专利名称：一种蛋白酶生产工艺的制作方法
一种蛋白酶生产工艺技术领域
本发明属于酶生产技术领域，具体涉及一种利用地衣芽孢杆菌来生产蛋白酶的工艺。
背景技术：
目前，国内常采用技术水平较落后的固体发酵法来生产蛋白酶，其存在劳动强度大，生产环境条件差，染菌率高等弊端，产品多为固体粗制酶，仅能用于皮革、丝绸脱胶等少数行业，不能适应食品、饲料、洗涤剂等行业发展的需要。因而，食品、饲料、洗涤剂等对蛋白酶质量要求较高的行业普遍使用的是进口产品，其价格昂贵，增加了企业的生产成本。发明内容
本发明目的在于提供一种蛋白酶生产工艺，该工艺原料利用率高，蛋白酶品质好。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的。
一种蛋白酶生产工艺，其包括以下步骤1)种子培养将地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)接入斜面培养基在好氧条件下于30— 37°C培养24—30h，然后将培养好的斜面菌种接入种子培养基中，于30— 37°C恒温摇床培养32— 37h ;再把培养好的菌种接入一级种子培养基于31 — 38°C培养9. 5 — 13h ；2)发酵将培养好的一级种子接入发酵培养基于32—38°C培养31 — 35h ；3)提取蛋白酶将培养好的发酵液转入回收罐并向其中加入硅藻土和珍珠岩，搅拌均匀，经固液分离、超滤膜超滤处理及喷雾干燥后即得。
具体的，所述步骤I)中，斜面培养基组成为蛋白胨O. 3—0. 5%，牛肉膏O. 2— O. 3%，磷酸二氢钾O. 2—0. 5%，琼脂I. 5—1. 7%，pH自然。种子培养基组成为蛋白胨O. 3— O. 5%，牛肉膏O. 2—0. 3%，磷酸二氢钾O. 2—0. 5%，pH自然；一级种子培养基组成豆柏3— 5%,薯干粉 2. 4—3. 2%,麸皮 3. 6—3. 9%,磷酸氢二钠 O. 4—0. 6%,磷酸二氢钾 O. 03—0. 07%, 菜籽油O. 4一O. 8%, pH自然。
所述步骤2)中，发酵培养基组成豆柏3—5%，薯干粉2. 7—3. 5%，麸皮3. 8—4. 3%， 磷酸氢二钠O. 4—0. 6%，磷酸二氢钾O. 03—0. 07%，菜籽油O. 4—0. 8%，pH自然。
所述步骤3)中，硅藻土、珍珠岩的添加量均为发酵液重量的2—6% ;所用超滤膜的截留分子量为10000。
所述的蛋白酶生产工艺,具体步骤如下一、种子培养将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)接入斜面培养基在30— 37°C恒温培养箱中培养24— 30h，然后将培养好的斜面菌种接入(接种量2 — 5%)装有种子培养基的摇瓶中， 于 30— 37°C恒温摇床(转速 140— 150r/min)培养 32— 37h。
将一级种子培养基投入种子罐进行灭菌(121 123°C实消40 45分钟)，然后通风降温到31 — 38°C，将摇瓶培养好的菌种以I一5%的接种量接入一级种子培养基，保证罐压在O. 05—0. 08Mpa，风量在12 — 26m3/hr (发酵罐内的空气需进行杀菌过滤处理);温度控制在31— 38°C，210— 270 r /min培养9. 5 — 13h，镜检，确保成熟无杂菌转入发酵罐。
二、发酵将发酵培养基装入发酵罐进行灭菌(12fl23°c实消4(Γ45分钟)，然后通风降温到 32— 38°C。以5 — 8%的接种量，接入培养好的一级种子进行发酵，发酵时间31 — 35小时。
其中，在发酵过程中不同时间点的发酵温度如下所述时，效果较好0 — 2h于32— 38°C培养；2—IOh时，每小时升1°C，即到第IOh温度升至40—46°C;10—20h时，每小时降 1°C，即到第20h温度降至30—36°C。保证罐压O. 05—0. 08Mpa ;风量0 7小时190 — 2IOm3/ h,发酵液与风量比(m3 :m3/min，下同)为I 0. 45—0. 51 ;8 15小时风量250—280m3/h,发酵液与风量比为I :0. 59 — I. 63。第16小时左右泡沫开始升高，此时调节风量，16h至发酵结束，发酵液与风量比为I :0. 67 — O. 71，风量280— 300m3/小时。发酵结束时，酶活力最低约达到 32000U/ml。
发酵过程中，自第10 —12小时开始，每4小时取样测酶活力、PH、镜检菌形；第 23—26小时开始，每2小时一次 取样测酶活力、PH、镜检菌形。连续两次检测酶活力不上升， 镜检菌形50— 60%芽孢以上，温度上升缓慢或无上升趋势，即可结束发酵。
三、提取蛋白酶将培养好的发酵液转入回收罐并向其中加入硅藻土和珍珠岩，搅拌均匀，板框过滤，滤液为粗酶液，粗酶液经板框二次过滤处理，进一步除去细菌等杂质，所得滤液再经超滤膜超滤处理及喷雾干燥即可得到纯的蛋白酶。
蛋白酶检测方法依据GB/T23527-2009蛋白酶制剂进行。
采用本发明方法，发酵罐平均发酵水平37466u/mL，处于国内领先水平。本发明还把二次过滤和精滤除菌技术应用于酶的分离提取，开发出精制蛋白酶，填补了国内空白。
和现有技术相比，本发明优点I)研究开发了液体发酵法生产蛋白酶的工艺技术。在发酵工艺上，对产酶菌株的特性和产酶条件进行深入研究，采用稀醪发酵等工艺，缩短了发酵周期，提高了产酶水平，与传统的固体发酵工艺相比，该工艺技术具有产率高、原料利用率高、劳动强度小，便于工业化生产，生产过程不易受杂菌污染，酶系纯等显著优点。
2)在分离提取工艺上，采用二滤和精滤技术提高了收率和产品质量，成功开发出精制蛋白酶产品，填补国内不能生产精制液体蛋白酶的空白，并形成一套完整的深层液体发酵法生产蛋白酶的先进工艺技术，在35吨发酵罐的工业化生产中应用后，达到平均发酵单位37466u/mL，最高达42356 u/mL，产品总收率达80%以上。
3)采用本发明工艺所得蛋白酶产品性能稳定、质量可靠、价格适当可实现我国蛋白酶产品的升级换代，填补此类产品的空白，替代进口产品，满足国内市场的需求。
具体实施例方式下面通过优选实施例来详述本发明技术方案，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例I一种蛋白酶生产工艺，其包括以下步骤一、种子培养将地衣芽孢杆菌(BaciIIus licheniformis，购自上海市工业微生物研究所，商品编号B252)接入斜面培养基在30°C恒温培养箱中培养26h，然后将培养好的斜面菌种接入(2%) 装有种子培养基的摇瓶中，于30°C恒温摇床(转速140r/min)培养37h。
斜面培养基组成为蛋白胨O. 4%，牛肉膏O. 2%，磷酸二氢钾O. 3%，琼脂I. 6%，pH 自然。种子培养基组成为蛋白胨0.4%，牛肉膏0.3%，磷酸二氢钾0.4%，pH自然。
将一级种子培养基(组成豆柏3%，薯干粉2. 4%，麸皮3. 6%，磷酸氢二钠O. 4%，磷酸二氢钾O. 03%，菜籽油O. 5%，pH自然)投入种子罐进行灭菌(121 123°C实消40 45分钟)， 然后通风降温到38°C，将摇瓶培养好的菌种以2%的接种量接入一级种子培养基，保证罐压在O. 05Mpa，风量在12m3/h (发酵罐内的空气需进行杀菌过滤处理)；温度控制在38°C，210 r /min培养10h，镜检，确保成熟无杂菌转入发酵罐。
二、发酵将发酵培养基(组成豆柏3%，薯干粉2. 7%，麸皮3. 8%，磷酸氢二钠O. 4%，磷酸二氢钾O.03%，菜籽油O. 5%，pH自然)装入发酵罐进行灭菌(121 123°C实消40 45分钟)，然后通风降温到38°C。以8%的接种量，接入培养好的一级种子进行发酵，发酵33小时。
三、提取蛋白酶将培养好的发酵液转入回收罐并向其中加入娃藻土和珍珠岩(娃藻土、珍珠岩的添加量分别为发酵液重量的2%和3%)，搅拌均匀，板框过滤，滤液为粗酶液，粗酶液经板框二次过滤处理，进一步除去细菌等杂质，所得滤液再经截留分子量为10000的超滤膜(型号 PES10-8040，下同)超滤处理后喷雾干燥即可得到符合GB/T23527-2009要求、酶活力为 150000u/g左右的蛋白酶。
实施例2一种蛋白酶生产工艺，其包括以下步骤一、种子培养将地衣芽孢杆菌(BaciIIus licheniformis，购自上海市工业微生物研究所，商品编号 B252)接入斜面培养基在32°C恒温培养箱中培养28h，然后将培养好的斜面菌种接入(3%) 装有种子培养基的摇瓶中，于32°C恒温摇床(转速145r/min)培养35h。
斜面培养基组成为蛋白胨O. 45%，牛肉膏O. 25%，磷酸二氢钾O. 4%，琼脂I. 65%， pH自然。种子培养基组成为蛋白胨O. 45%，牛肉膏O. 25%，磷酸二氢钾O. 45%，pH自然。
将一级种子培养基(组成豆柏4%，薯干粉2. 6%，麸皮3. 7%，磷酸氢二钠O. 5%，磷酸二氢钾O. 05%，菜籽油O. 6%，pH自然)投入种子罐进行灭菌(121 123°C实消40 45分钟)， 然后通风降温到36°C，将摇瓶培养好的菌种以4%的接种量接入一级种子培养基，保证罐压在O. 06Mpa，风量在18m3/h (发酵罐内的空气需进行杀菌过滤处理)；温度控制在36°C，240 r /min培养12h，镜检，确保成熟无杂菌转入发酵罐。
二、发酵将发酵培养基(组成豆柏4%，薯干粉3. 0%，麸皮4. 0%，磷酸氢二钠O. 5%，磷酸二氢钾O.05%，菜籽油O. 6%，pH自然)装入发酵罐进行灭菌(121 123°C实消40 45分钟)，然后通风降温到36°C。以6%的接种量，接入培养好的一级种子进行发酵，发酵34小时。
三、提取蛋白酶将培养好的发酵液转入回收罐并向其中加入娃藻土和珍珠岩(娃藻土、珍珠岩的添加量分别为发酵液重量的3%和3. 5%)，搅拌混匀后板框过滤，滤液为粗酶液，粗酶液经板框二次过滤处理，进一步除去细菌等杂质，所得滤液再经截留分子量为10000的超滤膜超滤处理及喷雾干燥即可得到符合GB/T23527-2009要求、酶活力为200000u/g左右的蛋白酶。
实施例3一种蛋白酶生产工艺，其包括以下步骤一、种子培养将地衣芽孢杆菌(BaciIIus licheniformis，购自上海市工业微生物研究所，商品编号 B252)接入斜面培养基在35°C恒温培养箱中培养30h，然后将培养好的斜面菌种接入(4%) 装有种子培养基的摇瓶中，于35°C恒温摇床(转速150r/min)培养32h。
斜面培养基组成为蛋白胨O. 5%，牛肉膏O. 3%，磷酸二氢钾O. 5%，琼脂I. 7%，pH 自然。种子培养基组成为蛋白胨0.5%，牛肉膏0.2%，磷酸二氢钾0.5%，pH自然。
将一级种子培养基(组成豆柏5%，薯干粉3. 0%，麸皮3. 8%，磷酸氢二钠O. 6%，磷酸二氢钾O. 06%，菜籽油O. 7%，pH自然)投入种子罐进行灭菌(121 123°C实消40 45分钟)， 然后通风降温到32°C，将摇瓶培养好的菌种以5%的接种量接入一级种子培养基，保证罐压在O. 08Mpa，风量在24m3/h (发酵罐内的空气需进行杀菌过滤处理)；温度控制在32°C，260 r /min培养13h，镜检，确保成熟无杂菌转入发酵罐。
二、发酵将发酵培养基(组成豆柏5%，薯干粉3. 2%，麸皮4. 2%，磷酸氢二钠O. 6%，磷酸二氢钾 O. 06%，菜籽油O. 7%，pH自然)装入发酵罐进行灭菌(121 123°C实消40 45分钟)，然后通风降温到32°C。以5%的接种量，接入培养好的一级种子进行发酵，发酵32小时。
三、提取蛋白酶将培养好的发酵液转入回收罐并向其中加入娃藻土和珍珠岩(娃藻土、珍珠岩的添加量分别为发酵液重量的5%和4%)，开启搅拌，混匀后经板框过滤，滤液为粗酶液，粗酶液经板框二次过滤处理，进一步除去细菌等杂质，所得滤液再经截留分子量为10000的超滤膜超滤处理及喷雾干燥即可得到符合GB/T23527-2009要求、酶活力为100000u/g左右的蛋白酶。
权利要求
1.一种蛋白酶生产工艺，其特征在于，包括以下步骤1)种子培养将地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)接入斜面培养基在好氧条件下于30— 37°C培养24— 30h，然后将培养好的斜面菌种接入种子培养基中，于30— 37°C恒温摇床培养32— 37h ;再把培养好的菌种接入一级种子培养基于31 — 38°C培养9. 5 — 13h ；2)发酵将培养好的一级种子接入发酵培养基于32—38°C培养31—35h ；3)提取蛋白酶将培养好的发酵液转入回收罐并向其中加入硅藻土和珍珠岩，搅拌均匀，经固液分离、超滤膜超滤处理及喷雾干燥即得。
2.如权利要求I所述的蛋白酶生产工艺，其特征在于，所述步骤I)中，斜面培养基组成为蛋白胨O. 3—0. 5%，牛肉膏O. 2—0. 3%，磷酸二氢钾O. 2—0. 5%，琼脂I. 5—1. 7%，pH 自然；种子培养基组成为蛋白胨O. 3—0. 5%，牛肉膏O. 2—0. 3%，磷酸二氢钾O. 2—0. 5%， pH自然；一级种子培养基组成豆柏3 — 5%，薯干粉2. 4—3. 2%，麸皮3. 6—3. 9%，磷酸氢二钠 O. 4—0. 6%，磷酸二氢钾 O. 03—0. 07%，菜籽油 O. 4—0. 8%, pH 自然。
3.如权利要求I所述的蛋白酶生产工艺，其特征在于，所述步骤2)中，发酵培养基组成豆柏3 — 5%，薯干粉2. 7—3. 5%，麸皮3. 8—4. 3%，磷酸氢二钠O. 4—0. 6%，磷酸二氢钾 O. 03—0. 07%，菜籽油 O. 4—0. 8%, pH 自然。
4.如权利要求I所述的蛋白酶生产工艺，其特征在于，所述步骤3)中，硅藻土、珍珠岩的添加量均为发酵液重量的2—6% ;所用超滤膜的截留分子量为10000。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白酶生产工艺，其包括以下步骤1)种子培养将地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)接入斜面培养基在好氧条件下于30—37℃培养24—30h，然后将培养好的斜面菌种接入种子培养基中，于30—37℃恒温摇床培养32—37h；再把培养好的菌种接入一级种子培养基于31—38℃培养9.5—13h；2)发酵将培养好的一级种子接入发酵培养基于32—38℃培养31—35h；3)提取蛋白酶将培养好的发酵液转入回收罐并向其中加入硅藻土和珍珠岩，搅拌均匀，经固液分离、超滤膜超滤处理及喷雾干燥即得。采用该工艺收率高，所得蛋白酶品质好。
文档编号C12N9/56GK102911925SQ20121044598
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年5月21日
发明者常东民, 孙利鹏, 管宁 申请人:河南仰韶生化工程有限公司