专利名称：C型钠肽在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及C型钠肽在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用。
背景技术：
在家畜繁殖上，广泛采用非激素刺激卵巢来源卵母细胞体外成熟后生产动物胚胎，因此体外卵母细胞成熟是一个重要的平台技术用于育种、克隆及转基因动物生产。
目前，优质种牛数量少、繁育速度慢、生产性能落后是制约我国养牛业健康、可持续发展的关键因素。牛的体细胞克隆胚胎(NTEs)以及体外受精胚胎(IVFEs)的细胞数，均明显低于体内胚胎，这反映了牛的体外培养体系还不理想。牛体外受精(in vitroFertilization, IVF)胚胎质量是影响胚胎移植妊娠率和移植后后代犊牛成活率的重要因素。近年来关于牛卵母细胞体外成熟培养(IVM)方面取得了较大进展。专利CN102140435A、CN 101591637A、CN 100432219C公开了提高牛卵母细胞体外成熟的方法或新的培养液。但均是用于促进减数分裂恢复，促进卵母细胞体外生长成熟。这对于卵母细胞从卵泡转到培养液中后，在胞质未完全成熟的情况下提前恢复减数分裂，从而影响卵母细胞的发育能力。为了提高卵母细胞的体外发育能力，许多学者模拟体内环境开发了卵母细胞体外两段成熟培养方法，即通过体外使用减数分裂抑制剂暂时可逆的阻止卵母细胞减数分裂恢复，同时促进卵母细胞生长发育，增强胞质成熟，然后移出减数分裂抑制环境，进行体外成熟。这种方法目的延长颗粒细胞与卵母细胞通过间隙连接进行物质和信息交流的时间，促进卵母细胞积累丰富的mRNA和蛋白质。但是，这些研究结果显示通过使用减数分裂抑制剂并没有提高牛卵母细胞体外发育能力，甚至产生了不利的影响(Gilchrist RB, et al.Comparison of oocyte factors and transforming growthfactor-beta in the regulation of DNA synthesis in bovine granulosa cells. MolCell Endocrinol, 2003, 201:87 - 95. Lonergan P, et al. Bovine blastocyst productionin vitro after inhibition of oocyte meiotic resumption for 24h. J ReprodFertil, 1997，109:355 - 365.)。C型钠肽(CNP, C-type natriuretic peptide, C型钠尿肽，C_型利钠肽)为钠肽家族成员，一般认为以自分泌和旁分泌的方式调控动物心血管、神经系统、内分泌系统及繁殖性能。功能性C型钠肽由22个氨基酸组成，是生理活性物质，相对于化学合成的减数分裂抑制剂危害性应较小，用于卵母细胞体外成熟培养体系的建立可能具有一定的作用。《Granulosa Cell Ligand NPPC and Its Receptor NPR2 Maintain MeioticArrest in Mouse Oocytes’》(Science, 2010)文中提出一种模型来解释小鼠卵母细胞保持减数分裂的机制。通过NPPC (C型利钠肽前体)和NPR2 (由卵丘细胞表达的一种鸟苷酸环化酶)突变体小鼠来验证NPPC和NPR2在保持卵母细胞减数分裂停滞的作用，突变体小鼠出现了促性腺激素非依赖性的减数分裂的恢复。但上述只是一种机制研究，对于CNP能否抑制牛等家畜卵母细胞减数分裂，并用于体外受精、胚胎生产尚不确定，目前尚无此方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛卵母细胞体外成熟培养液。本发明另一目的是提供一种促进牛卵母细胞体外成熟的方法。本发明再一目的是提供C型钠肽在促进牛卵母细胞成熟中的应用及C型钠肽在制备用于促进牛卵母细胞体外成熟药物/减数分裂抑制剂药物中的应用。所述牛卵母细胞体外成熟培养液以常规培养液为基质，所述基质中含有C型钠 肽。优选地，所述体外成熟培养液每IOOOmL组成为C 型钠肽 200nM。TCM199 补足至 1000mL。牛卵母细胞采集后在添加CNP的组织培养液内前成熟处理6h，然后在成熟液内成熟24-28h，成熟后的卵母细胞进行体外受精，然后进行体外胚胎培养。具体地，包括以下步骤I)采集牛卵母细胞；2)将牛卵母细胞在所述牛卵母细胞体外成熟培养液中培养；3)牛卵母细胞体外成熟培养。其中，步骤I)中所述牛卵母细胞为卵丘-卵母细胞复合体。其中，步骤2)中所述培养时间为6h ;所述培养液为TCM199培养液。其中，步骤3)中所述培养的培养液为添加FSH 10 μ g/ml, LHl μ g/ml, E2I μ g/ml,EGF lOng/ml, 10%FBS 的 TCM199 培养液；培养时间为 24_28h。其中，成熟培养后的卵母细胞还用于体外受精或体外胚胎生产。本发明的有益效果I)本发明首次采用两段体外成熟培养法，应用CNP前成熟处理牛卵母细胞，促进核成熟和胞质成熟同步，提高了体外发育能力，能够成为新型的减数分裂抑制剂药物在畜牧业生产上推广应用。2)本发明充分利用屠宰场卵巢卵母细胞资源，加速良种选育及扩繁技术体系，大幅度提高育种效率和技术水平。3)本发明CNP为生物活性的肽类物质，对卵母细胞的毒害作用小。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实验用卵巢采自河北省大厂县屠宰场，C型钠肽购自美国Sigma公司。实施例I卵母细胞成熟培养(I)卵母细胞采集使用含有抽卵液(TCM199+l%PVA+200uM IBMX+1%双抗)的IOml注射器从屠宰场获取的牛卵巢表面抽取直径3-8mm卵泡。将吸取卵母细胞后的吸卵液放入IOOmL国产培养皿中，在体视显微镜下挑选出A级(胞质均匀3层及以上紧密卵丘颗粒细胞包裹)和B级(胞质均匀少于3层紧密卵丘颗粒细胞包裹或部分裸露)卵母细胞用于体外前成熟培养。(2)卵母细胞前成熟处理将挑选出的A、B级卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)在洗卵液(TCM199+l%PVA+200uM IBMX+1%双抗)中清洗3次，含有CNP的前成熟液(添加200nM浓度CNP的TCM199培养液)清洗2次，然后放入预先在C O2培养箱中平衡2h的前成熟培养液中培养(四孔板培养，500 μ I体积成熟液，50枚左右卵母)，培养条件为含5%C02的空气，温度39°C，饱和湿度，培养时间为6h。前成熟后一部分卵母细胞脱去颗粒细胞，然后DAPI染色在显微镜下观察CNP对牛卵母细胞减数分裂抑制情况(未添加CNP的前成熟液培养的卵母细胞为对照)，观察卵母细胞维持在生发泡(GV)阶段的数目，前成熟后的卵母细胞进行下一步成熟培养用于检测发育能力。结果见表I。表IC型钠肽前处理后对体外牛卵母细胞减数分裂的影响
处理卵母细胞数 GV数(%)GVBD数(%)
Control9151(56 + 2.6°) 40(44 + 2.6°)
CNP(200nM) 9479(81. 5 + 2. Ib) 18(21. 3 + 2. Ib)注同列不同字母表示差异显著(P〈0. 01)实验结果表明CNP处理6h后抑制了牛卵母细胞减数分裂，卵母细胞维持在生发泡(GV)阶段的比例显著高于与对照(P〈0. 05)。(3)卵母细胞成熟培养前成熟处理后的牛卵母细胞在成熟液中(添加FSH 10 μ g/ml, LH lyg/ml,E21 μ g/ml，EGF 10ng/ml, 10%FBS的TCM199培养液)进行体外成熟培养，设3个培养时间处理分别为24h、26h和28h，同时没有经过前成熟处理的卵母细胞设定为对照，设定3个培养时间处理分别为24h、26h和28h。实施例2体外受精与体外胚胎生产(I)体外受精采用培养皿微滴法，首先将成熟的卵母细胞在受精液(B0液+IOmM咖啡因+3mg/mlBSA)中清洗2-3次后放入平衡好的受精液中(放入量为每50 μ I受精液，15枚卵母细胞)，未添加CNP的前成熟液培养的卵母细胞为对照；然后采用上浮法处理冷冻精液，精子在洗精液(Β0液+20ug/ml 肝素钠+6mg/ml BSA)上浮 20_30min，之后取上清 600-800 μ I 放入 I. 5ml离心管离心(1500转，离心5min) 2次，离心后除去上清加入洗精液最终体积为250 μ 1，取50 μ I处理后的精液加入已放入卵母细胞的受精液中，精子终浓度为I X IO6精子/ml，培养条件为5%C02的空气，温度39 °C，饱和湿度，受精时间为8h。(2)体外胚胎生产受精后的合子在前期发育液(CRl液+6mg/ml BSA, 2ml)洗涤3次后采用四孔板两步法培养首先在500 μ I前期发育液(50枚左右合子)培养2d，计数卵裂胚胎后移入500 μ I后期发育液(CRl液+10%FBS)培养5d，间隔2d半量换液，培养条件为5%C02的空气，温度39°C，饱和湿度，胚胎发育第7天计数囊胚数。结果见表2、表3。表2C型钠肽前处理后对体外牛卵母细胞受精后胚胎卵裂率的影响
权利要求
1.一种牛卵母细胞体外成熟培养液,其特征在于，以常规培养液为基质，所述基质中含有C型钠肽。
2.根据权利要求2所述的牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述体外成熟培养液每IOOOmL组成为 C型钠肽200nM， TCM199 补足至 1000mL。
3.一种利用权利要求I或2所述牛卵母细胞体外成熟培养液促进牛卵母细胞的体外成熟培养方法，包括以下步骤 1)采集牛卵母细胞； 2)将牛卵母细胞在所述牛卵母细胞体外成熟培养液中培养； 3)牛卵母细胞体外成熟培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤I)中所述牛卵母细胞为卵丘-卵母细胞复合体。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述培养的时间为6h。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述培养的培养液为含有FSH10 μ g/ml, LH I μ g/ml, E2I μ g/ml, EGFlOng/ml, 10%FBS 的 TCM199 培养液。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述培养的时间为24-28h。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述成熟培养的卵母细胞还用于体外受精或体外胚胎生产。
9.C型钠肽在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用。
10.C型钠肽在制备用于促进牛卵母细胞体外成熟药物/减数分裂抑制剂药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及C型钠肽在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用。本发明提供一种牛卵母细胞体外成熟培养液，以常规培养液为基质，所述基质中含有C型钠肽。本发明通过CNP体外抑制牛卵母细胞减数分裂，前成熟处理后促进了卵母细胞核成熟和胞质成熟同步，提高了体外发育能力，能够成为新型的减数分裂抑制剂药物在畜牧业生产上推广应用，加速良种选育及扩繁技术体系。本发明CNP作为生物活性的肽类物质，对卵母细胞的毒害作用小于化学合成的减数分裂抑制物质。
文档编号C12N5/073GK102899286SQ20121034828
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者田见晖, 贾振伟, 张家新, 安磊, 吴中红 申请人:中国农业大学