高山被孢霉的分离的新菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及高山被孢霉(Mortierella?Alpina)的分离的新菌株及其应用。具体地，本发明涉及高山被孢霉CGMCC?No.6254、其子代、培养物和/或突变株以及利用所述菌株、其子代、培养物和/或突变株生产花生四烯酸的方法和用途。本发明的分离的菌株为天然菌株，能够稳定高产花生四烯酸，其花生四烯酸的产量高达14.32g/L。
【专利说明】高山被孢霉的分离的新菌株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高山被孢霉(Mortierella Alpina)的分离的菌株或其子代、培养物或突变株以及利用所述菌株或其子代、培养物或突变株来制备花生四烯酸的方法和用途。
【背景技术】
[0002]花生四烯酸(Arachidonic Acid，简称AA或ARA)的化学名称为5,8，11，14-二十碳四烯酸，属于ω-6系列的长链多不饱和脂肪酸(PUFA)，是人体最重要、含量最丰富的二十碳多不饱和脂肪酸。AA具有酯化胆固醇、抑制血小板聚集、增加血管弹性、降低血液粘度、调节白细胞功能、提高免疫力等一系列生理活性。AA还是许多具有重要生理调节功能的二十碳烯酸衍生物的直接前体。AA的营养保健功能体现在婴幼儿生长发育(特别是婴幼儿智力及视神经发育)、孕产妇营养、心脑血管疾病、糖尿病、肿瘤等各个方面。
[0003]尽管AA对人体很重要，但是它不能在人体从头合成，大部分AA必需靠饮食来提供。过去商业AA主要来源于鱼油、猪肝和蛋黄，但含量极低且不稳定，开发费用昂贵，难以满足社会的需求。而且鱼油中含有大量二十碳五烯酸(EPA)，其在婴儿体内会抑制AA合成，所以提供的AA中最好不含ΕΡΑ。
[0004]由于微生物具有生长速度快、油脂及AA含量高、发酵制备工艺比较简单且不受原料限制等优点，所以利用微生物生产花生四烯酸成为世界各国研究的热点，其中主要使用高山被孢霉。但是，目前的高山被孢霉菌株的AA产量仍然不能满足工业生产的要求。而且，众多研究中所用的菌株多由低产的天然菌株经过诱变而得，虽然产量得以提高，但在使用过程中，存在一定的不确定因素。众所周知，诱变菌株较天然筛选菌株遗传稳定性差，容易发生回复突变。对此，国际食品法典委员会(CAC)在“食品的益生菌的指导原则(Guidelines for the Evaluation of Probiotics in food) ” 中明确指出，对于用于食品的益生菌而言，不能对其进行全系统感染、不能存在毒性代谢、不能存在个体免疫缺陷，也不能对其进行基因改造。因此，在食品安全方面，采取天然菌株是本领域公知的安全可靠的做法。
[0005]因此，本领域亟需能够高产花生四烯酸的天然菌株。
【发明内容】
[0006]本发明通过提供一种高山被孢霉的分离的菌株、其子代、培养物和/或突变株来解决本领域中的上述问题。
[0007]在第一方面，本发明公开了一种高山被孢霉的分离的菌株，其是于2012年6月21日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、保藏编号为CGMCCN0.6254的高山被孢霉或其子代。
[0008]进一步地，本发明还涉及上述分离的菌株的培养物和突变株。
[0009]在第二方面，本发明涉及一种生产花生四烯酸的方法，所述方法包括:用本发明的高山被孢霉菌株CGMCC N0.6254或其子代、培养物或突变株在发酵培养基中进行发酵；以及收获发酵后的微生物并提取花生四烯酸。
[0010]本发明进一步涉及一种生产花生四烯酸的方法，所述方法包括:将本发明的高山被孢霉菌株CGMCC N0.6254或其子代、培养物或突变株接种于种子培养基中以获得种子培养物；将所述种子培养物接种于发酵培养基中进行发酵；以及收获发酵后的微生物，任选烘干，并提取花生四烯酸。
[0011]在第三方面，本发明涉高山被孢霉菌株CGMCC N0.6254或其子代、培养物或突变株在生产花生四烯酸中的用途。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1示出本发明的高山被孢霉菌株CGMCC N0.6254菌株在固体培养基(PDA)上的生长形态，其在固体培养基中产生大量黄色孢子。
[0013]图2a示出高山被孢霉CBS343.4在固体培养基(PDA)上的生长形态，其在固体培养基中仅产生白色棉花状菌丝体。
[0014]图2b示出高山被孢霉ATCC 32222在固体培养基(PDA)上的生长形态，其在固体培养基中产生大量白色棉花状菌丝体，有少量黄色孢子出现。
[0015]图3示出高山 被孢霉CGMCC N0.6254的ITS序列分析的系统树。
【具体实施方式】
[0016]除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域(如细胞培养、微生物学和生物化学)普通技术人员的通常理解具有相同的含义。
[0017]在第一方面，本发明公开了一种高山被孢霉的分离的菌株，其于2012年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCN0.6254。
[0018]所述高山被孢霉菌株CGMCC N0.6254是未经任何人工诱变且可高产花生四烯酸的天然菌株，产量高达14.32g/L。
[0019]本文所用的术语“花生四烯酸”是具有以下结构的5，8，11，14-二十碳四烯酸或者其药学或生理学可接受的盐、酯或衍生物:
[0020]
O
Jl
H3COH
[0021]本文所用的术语“人工诱变”指通过包括但不限于物理、化学或生物学方法在内的任何人为手段使得突变发生的频率高于自然界中自发突变的频率。
[0022]本文所用的术语“天然菌株”指在天然状态下存在于自然界中的细菌、真菌或霉菌及其子代、繁殖或营养形式等，例如孢子、菌丝或菌丝体等。这样的菌株是未经人工干预或改造的，特别是未经人工诱变的。
[0023]本发明的高山被孢霉CGMCC N0.6254从新疆赛里木湖山坡的土壤中筛选获得，其形态特征为:在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基中，于25°C下培养7天，菌落为白色菌丝、花瓣状、单菌落的直径为3-6cm、产黄色孢子。显微镜观察，菌丝直径为2-8 μ m。
[0024]本发明的高山被孢霉菌株可以在本领域用于培养高山被孢霉的常用条件和培养基中生长和维持(例如，参见表1)。在一实施方案中，本发明的高山被孢霉菌株可以使用的培养条件包括但不 限于:温度为5-30°C，例如20-28°C、20-25°C或20_22°C;pH值为4_9，例如 6.0_7.0 ο
[0025]表1:常用的一些高山被孢霉培养条件和培养基 [0026]
【权利要求】
1.一种高山被孢霉(Mortierella Alpina)的分离的菌株,其是于2012年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCC N0.6254的菌株或其子代。
2.权利要求1的菌株的培养物。
3.权利要求1的菌株的突变株，其产生花生四烯酸的能力与保藏编号为CGMCCN0.6254的菌株基本上相同或更高。
4.一种生产花生四烯酸的方法，所述方法包括: (a)用权利要求1的菌株、权利要求2的培养物或权利要求3的突变株在发酵培养基中进行发酵；以及 (b)收获发酵后的微生物并提取花生四烯酸。
5.权利要求4的方法，其中(a)的发酵温度为20-28°C。
6.权利要求4的方法，其中(a)的发酵的pH值为4-9。
7.权利要求4的方法，其中(a)的发酵时间为7-15天。
8.权利要求4的方法，其中(a)的发酵在需氧条件下进行。
9.权利要求4-8任一项的方法，所述方法包括在(a)之前将权利要求1的菌株、权利要求2的培养物或权利要求 3的突变株在种子培养基中培养以获得种子培养物的步骤。
10.一种生产花生四烯酸的方法，所述方法包括: -将权利要求1的菌株、权利要求2的培养物或权利要求3的突变株在种子培养基中培养1-4天，获得种子培养物； -将所述种子培养物接种于发酵培养基中，在pH 6.0-7.0、20-25°C下发酵11-14天；以及 -收获发酵后的微生物，任选烘干，并提取花生四烯酸。
11.权利要求4-10任一项的方法,其中所述发酵培养基或所述种子培养基包含选自如下的氮源:豆饼粉、花生饼粉、牛肉膏、鱼粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆、硝酸盐(如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙)、铵盐(如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵)以及其任意组合。
12.权利要求4-11任一项的方法,其中所述发酵培养基或所述种子培养基包含选自如下的碳源:葡萄糖、淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮酸、富马酸、乙醇以及其任意组合。
13.权利要求9-12任一项的方法，其中所述种子培养基的组成为:葡萄糖:10-50g/L;酵母粉:l_10g/L ;磷酸二氢钾:l_6g/L ;硝酸钠:l_6g/L ；pH:6.0-7.0。
14.权利要求4-13任一项的方法，其中所述发酵培养基的组成为:葡萄糖:50-200g/L；酵母粉:5-15g/L ；KH2PO4:l-5g/L ；NaNO3:2_10g/L ；MgS04.7H20:0.l_2g/L ；pH:6.0-7.0。
15.权利要求1的菌株、权利要求2的培养物或权利要求3的突变株在生产花生四烯酸中的用途。
【文档编号】C12R1/645GK103805517SQ201210458932
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月14日 优先权日:2012年11月14日
【发明者】田桂尾, 姜翠红, 吴清杭, 常桂芳 申请人:丰益(上海)生物技术研发中心有限公司