的ニ氧化碳途径时藻体的S13C值，Sbi假定为微藻利用添加的无机碳源、完全进行ニ氧化碳途径时藻体的S13C值，fb为该考察微藻利用碳酸氢根离子途径所占的份额。在这里，Sbi-Sa可以换算成同位素标记的碳酸氢钠的S13C值δα(或同位素标记I的碳酸氢钠的S 13C值δ C1或同位素标记2的碳酸氢钠的δ 13C值δ C2)与未添加碳酸氢钠、完全来自空气的原始培养液中无机碳S 13C值δω的差Di。因此，(6)式可简化成
fb= 1000 (δΤ -δ3- ^)/9 (i=l,2) (7)微藻完全利用大气中的ニ氧化碳途径时藻体的S13C值，也即Sa赋值原理
在高浓度碳酸氢钠和IOmM AZ的作用下，(7)式fb=0 也即 δ Ti- δ a- fBDj =0，
5 a=5 Ti- fBDi (i=l，2)(8)
综合利用上述原理，可以快速定量微藻利用无机碳途径；在完全相同的实验条件下开展培养实验，获取微藻利用无机碳途径份额的数据可靠，这是现有技术都无法做到的。
具体实施例方式
具体实施例方式第一步骤，測定不同厂家生产的碳酸氢钠，选择两种S13C值差值大于8 %。的碳酸氢钠作为同位素标记I和同位素标记2分别加到培养液中。同位素标记的碳酸氢钠的δ 13C值记为δ α,其中同位素标记I的碳酸氢钠的δ 13C值为δ C1,同位素标 记2的碳酸氢钠的δ 13C值为δ。2。同位素标记的碳酸氢钠的δ 13C值δ c与未添加碳酸氢钠、完全来自空气的原始培养液中无机碳S 13C值δ co的差为Di,其中D1为同位素标记I的碳酸氢钠的δ 13C值δ C1与未添加碳酸氢钠、完全来自空气的原始培养液中无机碳δ 13C值δ co的差，D2为同位素标记2的碳酸氢钠的δ 13C值δ C2与未添加碳酸氢钠、完全来自空气的原始培养液中无机碳s 13C值δω的差。第二步骤，同时用两种同位素标记碳酸氢钠的培养液分别同时在被考察的培养条件下和在16 mM碳酸氢钠和IOmM AZ的培养条件下，培养被考察的微藻，4天后，同时分别测定两种同位素标记的培养液培养的相对应的各培养条件下的、被考察微藻的稳定碳同位素
组成 S 13C 的值 δ Τ1、δ Τ2、δ Τ1_ΑΖ 和 δ Τ2_ΑΖ ；。第三步骤，将同位素标记I的碳酸氢钠的S13C值作为δα，由同位素标记I培养的、各培养条件下的、被考察微藻的S13C值作为δτ1，同位素标记2的碳酸氢钠的S13C值作为δ ca，由同位素标记2培养的、相对应的培养条件下的、被考察微藻的S13C值作为δ Τ2，
带入& =，计算出各个培养条件下被考察微藻利用添加的无机碳源的份额fB，微藻
OCl- OC2
利用空气的无机碳源份额为i-fB。第四步骤，依据在16 mM碳酸氢钠和IOmM AZ的培养条件下培养的被考察微藻的稳定碳同位素值S Ti ( S X1-AZ或S T2-AZ ) ^依据方程:K= &计算微藻完全利用大气中的ニ氧化碳途径时藻体的S13C值sa。第五步骤，依据在各培养条件下的待测微藻的稳定碳同位素值δ ，其中在同位素标记I碳酸氢钠培养下的待测微藻的稳定碳同位素值S T1，在同位素标记2碳酸氢钠培养下的待测微藻的稳定碳同位素值S T2;微藻完全利用大气中的ニ氧化碳途径时藻体的W3C值δ a、微藻各培养条件下利用添加的无机碳源的份额fB以及相应的同位素标记的碳酸氢钠的δ 13C值δ α (同位素标记I的碳酸氢钠的δ 13C值δ C1或同位素标记2的碳酸氢钠的S13C值δ。2)与未添加碳酸氢钠、完全来自空气的原始培养液中无机碳S13C值Scxi的差Di的信息，代入方程fb= 1000 ( δ Ti- δ a- fBDi)/9中，计算微藻利用碳酸氢根离子途径的份额fb，i-fb为微藻利用ニ氧化碳途径的份额。本发明的实施效果如下
培养材料为衣藻和小球藻。基本培养液采用SE培养基，基本培养条件为光周期L/D 12h/12h ，温度25°C;光照强度为IOOMm0InT2s-SpH值8. O或8. 2 (用盐酸和氢氧化钠调节)。其它培养条件如表1，其中添加的碳酸氢钠的S 13C分别为-26. 3%o (PDB) ( δ C1)和-16. 5%0(PDB) ( 5C2),16 mM碳酸氢钠和IOmM AZ的培养条件是必需的。未添加碳酸氢钠、完全来自空气的原始培养液中无机碳S 13C值为-11.8%。(PDB)。待培养4天后，分别测定各培养条件和各实验的微藻S 13C值。用本发明方法，得出衣藻和小球藻各个培养条件下利用添加的无机碳源的份额fB以及利用空气的无机碳源份额l_fB，如表2。随后，利用本发明，得出衣藻和小球藻各个培养条件下利用碳酸氢根离子途径和利用ニ氧化碳途径的份额，如表3。
表I衣藻和小球藻各培养实验的培养条件
权利要求
1.一种微藻利用无机碳途径的定量方法，其特征包含以下步骤 第一，选择两种S13C值差值大于8 %。的碳酸氢钠作为同位素标记I和同位素标记2分别添加到培养液中来培养待测微藻；同位素标记I的碳酸氢钠的S 13C值为δα，同位素标记2的碳酸氢钠的δ 13C值为δ。2 ;同时测定未添加碳酸氢钠、完全来自空气的原始培养液中无机碳S 13C值为Sai; 第二，待测微藻同时在被考察的培养条件下和在16 mM碳酸氢钠和IOmM AZ的培养条件下培养4天后，分别测定两种同位素标记的培养液培养的相对应的各培养条件下的、被考察微藻的稳定碳同位素组成S 13C的值δτ1、δΤ2、δτ1_ΑΖ和δΤ2_ΑΖ; 第三，通过方程
全文摘要
本发明公开一种微藻利用无机碳途径的定量方法。现有技术无法定量微藻利用无机碳途径。解决方法为分别添加两种δ13C值差值大于8‰的碳酸氢钠作为同位素标记1和同位素标记2到培养液中来培养待测微藻；待测微藻同时在上述条件下和在16mM碳酸氢钠和10mMAZ的培养条件下培养4天后，测得δ13C值，计算出微藻各培养条件下利用添加的无机碳源的份额fB和完全利用大气中的二氧化碳途径时藻体的δ13C值δa，然后根据所得数据计算得到微藻利用无机碳的两种途径的份额。本发明可以快速定量微藻利用无机碳途径；在完全相同的实验条件下开展培养实验，获取微藻利用无机碳途径份额的数据可靠，这是现有技术都无法做到的。
文档编号C12Q1/06GK102827916SQ20121034844
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年8月9日
发明者吴沿友, 李海涛, 刘丛强, 王宝利, 梁小兵, 徐莹, 谢腾祥 申请人:中国科学院地球化学研究所