专利名称：节杆菌zjb-09277及其在制备(s)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的菌种-节杆菌ZJB-09277 (Arthrobacter sp.ZJB-09277)，及利用该微生物选择性拆分3-氰基-5-甲基己酸酯制备普瑞巴林中间体
(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法。
背景技术：
(S)-3_氰基-5-甲基己酸是合成普瑞巴林的重要手性中间体。普瑞巴林，化学名为⑶-3-(氨甲基)-5-甲基己酸，是由美国辉瑞公司开发的的Y-氨基丁酸的3位异丁基取代物(Angew Chem Int Ed, 2008, 47(19): 3500-3504)。由于普瑞巴林能够有效抑制与神经病理性疼痛、癫痫相关的神经元过度兴奋及神经递质释放增加(Curr OpinPharmacol, 2006, 6(1): 108- 113)，已被FDA批准用于带状疱疹后神经痛、糖尿病外周神经痛、癫痫、纤维肌痛等。与传统药物相比，普瑞巴林的剂量更低、服用次数少、副作用小、持续时间长、耐受性强(Curr Med Res Opin, 2006，22(2): 375-384)，因此被国际疼痛学会(IASP)、欧洲神经病学学会联盟(EFNS)和英国NICE等多个国际指南推荐为一线治疗药物，国内外市场前景十分广阔。国内外报道了大量有关普瑞巴林及其中间体合成工艺的文献，可归为手性拆分法、不对称催化法、手性配体法和手性化合物直接合成法等四大类化学合成工艺。由于上述工艺步骤冗长、手性拆分试剂昂贵、反应条件苛刻、有毒有害溶剂用量大，而无法实现规模化生产。生物催化法由于反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点成为最受瞩目的医药及精细化学品合成技术之一。目前，已报道的生物催化合成普瑞巴林手性中间体工艺主要有以下几种:Xie 等(Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2006, 41: 75 - 80)以从Arabidopsis thaliana中克隆得到的重组腈水解酶AtNitl为催化剂拆分外消旋异丁基丁二腈合成(S) -3-氰基-5-甲基己酸，ee值高达98%，(S) -3-氰基-5-甲基己酸催化加氢，制得普瑞巴林。Felluga 等(Tetrahedron: Asymmetry, 2008, 19(8): 945-955)报道了以异戊醛为原料，在t-Bu0K存在条件下与Witting试剂反应，得到α，β -不饱和酸酯。α，β-不饱和酸酯与硝基甲烷发生Michael加成得到外消旋β-异丁基-Y-硝基酯，经Novozyme 435动力学拆分得到S型β-异丁基-Y-硝基酸,最后在酸性环境中氢化还原得到普瑞巴林。Sterimbaum 等利用 Candida antartica 脂肪酶 CALB (Candida antarcticlipase B)选择性酯化3_异丁基戊二酸，产物ee为95.5%，再通过化学反应得到普瑞巴林(W02009158343-A1)。Thijs等在拆分步骤引入猪肝脏酯酶对吡咯酮化合物进行动力学拆分，ee值达到97%，最后在酸性条件下水解2-吡咯酮得到普瑞巴林(W02009149928-A1)。辉瑞公司普瑞巴林生产工艺已经更新至第二代，该工艺引入脂肪酶Lipolase催化拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。该手性中间体经脱羧、碱性水解、氢化等步骤制得普瑞巴林(US20050283023)。
发明内容
本发明目的是提供一株可用于制备光学纯(S)-3_氰基-5-甲基己酸的新菌种——节杆菌ZJB-09277 (Arthrobacter sp.ZJB-09277)。其次提供该新微生物在选择性拆分外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。本发明采用的技术方案是:本发明涉及一种节杆菌ZJB-09277 (Arthrobacter sp.ZJB-09277),保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO: M 2012419，保藏日期2012年10月22日。该新菌株特征如下:菌落形态:30 °C在牛肉膏蛋白胨平板培养24 h，菌落呈圆形，直径2 3 mm，隆起形状为凸镜状，乳白色·，边缘整齐，光滑。菌落随时间的延长而增大，数天后直径可达5 _以上。细胞形态:16 h培养物的细胞呈不规则的杆状，0.8 1.2 μ mX 1.8^8.0 μπι。呈V形排列，端圆，无丝状体，无芽孢形成。培养时间延长，细胞逐渐变短，老培养物变成球状。生理生化特征:革兰氏阳性，接触酶阳性，利用Biolog (GENIII)自动微生物鉴定系统对菌株进行了 94种表型测试，包括71种碳源利用情况检测以及23种化学敏感性检测，具体特征见表I及表2。本发明所涉及的微生物是通过以下方法筛选得到的:(I)称取从杭州及周边地区采集的土样I g加入到9 ml 0.85%的生理盐水中，在涡流振荡器上充分混匀。取上清I ml，加入到49 ml富集培养基中，30°C，150 rpm下培养72 h，然后再取I ml培养基加入到49 ml的富集培养基，30°C，150 rpm下培养72 h，如此进行三轮富集。富集培养基以2 3 g/L (R，S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为唯一碳源，其它组分如下(g/L): (NH4)2SO4:5 15，MgSO4.7H20:0.5 1，NaCl:Γ .5，K2HPO4:Γ2, FeSO4.7Η20:
0.01 0.03，以蒸馏水配制，用1.0 M盐酸或NaOH溶液调节pH至6.(Γ8.0。(2)最后一次富集培养液稀释后涂布到平板培养基上，挑取单菌落至斜面保藏。平板培养基及斜面培养基为富集培养基中加入1.5^2.0%的琼脂。(3)挑取的单菌落接种到发酵培养基，组份如下(终浓度):葡萄糖1(T20 g/L，酵母膏 5 15 g/L, (MM)2SO4 5 15 g/L，MgSO4.7H20 0.5 I g/L，NaCl Γ .5 g/L，K2HPO4 I 2g/L, FeSO4.7H 20 0.θΓθ.03 g/L, pH 6.0^8.0(115。C 下，灭菌 30 min) ;25 35°C下，摇瓶转速15(T200 rpm，培养48 72 h，离心后悬浮于磷酸缓冲液体系中，加入(R，S)_3_氰基-5-甲基己酸酯作为底物，进行转化。(4)用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。所用气相色谱仪为用日本岛津GC-14C，手性毛细管气相色谱柱为BGB-174。色谱条件为:进样量1.0 μ 1，进样口、检测器的温度均为220 °C;载气为氦气，流速为1.6 mL/min，流量为40 mL/min,分流比为30:1。3-氰基-5-甲基己酸乙酯和3-氰基-5-甲基己酸丙酯的程序升温条件为:初始温度为130 °C，保持17 min,以10 °C/min的速度升到170 °C，保持13 min ;3_氰基-5-甲基己酸丁酯的程序升温条件为:110°C持30 min,5°C/min升温至170°C,保持14 min ;3_氰基-5-甲基己酸戊酯的程序升温条件为:130°C保持45 Hiinao0C /min升温至170°C，保持11 min。本发明还涉及节杆菌ZJB-09277在制备(S) _3_氰基_5_甲基己酸中的应用，所述的应用为:以式(I )所示外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯为底物，以节杆菌ZJB-09277发酵培养获得的湿菌体或含湿菌体的菌悬液为催化剂，于PH 6.5^8.0的缓冲液构成的转化反应体系a中，在25、0°C下转化反应,反应完全后,将反应液分离纯化得到式(II)所示(S)-3-氰基-5-甲基己酸；
权利要求
1.节杆菌ZJB-09277(Arthrobacter sp.ZJB-09277)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO: M 2012419，保藏日期2012年10月22曰。
2.—种权利要求1所述节杆菌ZJB-09277在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述的应用为:以式(I )所示外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯为底物，以节杆菌ZJB-09277发酵培养获得的湿菌体或含湿菌体的菌悬液为催化剂，于pH 6.5^8.0的缓冲液构成的转化反应体系a中，在25、0°C下转化反应,反应完全后,将反应液分离纯化得到式(II)所示⑶-3-氰基-5-甲基己酸；
3.如权利要求2所述节杆菌ZJB-09277在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述转化体系a中底物初始浓度为100 400mmol/Lo
4.如权利要求2所述节杆菌ZJB-09277在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述转化体系a中催化剂的质量用量以湿菌体的质量计为10(T300 g/L，所述湿菌体含水质量为7(Γ90%。
5.如权利要求2所述节杆菌ZJB-09277在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述转化体系a还包括有机溶剂，由底物、催化剂、有机溶剂与pH 6.5^8.0的缓冲液构成转化体系b，有机溶剂占转化体系b总体积1(Γ80%，转化体系b中底物初始浓度为100 400mmol/L，催化剂的质量用量以湿菌体的质量计为10(T300 g/L，所述湿菌体含水质量为70 90%。
6.如权利要求5所述节杆菌ZJB-09277在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述有机溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或乙腈。
7.如权利要求2或5所述节杆菌ZJB-09277在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述转化反应是在25飞(TC下转化反应12、6 h。
8.如权利要求2所述节杆菌ZJB-09277在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述转化反应液分离纯化方法为:反应结束后，将转化反应液离心，取上清液用等体积的乙酸乙酯萃取，有机层即为含(S)-3-氰基-5-甲基己酸的粗品，将粗品提纯即获得(S) -3-氰基-5-甲基己酸。
9.如权利要求2所述节杆菌ZJB-09277在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备: (1)斜面培养:将节杆菌ZJB-09277接种至斜面培养基，在3(T35°C下恒温培养48 72h后，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为:葡萄糖1(T20 g/L，酵母膏5 15 g/L,(MM)2SO4 5 15 g/L，MgSO4.7Η20 0.5 I g/L,NaCl Γ .5 g/L,K2HPO4 I 2 g/L，FeSO4.7Η200.0Γ0.03 g/L，琼脂 15 20 g/L，溶剂为水，pH 6.0 8.0 ; (2)发酵培养:从斜面菌体上挑取一接种环菌体，接种至发酵培养基，在3(T35°C、150^200 rpm条件下振荡培养36 72 h，培养结束后将发酵液离心，沉淀用生理盐水洗涤后，收集湿菌体，将湿菌 体悬浮于pH 7.0的磷酸缓冲液中，获得含湿菌体的菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为:柠檬酸钠1(T25 g/L，酵母提取粉2(T40 g/L, Na2HPO4 Γ2 g/L,KH2PO4 Γ2 g/L，MgSO4.7H20 0.5 I g/L，FeSO4.7H20 0.θΓθ.03 g/L，NaCl Γ .5 g/L，溶剂为水，pH 6.0 8.0。
全文摘要
本发明公开了一种节杆菌ZJB-09277(Arthrobacter sp. ZJB-09277)及其在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国 武汉 武汉大学，保藏编号CCTCC NO: M 2012419，保藏日期2012年10月22日；本发明提供了一种立体选择性水解制备 (S)-3-氰基-5-甲基己酸的新菌种，通过该菌种可制备普瑞巴林的重要手性中间体——(S)-3-氰基-5-甲基己酸；本发明中所述(S)-3-氰基-5-甲基己酸的制备方法具有原子经济性高、条件温和、环境友好等优点，具有较高的工业化应用潜力。
文档编号C12N1/20GK103114054SQ20121059404
公开日2013年5月22日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者郑裕国, 郑仁朝, 李爱朋, 沈寅初 申请人:浙江工业大学