专利名称：：一种用于副溶血性弧菌分子分型的分子马达生物传感器试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属于一种对副溶血性弧菌的致病性进行快速分子分型判断的试剂盒，具体地说是用试剂盒中的FtlF1-ATPase分子马达生物传感器Chro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh>Chro-toxR对副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的种特异性基因tlh、toxR和毒力基因tdh、trh进行检测,从而对V.parahaemolyticus是否具有致病性做出判断。
背景技术：
：V.parahaemolyticus是沿海地区常见的一种食源性致病菌,可导致患者腹湾、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。近年来，其引发的食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势。因此，V.parahaemolyticus的危害性不容忽视。尽管大多数的V.parahaemolyticus不会导致人类生病，但仍有一定特征的V.parahaemolyticus可以引起人类的疾病。已有研究表明，致病性的V.parahaemolyticus都能产生一种溶血素，即耐热性溶血毒素(Thermostabledireethemolysin,TDH)或TDH相关溶血毒素(TDHrelatedhemolysin,TRH)或两者都有，分别由tdh和trh基因编码。分子流行病学证据支持tdh、trh与肠胃炎的关系,证明tdh、trh都是V.parahaemolyticus的毒力基因。因此，对这两种基因的检测研究对于了解V.parahaemolyticus的流行趋势、预防与治疗食物中毒具有重要意义。另外，不耐热溶血素基因tlh及toxR普遍存在于临床和环境中的V.parahaemolyticus中，很多研究将其作为检测V.parahaemolyticus的种特异性基因。为了便于进行临床诊断、流行病学调查、食品中微生物检测及医院感染监控，微生物的分型与检测研究是必不可少的内容。目前，随着分子生物学的发展以及与流行病学的密切结合，分子分型技术以其敏感性高、特异性强、分型率和分辨率高等优点，在流行病学调查、食物中毒的预警和溯源、食源性疾病的诊断以及微生物的检测等方面发挥了重要的作用，并逐步替代了传统的生化分型和血清学分型技术，如重复序列PCR(rep-PCR)、随机扩增多态性DNA分析技术(RAPD)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、多位点序列分析(MLST)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)等。然而，上述方法操作起来都比较繁琐，程序比较复杂。因此，在上述分子分型方法的优点基础上，开发一种操作简便、价格低廉的分子分型方法将具有重要意义。
发明内容本发明以V.parahaemolyticus毒力基因tdh、trh和种特异性基因tlh、toxR为革巴基因设计4个探针，通过“ε亚基抗体-链霉素-生物素-探针”系统将探针与FtlF1-ATPase分子马达连接构建FtlF1-ATPase分子马达生物传感器，进而与相应辅助试剂配套构建分子马达生物传感器分子分型试剂盒，对致病性V.parahaemolyticus进行分型及检测研究,从而建立致病性V.parahaemolyticus的分子马达分子分型方法，为V.parahaemolyticus的快速分型和溯源提供技术基础。本发明所米用的技术方案为以V.parahaemolyticus毒力基因tdh、trh和种特异性基因tlh、toxR为靶基因设计4个探针，首先将生物素标记的ε亚基抗体结合在FtlF1-ATPase的ε亚基上，然后用链霉亲和素(Sti^ptavidin)与ε亚基抗体上的生物素结合，最后将生物素标记的探针与链霉亲和素结合，构建FtlF1APase分子马达生物传感器，对目标V.parahaemolyticus的DNA进行检测，从而对V.parahaemolyticus的致病性做出快速判断。一方面，对种特异性基因tlh和toxR的检测可以对目标菌进行鉴定；另一方面，对tdh和trh的检测可以对目标菌的致病性做出判断。利用F0F1-ATPase作为载体对目标物进行检测具有快速、灵敏度高、特异性强的特点。在FtlF1-ATPase分子马达上连接特异的核酸探针，可以实现对目标基因快速、高特异性、高通量的检测。本发明涉及的V.parahaemolyticus的分子马达生物传感器分子分型试剂盒,包括以下试剂副溶血性弧菌分子分型试剂盒组成权利要求1.一种基于分子马达生物传感器技术的副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)分子分型试剂盒，其特征在于包括以下组分2.根据权利要求I所述的V.parahaemolyticus的分子马达生物传感器分子分型试剂盒，其特征在于分子马达生物传感器的构建，包括(1)载色体(Chromatophore)的制备从玫瑰红嗜热菌(Thermomicrobiumroseum)中提取载色体，FtlF1-ATPase存在于载色体上。FtlF1-ATPase—般由8个亚基组成，分别为α3β3γδεab2cn，是一种可旋转分子马达。(2)F-DHPE标记载色体F-DHPE是一种脂染料探针，可以嵌入到磷脂分子层中。同时F-DHPE也是一种pH指示剂，将其嵌入磷脂双分子层可以用来测量磷脂层外面的PH变化。在pH7.0-9.O范围内，F-DHPE的荧光强度与pH值呈正相关。本发明将F-DHPE标记到分子马达载色体磷脂分子层中用以指示FtlF1-ATPase合成ATP的效率。(3)生物素标记ε亚基抗体用生物素(biotin-AC5-Sulfo_0s)标记ε亚基抗体N端。(4)探针合成及标记以V.parahaemolyticus种特异性基因tlh、tdh和毒力基因trh、toxR为模板设计探针，并用生物素(biotin-AC5-Sulfo-0s)标记探针5’端。一方面，对种特异性基因tlh和toxR的检测可以对目标菌进行鉴定；另一方面，对tdh和trh的检测可以对目标菌的致病性做出判断。探针序列如下表V.parahaemolyticus毒力基因及种特异性基因探针序列3.根据权利要求I所述的V.parahaemolyticus的分子马达生物传感器分子分型试剂盒，应用其进行分子分型，其特征是依次包括以下步骤(1)细菌的培养及DNA的提取(2)用分子马达生物传感器进行分子分型①取4个I.5mLEP管，各加入待测样本10μL。将EP管放入沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却；②分别取2μLChro-tlh、Chro-tdh>Chro-trh>Chro-toxR,用合成buffer稀释到一定的倍数。取稀释后的生物传感器分别加入上述EP管；③阴性对照用10μL无菌水代替DNA提取液进行。另取I个EP管加入10μL无菌水，沸水浴中加热3min,然后立即转移到冰上至完全冷却，再加入10μL合成buffer作为本底对照，短暂振荡使反应体系混匀；④向上述EP管中分别加入30μL启动buffer(由ADP和上述合成buffer配置，体积比I:3)，振荡使反应体系混匀，然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠；⑤将上述反应体系放入37°C恒温摇床中温育30min，然后将EP管从摇床中取出，分别加入450μLPBS缓冲液，振荡使体系混匀；⑥取一块干净的96孔板，将各管中的最终反应体系加入其中，每个体系加3孔，每孔加样50μL,然后对每个加样孔分别加入30μL已配置好的荧光素酶溶液(将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡。使用前应将混合液在室温放置Ih)，用枪反复吹打几次使体系混匀；⑦将96孔板上机检测，读取各孔荧光值，对各组数据取平均值，然后用样本数值减去本底数值即为样本的实际荧光值；⑧将样本荧光值绝对值与H2O的阴性对照荧光值绝对值进行单因素方差分析，若差异显著(P<0.05)表示检出该基因；(3)分型判断检出种特异性基因tlh和toxR，可判断该菌为副溶血性弧菌；检出tdh或trh，或者两者都检出，可判断该菌携带毒力基因，具有致病性。全文摘要本发明属于一种对副溶血性弧菌的致病性进行快速分子分型判断的试剂盒，具体地说是用试剂盒中的F0F1-ATPase分子马达生物传感器Chro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR对副溶血性弧菌的种特异性基因tlh、toxR和毒力基因tdh、trh进行检测，从而对副溶血性弧菌是否具有致病性做出判断。一方面，对种特异性基因tlh和toxR的检测可以对目标菌进行鉴定；另一方面，对tdh和trh的检测可以对目标菌的致病性做出判断。方法包括试剂盒中F0F1-ATPase分子马达生物传感器的构建、用F0F1-ATPase分子马达生物传感器进行分子分型，最后根据分型结果对副溶血性弧菌的致病性做出判断。其优点在于灵敏度高、快速、操作简单、成本低廉。文档编号C12R1/63GK102936625SQ20121040608公开日2013年2月20日申请日期2012年10月23日优先权日2012年10月23日发明者张捷,李兆杰,王静,张惠媛,汪琦,张昕,顾德周,尚士进,陆琳,王佩荣,陈广全,乐加昌申请人:北京出入境检验检疫局,威海出入境检验检疫局