专利名称：单核细胞增生李斯特氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于致病微生物检测技术领域，具体涉及一种利用切刻内切酶恒温扩增(NEMA)技术进行菌样的快速检测的方试剂盒及其应用。
背景技术：
1929年，Nyfeldt第一次从病人体内分离出单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)，它是一种重要的人畜共患病和食源性疾病的病原菌。李斯特菌病的发病率很低，但是致死率高达20 % 30 %，在新生儿和免疫低下的人群中更高达70 %。单核细胞增生李斯特氏菌在自然界中分布广泛，研究表明，由单核细胞增生李斯特氏菌引起的食物中毒主要发生在水分活度较高的食品当中，例如，肉类、禽类、乳及乳制品、水产品等。其中，乳制品的污染率为5% 10%，肉及肉制品的污染率为30%，家禽的污染率为15%，水产品的污染率为4% 8%。该菌在我国被列为21世纪影响中国人健康的十二种病原微生物之一。在2000年，WHO食品安全工作计划提出将单核细胞增生李斯特氏菌列为重点检控的食源性致病菌之一。因此，需要建立一种有效的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种单核细胞增生李斯特氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒及其检测方法，以克服现有技术的不足，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。本发明的主要原理如下:
(I)设计一对5'端带切刻内切酶识别序列的引物和一对分别由生物素和FITC标记的探针；(2)把引物和目标菌的模板DNA加入到模板预处理反应液，在Taq Platinum DNA聚合酶作用下，通过几个预变性和扩增的循环过程，把切刻内切酶识别序列引入到待扩增序列中，作为NEMA恒温扩增的模板；(3)切刻内切酶识别NEMA模板上的识别序列，在其中一条核酸链上切割形成切
口，暴露其3'端；(4)在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下，以暴露的3'端为起点，以未被切断的另一条核酸链为模板，合成新的双链核酸，旧链被剥离下来成为下一轮核酸合成的模板，同时在新合成的双链核酸上恢复切刻内切酶识别位点；(5)切割、延伸和剥离的步骤重复进行，扩增出大量靶核酸序列；(6)扩增产物利用通用型核酸扩增物快速检测板检测。核酸扩增完成后，在反应管中加入探针与扩增产物杂交。把检测板水平放置在操作台上，取杂交产物10 μ L加入检测板的样品孔中，再加入100 μ L缓冲液进行层析，IOmin
左右判读结果。
通用型核酸扩增物快速检测板的上C为质控区，T为检测区。检测板在质控区C和检测区T均出现红色条带，为阳性结果，表明样本中含有检测的目标物；仅在质控区C出现红色条带，为阴性结果，表明样本中为检出目标物；质控区C和检测区T内均无红色条带出现，表明快速检测板失效。本发明的一个方面涉及单核细胞增生李斯特氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测的引物及探针，其中正向引物序列为SEQ ID N0:1:5-GCAAAACCTGGTGATGCTCTTCTCTTTGACTATGGTAGCGGAAT-3 ;反向引物序列为 SEQ IDNO:2:5-GCTGTCTAGATATAGCTCTTCGCCAGAGCCGTGGATGTTA-3。其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；Pl探针的序列为SEQ ID NO:3:PI: 5-TGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACG-3 5 端标记生物素；P2探针的序列为SEQ ID NO:4:P2:5-GTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTG-3 3 端标记 FITC。本发明的另一个方面涉及一种单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒，包括如下的组分:(I)模板预处理反应液:其中包括IOXTaq Platinum buffer II 反应缓冲液，0.1 1.0mmol/I,dNTP, 0.1 1.0 μ mol/L 正向引物，0.1 1.0 μ mol/L 反向引物，Taq Platinum DNAPolymerase2.5U ；所述的IOXTaq Platinum buffer II 反应缓冲液成分为:200mM Tris-HClρΗ8.8，IOOmM KCl，IOOmM(NH4)2SO4, 20mM MgCl2 ；(2) NEMA恒温扩增反应液:包括IOXNEBuffer 3 反应缓冲液，0.1 1.0mmol/L dNTP，5 % 30 % DMS0，
0.1 1.0 μ mol/L正向引物，0.1 1.0 μ mol/L反向引物和100 μ g/mL牛血清蛋白(BSA)；其中所述的10 X NEBuffer 3 反应缓冲液成分为:IOOmmoI/L NaCl，50mmol/T,Tri s-HCI , 10mmol /T, MgCl2, lmmol/L dithiothreitol pH 7.9 ；(3) Nt.BspQI 切刻内切酶:4υ/μ L ；(4) Bst DNA 聚合酶:2U/ μ L ;(5)5'端标记生物素探针Pl和3'端标记FITC的探针Ρ2各10 μ mol/L(6)通用型核酸扩增物快速检测板。型号:3号。上述试剂盒应用于检测食品中的单核细胞增生李斯特氏菌，其使用方法，依次包括下列步骤(1)-(4):
(I)待检样品或细菌DNA的提取:提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6 2.0范围内，浓度在
10 IOOng/ μ L范围内；(2)模板预处理:将装有23 μ L模板预处理反应液的反应管加入2 μ L待检模板DNA，于94°C水浴7min后迅速放入低于所检菌引物Tm值温度2°C的水浴中50s ;然后94°C水浴20s和低于所检菌引物Tm值温度2°C水浴50s，此过程反复进行5个以上循环；产物用于NEMA模板；(3) NEMA恒温扩增反应:在装有46 μ L NEMA扩增反应液的反应管中加入2 μ L预处理过的模板DNA，LOyLNt.BspQI切刻内切酶和1.0yL Bst DNA聚合酶后，迅速放入低于所检菌引物Tm值温度2°C的水浴中60min。反应结束后取出；(4)产物检测:反应结束后，反应管中加入探针Pl和P2各0.5 μ L，90°C水浴3min自然冷却至恒温，用通用型核酸扩增产物快速检测板检测产物。检测线T和质控线C均显示红色，说明待检样品为阳性。本发明的试剂盒根据待检菌株的保守基因序列设计5'端带切刻内切酶识别序列的引物，保证检测方法的特异性。本发明采用改进的切刻内切酶核酸恒温扩增(NEMA)技术，该技术特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用通用型核酸扩增物快速检测板检测即可，简单、快速、安全、无污染，特别适用于食品检测机构。
具体实施例方式下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，但实例仅限于说明，并不限于此，其中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。实施例1:对单 核细胞增生李斯特氏菌标准菌株的检测按下列配方制作单核细胞增生李斯特氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增试剂盒:I)模板预处理反应液:每23μ 含有 2.5μ 10 X Taq Platinum bufferll, 1.0 μ L 2.5mmol/L dNTP,1.0 μ LlO μ mol/L正向引物，l.0uL 10 μ mol/L反向引物，l.0uL 2.5U/ μ L Taq PlatinumDNAPloymerase 和 16.5 μ L ddH20 (灭菌双蒸水)。其中所述的正向引物SEQ ID NO:1:5-GCAAAACCTGGTGATGCTCTTCTCTTTGACTATGGTAGCGGAAT-3 ；反向引物:SEQID NO:2:5-GCTGTCTAGATATAGCTCTTCGCCAGAGCCGTGGATGTTA-3。其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；2) NEMA恒温扩增反应液:每46yL 含有 5yL IOXNEBuffer 3,1.0μ L 2.5mmol/L dNTP, l.0yL IOymol/L正向引物，1.0yL lOymol/L 反向引物，0.5yL 10mg/ml BSA,4y L DMSO 和 33.5 μ LddH20(灭菌双蒸水)。其中所述的正向引物SEQ ID NO:1:5-GCAAAACCTGGTGATGCTCTTCTCTTTGACTATGGTAGCGGAAT-3 ；反向引物:SEQID NO:2:5-GCTGTCTAGATATAGCTCTTCGCCAGAGCCGTGGATGTTA-3。其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；
3) Nt.BspQI 切刻内切酶:4υ/μ L ；4) Bst DNA 聚合酶:2U/ μ L ;5)探针 Pl 和 Ρ2:10 μ mol/L ;其中所述的探针Pl的序列为SEQ ID NO:35-TGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACG-3 5 端标记生物素；探针P2的序列为SEQ ID NO:4:5-GTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTG-3 3 端标记 FITC。6)核酸薄层层析检测板。型号:3号；按照以下(I)-(4)程序进行检测:(I)样品单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株ATCC 7644DNA的提取:将单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株ATCC 7644增菌培养后，提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA O D260/OD280在1.6 2.0范围内，浓度在10 IOOng/ μ L范围内。(2)模板预处理:将装有23 μ L模板预处理反应液的反应管加入2 μ L待检模板DNA，于94°C水浴7min后迅速放入60°C的水浴中50s ;然后94°C水浴20s和60°C水浴50s过程反复进行5个以上循环；产物用于NEMA模板。(3)进行NEMA恒温扩增反应:将装有46 μ L NEMA恒温扩增反应液的反应管中加入2 μ L预处理过的模板DNA，l.0yL Nt.BspQI切刻内切酶和1.0yL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57°C的水浴中60min。反应结束后取出；(4)产物检测:反应结束后，反应管中加入探针Pl和P2各0.5μ ，90τ:水浴3min自然冷却至恒温，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物。在质控区C和检测区T均出现红色条带，说明待检样品为单核细胞增生李斯特氏菌，并证明本发明的引物和探针在进行检测的时候不会产生假阴性。实施例2:对大肠埃希氏菌ATCC 25922的检测按下列配方制作单核细胞增生李斯特氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增试剂盒:I)模板预处理反应液:每23 μ L 含有 2.5 μ L 10XTaq Platinum buffer II> 1.0 μ L 2.5mmol/L Dntp,
1.0 μ LlO μ mol/L正向引物，1.0 μ L 10 μ mol/L反向引物，1.0 μ L 2.5U/ μ L Taq PlatinumDNAPloymerase 和 16.5 μ L ddH20 (灭菌双蒸水)。其中所述的正向引物SEQ ID NO:1:5-GCAAAACCTGGTGATGCTCTTCTCTTTGACTATGGTAGCGGAAT-3 ；反向引物:SEQID NO:2:5-GCTGTCTAGATATAGCTCTTCGCCAGAGCCGTGGATGTTA-3。其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；2) NEMA恒温扩增反应液:每46yL 含有 5yL IOXNEBuffer 3,1.0μ L 2.5mmol/L dNTP, l.0yL IOymol/L正向引物，1.0yL lOymol/L 反向引物，0.5yL 10mg/ml BSA,4y L DMSO 和 33.5 μ LddH20(灭菌双蒸水)。其中所述的正向引物SEQ ID NO:1:5-GCAAAACCTGGTGATGCTCTTCTCTTTGACTATGGTAGCGGAAT-3 ；反向引物:SEQID NO:2:5-GCTGTCTAGATATAGCTCTTCGCCAGAGCCGTGGATGTTA-3。其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；3) Nt.BspQI 切刻内切酶:4U/y L ；4) Bst DNA 聚合酶:2U/ μ L ;5)探针 Pl 和 Ρ2:10 μ mol/L ;其中所述的探针Pl的序列为SEQ ID NO:35-TGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACG-3 5 端标记生物素；探针P2的序列为SEQ ID NO:4:5-GTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTG-3 3 端标记 FITC。6)核酸薄层层析检测板。型号:3号；按照以下(1)-(4)程序进行检测:(I)待检样品(大肠埃希氏菌ATCC 25922)DNA的提取:提取待检样品大肠埃希氏菌ATCC 25922核酸，其中提取的样品DNA0D260/0D280在1.6 2.0范围内，浓度在10 IOOng/ μ L范围内。(2)模板预处理:将装有23 μ L模板预处理反应液的反应管加入2 μ L待检模板DNA，于94°C水浴7min后迅速放入60°C的水浴中50s ;然后94°C水浴20s和60°C水浴50s过程反复进行5个以上循环；产物用于NEMA模板。(3)进行NEMA恒温扩增反应:将装有46 μ L NEMA恒温扩增反应液的反应管中加入2μ L预处理过的模板DNA，l.0yL Nt.BspQI切刻内切酶和1.0yL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57°C的水浴中60min。反应结束后取出；(4)产物检测:反应结束后， 反应管中加入探针Pl和P2各0.5μ ，90τ:水浴3min自然冷却至恒温，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物。质控区C显示红色条带，检测区T无红色条带出现，说明待检样品不是单核细胞增生李斯特氏菌。这个结果也证实了本发明的引物和检测试剂盒在应用的时候不会产生假阳性。实施例3:对疑似感染单核细胞增生李斯特氏菌食品样品的检测将食品样品按照实施例1描述的方法进行DNA的提取和扩增检测，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物。结果质控区C显示红色条带，检测区T也有红色条带出现，说明待检样品受到了单核细胞增生李斯特氏菌的感染。本发明的引物、探针和试剂盒还可以对其它的样品进行单核细胞增生李斯特氏菌的检测。
权利要求
1.一种单核细胞增生李斯特氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测的引物及探针，其中: 正向引物序列为SEQ ID NO:1 ； 反向引物序列为SEQ ID N0:2 ； Pl探针的序列为SEQ ID NO:3: P2探针的序列为SEQ ID NO:4。
2.如权利要求1所述的单核细胞增生李斯特氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测的引物及探针，其特征在于所述的Pl探针的5'端标记生物素，P2探针的3'端标记FITC0
3.权利要求1所述的引物和探针用于检测食品中的单核细胞增生李斯特氏菌。
4.一种单核细胞增生李斯特氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒，包括如下的组分: (1)模板预处理反应液: 其中包括 IOXTaq Platinum buffer II 反应缓冲液，0.1 1.0mmoI/LdNTP,0.1 .1.0 μ mol/L 正向引物，0.1 1.0 μ mol/L 反向引物，Taq PlatinumDNA Polymerase 2.5U ； 所述的 IOXTaq Platinum buffer II 反应缓冲液成分为:200mM Tris_HClpH8.8，100mM KCl, 100mM(NH4) 2S04,20mM MgCl2 ； (2)NEMA恒温扩增反应液: 包括 IOXNE Buffer 3 反应缓冲液，0.1 1.0mmoI/L dNTP，5% 30% DMS0,0.1 1.0 μ mol/L正向引物,0.1 1.0 μ mol/L反向引物和100 μ g/mL牛血清蛋白； 其中所述的IOXNEBuffer 3反应缓冲液成分为:100mmol/L NaCl, 50mmol/LTri s-HCI , 10mmol /T, MgCl2, lmmol/L dithiothreitol pH 7.9 ；(3)Nt.BspQI 切刻内切酶:4υ/μ L ；(4)Bst DNA 聚合酶:2U/y L ； (5)5!端生物素标记探针Pl和3端FITC标记探针Ρ2各10 μ mol/L (6)通用型核酸扩增物快速检测板； 其中正向引物、反向引物和探针P1、P2的序列如权利要求1所述。
5.权利要求4所述的试剂盒用于检测食品中的单核细胞增生李斯特氏菌。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其使用方法包括如下的步骤: (1)待检样品或细菌DNA的提取: 提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA 0D26Q/0D28Q在1.6 2.0范围内，浓度在10 IOOng/μ L范围内； (2)模板预处理: 将装有23 μ L模板预处理反应液的反应管加入2 μ L待检模板DNA，于94°C水浴7min后迅速放入低于所检菌引物Tm值温度2°C的水浴中50s ;然后94°C水浴20s和低于所检菌引物Tm值温度2°C水浴50s，此过程反复进行5个以上循环。产物用于NEMA模板； (3)NEMA恒温扩增反应: 在装有46 μ L NEMA扩增反应液的反应管中加入2 μ L预处理过的模板DNA，LOyLNt.BspQI切刻内切酶和1.0yL Bst DNA聚合酶后，迅速放入低于所检菌引物Tm值温度2°C的水浴中60min,反应结束后取出； (4)产物检测: 反应结束后，反应管中加入探针Pl和P2各0.5 μ L，90°C水浴3min自然冷却至恒温，用通用型核酸扩增 产物快速检 测板检 测产物。
全文摘要
本发明涉及一种单核细胞增生李斯特氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测的引物及探针，其中正向引物序列为SEQ ID NO1，反向引物序列为SEQ ID NO2；P1探针的序列为SEQ ID NO3；P2探针的序列为SEQ ID NO4。同时本发明还提供一种包含上述引物探针序列的，用于恒温扩增快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的试剂盒，以及应用方法。本发明的试剂盒根据待检菌株的保守基因序列设计引物和探针，从而保证检测方法的特异性。且具有与PCR检测方法相似灵敏度，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可。结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用通用型核酸扩增物快速检测板检测即可，简单、快速、安全、无污染，特别适用于食品检测机构。
文档编号C12Q1/44GK103173536SQ201210594019
公开日2013年6月26日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者姜英辉, 邵秀玲, 张晓梅, 雷质文, 李正义, 赵丽青, 祝素珍, 王建广 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心