专利名称：一种核酸疫苗、核酸疫苗免疫佐剂及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸疫苗免疫佐剂，即真核表达质粒PCDNA-1L-2和pcDNA-1L-4 对PRRSV核酸疫苗pcDNA-0RF5的免疫作用具有显著增强作用，可以作为该核酸疫苗的免疫佐剂。
背景技术：
目前对于PRRS的防控，免疫预防仍是主要措施。虽然不同毒株的弱毒疫苗和灭活疫苗相继上市，但灭活疫苗免疫效果的不稳定性，弱毒疫苗在存在着毒力返强及散毒的风险，因此开发安全有效的新型疫苗成了研究的重点。目前研究表明，核酸疫苗免疫后可使外源基因在动物体内表达，刺激机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫，尤其是能诱导产生细胞毒T细胞，对病毒、胞内寄生的细菌和寄生虫引起的传染病具有预防和治疗作用，且对不同血清型的毒株具有交叉保护性，因此核酸疫苗被誉为第三次疫苗革命。根据大量的关于PRRSV基因的研究，结果显示，PRRSV的0RF5基因是研制基因工程疫苗的首选材料，用含编码0RF5的质粒对猪进行免疫，可使猪产生抗0RF5的特异性中和抗体，且免于强毒攻击造成的全身性病毒血症和肺部病变。虽然核酸疫苗在试验研究中显示出了较好效果，但是其免疫效果还不太理想，而使用免疫佐剂是提高核酸疫苗免疫效果的一种重要手段，目前常用的免疫佐剂主要有细胞因子佐剂、协同刺激分子佐剂和CpG DNA序列佐剂，其中细胞因子是研究比较广泛的核酸疫苗佐剂，现已证实IL-1、IL-2、IL-4、和IL-18的白细胞介素具有良好的佐剂作用。发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种核酸疫苗免疫佐剂，即真核表达质粒 pcDNA-1L-2和pcDNA-1L-4，这种核酸疫苗免疫佐剂对PRRSV核酸疫苗pcDNA_0RF5的免疫作用具有显著增强作用，可以作为该核酸疫苗的免疫佐剂。
本发明的技术方案猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的免疫佐剂，包含真核表达质粒 pcDNA-1L-2 和 pcDNA-1L-4。
所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的免疫佐剂的制备方法(1)根据GenBank登录的猪IL-2基因mRNA序列和IL-4基因mRNA序列分别设计I对克隆IL-2和IL-4全基因引物，并在引物的5'端分别设计BamH I和EcoR I限制性内切酶位点，扩增长度分别为542bp和427bp ；(2)采集健康长白猪前腔静脉血外周血，进行淋巴细胞的分离与培养，提取总RNA，进行 RT-PCR扩增IL-2和IL-4基因并对目的基因进行回收纯化，目的基因与PMD19-T载体进行连接得到重组质粒，重组质粒转化、菌落PCR，重组质粒的抽提、酶切鉴定、DNA序列测定和分析，得到阳性质粒PMD19-T-1L-2和pMD19_T-1L_4 ；(3)获取真核表达载体pcDNA3.1 (+)，然后对pMD19-T-1L-2、pMD19-T-1L_4和真核表达载体pcDNA3.1 (+)进行双酶切、连接、转化、酶切鉴定和测序，最后构建经测序正确的真核表达质粒 pcDNA-1L-2 和 pcDNA-1L-4。
所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的制备方法，(1)根据GenBank上发表的PRRSVGuizhou-1 0RF5基因序列，设计一对扩增0RF5基因的特异性引物，并分别在引物的5'端设计BamH I和EcoR I限制性内切酶位点；扩增长度 603bp ；(2)将猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株病毒悬液接种于Marc-145细胞单层细胞， 待出现细胞病变时收获细胞，然后提取总RNA，进行RT-PCR扩增ORF基因，并对目的基因进行回收纯化，构建克隆载体PMD19-T-0RF5、酶切鉴定和测序；(3)获取真核表达载体pcDNA3.1 (+)，然后对pMD19-T-0RF5和真核表达载体 pcDNA3.1 (+)进行双酶切、连接、转化、酶切鉴定和测序，最后构建经测序正确的真核表达质粒 pcDNA-0RF5。
所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的免疫佐剂的制备方法中的引物序列如下IL_2上游引物(F) :5, - CGGGATCCC TCACAGTAACCTCAACTCCT -3 '、IL-2 下游引物(R) :5 ' -CGGAATTCGCCTGATACATTTAACATG AGAG-3 ' ;IL_4 上游引物(F):5 ' - CGGGATCCTTCATGGGTCTCACCTC _3 '、IL-4 下游引物(R) :5 '-CGGAATTCTCAGCTTCAACAC TTTGA -3/ 。
所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的制备方法中的引物序列如下0RF5 上游引物(F) 5/ - CGGGATCCATGTTGGGGAAGTGCT-3'、0RF5 下游引物 (R):5' - CGGAATTCCTAGAGACGACCCCATT-3'。
本发明的有益效果IL_4是由抗原或有丝分裂原诱导Th2细胞、嗜酸性粒细胞、 嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生，是Th2细胞受刺激后产生的主要细胞因子。IL-4具有重要的免疫功能，如能增强B细胞对T细胞的抗原提呈作用，增加B细胞与T细胞的相互作用， 调节B细胞的生长分化及其对抗原刺激的应答，包括增殖和分泌抗体，参与抗体类别转换， 诱导抗体从IgM向IgE、IgI或IgGl转换，以及IgG向IgE转换。IL- 4可以促进50%的休止T细胞进行分裂，使ThO细胞向Th2细胞分化，是Th2细胞分泌的自我调节生长因子，它还能增强巨噬细胞的抗原递呈能力及对肿瘤细胞的细胞毒作用。
猪IL-2分子佐剂促进细胞免疫应答的效果比猪IL-4分子佐剂好，这可能是由于 Thl型白细胞介素(IL-2)主要参与细胞介导免疫应答，Th2型白细胞介素(IL-4)通常参与 B细胞活化并调节抗体的产生，主要调节机体体液免疫应答，IL-4能抑制T细胞表达IL-2 受体。试验结果显示用纯化蛋白加免疫佐剂可以提高仔猪的抗体阳性率，质粒免疫和纯化蛋白免疫与猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXAl株)免疫的的仔猪抗体的阳性率相同，证明了 GP5蛋白具有良好的免疫效果，核酸疫苗和亚单位疫苗具有很大的研究潜力。也说明细胞因子IL-2和IL-4构建的真核表达质粒pcDNA-1L-2和pcDNA-1L-4合用作为猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸疫苗的免疫佐剂具有明显明显增强其免疫效果。具体实施例
为了验证本发明的效果进行了如下实验I材料与方法1.1病毒、细胞、细菌和实验动物
PRRSV病毒贵州分离株(PRRSV Guizhou-1株)由贵州大学动物生物技术中心实验室分离鉴定保存；Marc-145细胞，由中国兽药监察所宁宜宝研究员赠送，本实验室传代保存；ToplO感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞，购自TaKaRa公司；6 8周龄Balb/c小白鼠，购自贵阳医学院；长白猪(经ELISA检测PRRS抗体阴性)，购自贵州大学种猪场。1. 2主要试剂
克隆载体 PMD19-T vector、T4 DNA Ligase、限制性内切酶 BamH I 和 EcoR1、RNaseInhibitor,dNTPs,DL2000 DNA Marker,DL15000 DNA Marker,5 X RT Buffer,Taq DNA 聚合酶等，购自宝生物(大连)工程有限公司；TRIzol LS Reagent、SuperscriptTM III ReverseTranscriptase,购自 Invitrogen 公司；Gel Extraction Kit (50 X)试剂盒和 E. Z. N. A. TMPlasmid Mini Kit质粒提取试剂盒,购自OMEGA公司；pcDNA3.1 (+)真核表达载体,本实验室保存；猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXAl株)，购自中牧生物药业有限公司；猪高免血清由贵州省疫病研究室制备；LSI猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒；购自北京祥龙环宇生物技术有限公司；Rat Ant1-Mouse CD3-SPRD，Rat Ant1-Mouse CD4/L3T4-FITC，Rat Ant1-Mouse CD8a/Ly-2-PE, Mouse Ant1-Porcine CD3-SPRD, Mouse Ant1-PorcineCD8a-PE，Mouse Ant1-Porcine CD4a_FITC，购于SBA ;引物由宝生物(大连)工程有限公司合成。1. 3引物设计
根据GenBank登录的猪IL-2基因mRNA序列(登录号X58428)、IL-4基因mRNA序列(登录号NM-214123.1)和PRRSV Guizhou-1 0RF5基因序列(登录号EU259060)，应用DNAStar软件，设计了 3对引物，用于扩增IL-2、IL-4和PRRSV 0RF5目的基因，并在上下游引物的5'端分别设计BamH I和EcoR I限制性内切酶位点，引物的序列(见表I)。
表I引杓字刃
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权利要求
1.猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因核酸疫苗PCDNA-0RF5的免疫佐剂，其特征在于包含核表达质粒pcDNA-1L-2和pcDNA-1L-4。
2.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的免疫佐剂的制备方法，其特征在于 (1)根据GenBank登录的猪IL-2基因mRNA序列和IL-4基因mRNA序列分别设计I对克隆IL-2和IL-4全基因引物，并在引物的5'端分别设计BamH I和EcoR I限制性内切酶位点，扩增长度分别为542bp和427bp ； (2)采集健康长白猪前腔静脉血外周血，进行淋巴细胞的分离与培养，提取总RNA，进行RT-PCR扩增IL-2和IL-4基因并对目的基因进行回收纯化，目的基因与PMD19-T载体进行连接得到重组质粒，重组质粒转化、菌落PCR，重组质粒的抽提、酶切鉴定、DNA序列测定和分析，得到阳性质粒PMD19-T-1L-2和pMD19_T-1L_4 ； (3)获取真核表达载体pcDNA3.1 (+)，然后对pMD19-T-1L-2、pMD19-T-1L-4和真核表达载体pcDNA3.1 (+)进行双酶切、连接、转化、酶切鉴定和测序，最后构建经测序正确的真核表达质粒 pcDNA-1L-2 和 pcDNA-1L-4。
3.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的制备方法，其特征在于 (1)根据GenBank上发表的PRRSVGuizhou-1 0RF5基因序列，设计一对扩增0RF5基因的特异性引物，并分别在引物的5'端设计BamH I和EcoR I限制性内切酶位点；扩增长度603bp ； (2)将猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株病毒悬液接种于Marc-145细胞单层细胞，待出现细胞病变时收获细胞，然后提取总RNA，进行RT-PCR扩增ORF基因，并对目的基因进行回收纯化，构建克隆载体PMD19-T-0RF5、酶切鉴定和测序； (3)获取真核表达载体pcDNA3.1 (+)，然后对pMD19-T-0RF5和真核表达载体pcDNA3.1 (+)进行双酶切、连接、转化、酶切鉴定和测序，最后构建经测序正确的真核表达质粒 pcDNA-0RF5。
4.根据权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因核酸疫苗pcDNA-0RF5的免疫佐剂的制备方法，其特征在于引物序列如下IL_2上游引物(F) :5' - CGGGATCCCTCACAGTAACCTCAACTCCT -3 '、IL-2 下游引物(R) :5 ' -CGGAATTCGCCTGATACATTTAACATGAGAG-3' !比-斗上游引物^)^' - CGGGATCCTTCATGGGTCTCACCTC -3'、IL-4 下游引物(R):5' - CGGAATTCTCAGCTTCAACAC TTTGA -3/ 。
5.根据权利要求3所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因核酸疫苗pCDNA-0RF5的制备方法，其特征在于引物序列如下0RF5上游弓丨物(F):5 ' - CGGGATCCATGTTGGGGAAGTGCT-3 '、0RF5 下游引物(R): 5 '-CGGAATTCCTAGAGACGACCCCATT-3'。
全文摘要
本发明公开一种猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因核酸疫苗pcDNA-ORF5的免疫佐剂，包含真核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4。细胞因子IL-2和IL-4构建的真核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4合用作为猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸疫苗的免疫佐剂具有明显明显增强其免疫效果。
文档编号C12N15/66GK103028114SQ20121058398
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者汤德元, 曾智勇, 李春燕, 马萍, 王彬, 刘霞, 陶玉顺 申请人:贵州大学