工程改造的微生物及用于微生物油生产的方法

工程改造的微生物及用于微生物油生产的方法
【专利摘要】本发明的一些方面提供了用于油生产的工程改造的微生物。本文还提供了用于对微生物进行工程改造的方法及工程改造的微生物的用途。在一些实施方式中，提供了微生物，其经过工程改造而调制了脂质合成的速率控制步骤的组合，例如生成代谢物乙酰-CoA、ATP或NADPH用于脂质合成的步骤(推步骤)和隔离脂质合成途径中介导脂质合成的反馈抑制的产物或中间产物的步骤(拉步骤)的组合。这种推-和-拉工程改造的微生物显示了极大增强的转化产率、TAG合成以及储存特性。
【专利说明】工程改造的微生物及用于微生物油生产的方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请依35U.S.C. § 119要求对美国临时专利申请。5.5.1 61/548,901(提交于 2011年10月19日）；及美国临时专利申请U.S.S.N. 61/663,263(提交于2012年6月22 日）的优先权，两个申请的题目均为"工程改造的微生物及用于微生物油生产的方法"，其 全部内容都通过引用并入本文。
[0003] 政府支持
[0004] 本发明是在政府支持下完成的，所属基金为美国能源部所授予的DE-AR0000059 号基金。政府在本发明中拥有特定的权利。
[0005] 发明背景
[0006] 能持续生产的生物燃料是化石燃料的一个替代选择，可以帮助减少对容易开采的 化石燃料储备的消耗，同时能够避免化石燃料相关的污染以及温室气体排放，由此能满足 不断增长的对可持续获得的能源的需要。发展适合于将碳源有效转化为脂质的方法及产油 生物体是微生物生物燃料生产得到广泛应用的前提条件。
[0007] 本发明特定方面的概述
[0008] 如果能达到高的转化产率，那么异养生物的微生物油生产是从可再生资源经济有 效生产生物燃料的一个最有前途的路径。由可再生原料的经济有效的微生物油生产的关键 是高的碳水化合物向油转化的产率。随着使能技术应用于此，代谢工程已经出现，并且有大 量的实例证明成功的途径工程改造能显著地提高微生物生物催化剂在化学、药学和燃料产 品的合成中的效能。
[0009] 先前在对微生物进行工程改造用于油生产上的努力聚焦于扩增脂肪酸合成途径 中推测的限速步骤。这样的规模扩增有一个显著的缺陷，就是不断增加的碳流进入脂肪酸 合成途径会增加了细胞中饱和脂肪酸的水平，由此激活了脂肪酸生物合成中强烈的负反馈 循环。
[0010] 本发明的一些方面提供了微生物工程改造的策略，其组合了上游的代谢物形成途 径（本文也称为"推"代谢途径）的扩增以及类似的下游产物隔离（sequestering)途径（本 文也称为："拉"代谢途径）中代谢流的增加。本发明的一些方面提供了微生物中推-和-拉 修饰的平衡组合，使得大量碳流的扩增进入脂质合成途径，而中间代谢物的浓度不会显著 偏离其稳态生理水平，因此避免了对脂质合成的反馈抑制。
[0011] 本公开的一些方面涉及这样的认识，即单一分支修饰如仅推的修饰或仅拉的修饰 的对转化效率的效应通常是有限的，因为细胞中有合成产率的补偿性的调控，并且微生物 细胞中脂质生物合成的推和拉步骤的和谐调控对脂质生产产生惊人的协同效应。
[0012] 例如，本公开的一些方面提供了遗传修饰的产油微生物，其包含了脂质生物合成 途径的不同修饰的组合，本文也称为推拉修饰。在一些实施方式中，本文提供的微生物包含 了产生脂质合成中需要的代谢物或中间产物的产率增加的修饰，以及使得细胞中脂质合成 的产物的隔离的修饰，如甘油三酯向储存形式的脂质，由此减少了其一些产物如脂肪酸或 甘油二酯对脂质合成的反馈抑制。在一些实施方式中，代谢性推和代谢性拉的途径中修饰 的组合使得脂质生产有协同性的增加。在一些实施方式中，推修饰使得脂质合成的元件块 或脂质合成的代谢物在细胞中的水平增加。在一些实施方式中，拉修饰减少了对脂质合成 的反馈抑制。
[0013] 本发明的一些方面提供了包含遗传修饰的微生物，所述修饰同时影响脂质生物合 成的推和拉途径。例如，推和拉修饰被引入到产油的模式微生物中一产油酵母解脂耶氏 酵母（Yarrowia lipolytica)中。研究甘油三酯（TAG)合成途径中最后一步的甘油二脂乙 酰转移酶（DGA1)的过表达，作为示例性的拉修饰。DGA1过表达使得脂质生产比对照微生物 中增加4倍，脂质含量达到细胞干重（DCW)的33. 8%。研究脂肪酸合成的第一个关键步骤 中乙酰基-CoA羧基水解酶（ACC1)作为示例性的推修饰。ACC1过表达使得脂质含量是对照 的2倍，达到17. 9%的脂质含量。对串联基因表达构建体中同时共表达ACC1和DGA1进行 研究作为示例性的推-拉修饰。ACC1和DGA1同时过表达进一步使脂质含量增加到41. 4%， 表明ACC1+DGA1共表达具有协同效应。
[0014] 在2L生物反应器发酵中，探索了 ACC1+DGA1转化子的脂质生产特征，120hr后，月旨 质含量达到61. 7%。发酵过程的脂质积累期中的总体的产率和生产效率分别为0. 195g/g 和0. 143g/L/hr，最大产率和生产效率为0. 270g/g和0. 253g/L/hr。该研究表明了产油酵 母解脂耶氏酵母具有极佳的脂质生产能力，也证明了对脂质合成途径中两个重要步骤进行 代谢工程改造的效应，所述改造将流转移至脂质合成并产生TAG合成的驱动力。
[0015] 本发明的一些方面提供了用于产油微生物，例如产油酵母的新型过表达平台。本 发明的一些方面提供了表达构建体，其包含启动子（驱动包括编码序列和内含子的转录物 的转录），例如翻译延长因子-la (TEF)启动子，其位于包含内含子和编码序列的核酸上 游。本公开的一些方面提供了能够比无内含子TEF启动子增加表达至少17倍的含内含子 的表达构建体。
[0016] 本公开的一些方面提供了分离的产油细胞，其包含了增加 DGA1基因产物的表达 的遗传修饰。在一个实施方式中，所述分离的产油细胞进一步包含增加 ACC1基因产物的表 达的遗传修饰。在一些实施方式中，所述分离的产油细胞进一步包含了增加 S⑶基因产物 的表达的遗传修饰。在一些实施方式中，所述分离的产油细胞进一步包含了增加 ACL基因 产物的表达的遗传修饰。在一些实施方式中，所述遗传修饰包含了增加基因表达的核酸构 建体，所述核酸构建体包含（a)包含在合适的同源或异源启动子控制下的、编码基因产物 的核酸序列的表达盒，和/或（b)当插入细胞基因组时，调控基因产物的表达水平的核酸序 列。在一些实施方式中，启动子是诱导型或组成型的启动子。在一些实施方式中，启动子为 TEF启动子。在一些实施方式中，所述表达构建体进一步包含内含子。在一些实施方式中， 所述内含子在转录起始位点的下游。在一些实施方式中，内含子在编码基因产物的核酸序 列之内。在一些实施方式中，所述核酸构建体抑制或破坏对编码所述基因产物的原生基因 的天然调控，导致原生基因的过表达。在一些实施方式中，对原生基因的天然调控的抑制或 破坏是通过对调控基因表达的调控区域或调控区域的部分进行删除、破坏、突变和/或置 换而介导的。在一些实施方式中，所述基因产物是转录物。在一些实施方式中，所述基因产 物是蛋白质。在一些实施方式中，所述核酸构建体插入细胞的基因组内。在一些实施方式 中，基因产物的表达增加赋予细胞将碳源转化为脂质，例如脂肪酸，脂肪酸衍生物和/或甘 油三酯（TAG)的有益表型。在一些实施方式中，所述有益表型包括修饰的脂肪酸谱、修饰的 TAG谱、增加的脂肪酸和/或甘油三酯合成速率、增加的转化产率、增加的细胞中甘油三酯 积累，和/或细胞的脂质小体中增加的甘油三酯积累。在一些实施方式中，所述细胞的脂肪 酸或TAG的合成速率比相同细胞类型的未修饰细胞增加至少2倍。在一些实施方式中，所 述细胞的脂肪酸或TAG的合成速率比相同细胞类型的未修饰细胞增加至少5倍。在一些实 施方式中，所述细胞的脂肪酸或TAG的合成速率比相同细胞类型的未修饰细胞增加至少10 倍。在一些实施方式中，细胞将碳源转化为脂肪酸或TAG的转化率在大约0. 025g/g-大约 0. 32g/g (例如，所产生的脂质g/所消耗的碳源g)的范围内。在一些实施方式中，细胞将碳 源转化为脂肪酸或TAG的转化率为至少大约0. llg/g。在一些实施方式中，细胞将碳源转化 为脂肪酸或TAG的转化率为至少大约0. 195g/g。在一些实施方式中，细胞将碳源转化为脂 肪酸或TAG的转化率为至少大约0. 24g/g。在一些实施方式中，细胞将碳源转化为脂肪酸或 TAG的转化率为至少大约0.27g/g。在一些实施方式中，所述细胞包含脂质小体或液泡。在 一些实施方式中，细胞为细菌细胞、藻类细胞、真菌细胞或酵母细胞。在一些实施方式中，所 述细胞为产油酵母细胞。在一些实施方式中，细胞为解脂耶氏酵母细胞。
[0017] 本公开的一些方面提供了包含产油细胞，例如本文所描述的产油细胞的培养物。 在一些实施方式中，所述培养物进一步包含碳源。在一些实施方式中，所述碳源包含可发酵 糖。在一些实施方式中，所述可发酵糖为C6糖。在一些实施方式中，所述碳源包含葡萄糖。 在一些实施方式中，所述碳源包含有机酸。在一些实施方式中，所述有机酸是醋酸。在一 些实施方式中，醋酸浓度为至少5% vol/vol、至少10% vol/vol、至少15% vol/vol、至少 20% vol/vol、至少25% vol/vol或至少30% vol/vol。在一些实施方式中，所述碳源包含 醋酸盐。在一些实施方式中，醋酸盐的浓度为至少1%ν〇1/ν〇1。在一些实施方式中，醋酸 盐的浓度为至少2% vol/vol。在一些实施方式中，醋酸盐的浓度为至少3% vol/vol。在 一些实施方式中，醋酸盐的浓度为至少4% vol/vol。在一些实施方式中，醋酸盐的浓度为 至少5% vol/vol。在一些实施方式中，所述培养物包含甘油。在一些实施方式中，甘油浓 度为大约2% vol/vol。在一些实施方式中，所述培养物包含溶解氧水平为至少5%、至少 10%、至少15%或至少20%。在一些实施方式中，所述培养物显示的pH在pH7. 0-pH7. 5范 围内。在一些实施方式中，所述培养物包含硫酸铵。在一些实施方式中，所述培养物包含以 1:2比率的硫酸铵和醋酸。在一些实施方式中，所述培养物显示5g/l-60g/l之间的脂质滴 度。在一些实施方式中，所述培养物显示0.04g/l/h-0.60g/l/h之间的脂质生产。在一些 实施方式中，所述培养物显示〇. lg/1/h-lg/l/h之间的最大脂质生产效率。
[0018] 本公开的一些方面提供了方法，包含将碳源和分离的产油细胞接触，所述细胞包 含增加 DGA1基因产物的表达的遗传修饰；以及将碳源与细胞接触在适合细胞将至少部分 碳源转化为脂肪酸或甘油三酯的条件下进行孵育。在一些实施方式中，所述产油细胞进一 步包含增加 ACC1基因产物的表达的遗传修饰。在一些实施方式中，所述产油细胞进一步包 含增加 S⑶基因产物的表达的遗传修饰。在一些实施方式中，所述产油细胞进一步包含增 加 ACL基因产物的表达的遗传修饰。在一些实施方式中，所述分离的产油细胞是如本文所 描述的工程改造的分离的产油细胞。在一些实施方式中，所述碳源包含可发酵糖。在一些 实施方式中，所述碳源包含葡萄糖。在一些实施方式中，所述碳源包含醋酸盐。在一些实施 方式中，醋酸盐的浓度为至少1 % vol/vol、至少2% vol/vol、至少3% vol/vol、至少4% vol/vol或至少5%vol/vol。在一些实施方式中，所述碳源包含醋酸。在一些实施方式 中，醋酸的浓度为至少5% vol/vol、至少10% vol/vol、至少15% vol/vol、至少20% vol/ vol、至少25% vol/vol或至少30% vol/vol。在一些实施方式中，所述方法包括将细胞与 溶解氧接触，所述溶解氧水平为至少5%、至少10%、至少15%或至少20%。在一些实施方 式中，所述的接触和/或孵育是在pH7. 0-pH7. 5的pH范围内进行的。权利要求53-69中任 一项的方法，其中所述方法包括将细胞与硫酸铵接触。在一些实施方式中，所述方法包括将 细胞与比率为1:2的硫酸铵和醋酸接触。在一些实施方式中，所述方法进一步包含将细胞 与甘油接触。在一些实施方式中，所述方法包括将细胞与浓度为大约2% vol/vol的甘油接 触。在一些实施方式中，与分离的产油细胞接触的碳源是在反应器中进行孵育。在一些实 施方式中，将碳源与分离的产油细胞接触，并在分批补料过程中进行孵育，使碳源转化为脂 肪酸或甘油三酯。在一些实施方式中，将碳源与分离的产油细胞接触，并在连续过程中进行 孵育，使碳源转化为脂肪酸或甘油三酯。在一些实施方式中，所述方法进一步包括在孵育步 骤中一次或多次地将额外量的碳源或一定量的额外碳源与接触分离产油细胞的碳源接触。 在一些实施方式中，通过溶剂萃取法从接触分离的产油细胞的碳源中萃取脂肪酸或甘油三 酯。在一些实施方式中，溶剂萃取包括氯仿甲醇萃取。在一些实施方式中，溶剂萃取包括己 烷萃取。在一些实施方式中，将脂肪酸或甘油三酯与接触分离的产油细胞的碳源分离，并随 后通过酯交换反应进行精炼。
[0019] 本公开的一些方面提供了方法，其包括通过增加细胞中DGA1基因产物的表达以 在产油细胞中修饰脂肪酸谱、甘油三酯谱、脂肪酸合成速率、甘油三酯合成速率、脂肪酸衍 生物积累的程度、脂肪酸衍生物分泌速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化率、 和/或碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物转化的有效产率。在一些实施方式中，所述方 法进一步包括增加细胞中ACC1基因产物、SCD基因产物和/或ACL基因产物的表达。在一 些实施方式中，脂肪酸衍生物积累的程度是脂肪酸衍生物在脂质小体中积累的程度。在一 些实施方式中，所述脂肪酸衍生物是甘油三酯。在一些实施方式中，对产油细胞中脂肪酸 谱、甘油三酯谱、脂肪酸合成速率、甘油三酯合成速率、脂肪酸衍生物积累的程度、脂肪酸衍 生物分泌速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化率、和/或碳水化合物向脂肪 酸或脂肪酸衍生物转化的有效产率的修饰包含增加产油细胞中的脂肪酸合成速率、甘油三 酯合成速率、脂肪酸衍生物积累的程度、脂肪酸衍生物分泌速率、碳水化合物向脂肪酸或脂 肪酸衍生物的转化率、和/或碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物转化的有效产率。在一 些实施方式中，对细胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化效率的修饰包含使转 化效率增加至少2倍。在一些实施方式中，对细胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物 的转化效率的修饰包含使转化效率增加至少3倍。在一些实施方式中，对细胞中碳水化合 物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化效率的修饰包含使转化效率增加至少4倍。在一些实施 方式中，对细胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化效率的修饰包含使转化效率 增加至少5倍。在一些实施方式中，所述细胞为酵母细胞。在一些实施方式中，所述酵母细 胞为耶氏酵母属细胞。在一些实施方式中，所述产油酵母是解脂耶氏酵母。
[0020] 本公开的一些方面提供了分离的核酸分子，其包括：a)编码SEQ ID N0:2(解脂耶 氏酵母DGA1)的核苷酸序列，或b)与a)的核苷酸序列至少85%相同的核苷酸序列。在一 些实施方式中，编码SEQ ID N0:2的核苷酸序列包含SEQ ID N0:1。本公开的一些方面提供 了表达盒，其包含如本文描述的分离的核酸分子以及异源启动子。在一些实施方式中，启动 子是组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方式中，所述异源启动子为翻译延长因子 (TEF)启动子。在一些实施方式中，所述异源启动子包含内含子。在一些实施方式中，所述 异源启动子进一步包含起始密码子。在一些实施方式中，内含子位于编码SEQ ID N0:2的 核苷酸序列的翻译起始位点的下游。本公开的一些方面提供了载体，其包含如本文所描述 的表达盒。本公开的一些方面提供了细胞，其包含如本文所描述的表达盒或本文描述的载 体的至少一部分。
[0021] 本申请的主体要素在一些情况下涉及相关产品、对特定问题的备选解决方案，和/ 或单一系统或物品的大量不同用途。
[0022] 本发明的其他优势、特征以及用途在特定非限制性实施方式的具体描述、附图以 及权利要求条款中更显而易见。
[0023] 附图简述
[0024] 图1.解脂耶氏酵母中脂质合成的主要代谢途径总览。
[0025] 图2.培养50小时后不同启动子控制下β -半乳糖苷酶的酶活性。
[0026] 图3. ACC1+DGA1转化子的生物反应器发酵（MTYL065)。
[0027] 图4. 2-L生物反应器发酵过程中ACC1+DGA1转化子的脂肪酸谱（FAP)。
[0028] 图5.在2-L生物反应器中生长并以醋酸盐为碳源的ACC+DGA转化子的脂肪酸谱。
[0029] 图6.在醋酸盐上的ACC+DGA1解脂耶氏酵母的脂肪酸生产情况。
[0030] 图7.组合表达构建程序。为构建含有同脂质积累基因靶标的组合的质粒采用的 克隆途径和策略。这些质粒随后转化入解脂耶氏酵母以研究脂质积累情况。
[0031] 图8.通过ρΜΤ053整合与ρΜΤ092比较TEFin-DGA盒的转录表达。
[0032] 图9.表达组合构建体的解脂耶氏酵母菌株之间的相对脂质生产效率和产率，通 过将总脂肪酸含量以对照菌株标准化测出。在图下方指示了是（+)或否（_)存在相应基因 靶标的转化的过表达盒。以最初培养100小时内相对脂质积累来计算生产效率（浅灰色条 形）。产率是通过将脂质积累除以所消耗的糖计算的。培养基的C/N比率为20。结果为多 个实验的平均值。
[0033] 图10.靶标基因在菌株MTYL089中的转录表达。表达根据肌动蛋白表达进行内部 标准化，并且是与对照（MTYL038)菌株相比较，表达测定在生长66小时后进行。
[0034] 图11.过表达ACC、D9、ACL12和DGA的MTYL089菌株在批式生物反应器的发酵情 况。C/N摩尔比率为100。所有取样都进行三次重复。
[0035] 图12. 2-L发酵结束时MTYL089的显微镜成像。普通光学显微镜成像（左图）显 示了大部分细胞是酵母形式，包含大的液泡。荧光显微成像（右图）表明这些液泡是由中 性脂质组成的。
[0036] 图13. MTYL065和MTYL089两种菌株之间的脂肪酸谱对比。取自各个发酵终点的 脂肪酸谱，相对总的脂肪酸含量进行标准化。
[0037] 图14.氮（mM)、非脂质和脂质滴度（g/L)的变化趋势。
[0038] 图15.脂质滴度（g/L)、脂质含量（％)和C/N比率的趋势。主坐标轴显示了脂质 滴度和脂质含量，以细胞干重％表示。次坐标轴显示了 C/N比率。C/N比率在终点时由于醋 酸盐快速消耗有所下降。
[0039] 图16.上图--在没有荧光的油浸显微镜（100X)下观察到的"浮游细胞"。下 图一荧光下相同视野显示了明亮的红色脂质小体。
[0040] 本发明特定实施方式详述
[0041] 液体生物燃料作为化石燃料的替代品非常有前途，可以帮助减轻对于气候变化的 顾虑，并且缓解了供应的不确定性（1)。生物柴油、航空油料和其他油衍生燃料对于航空和 重型货车运输是尤其必需的。目前这些产品都是只在蔬菜油中生产，这是一条成本高又不 可持续的途径（2)。一个有吸引力的可能性是将可再生的碳水化合物原料非光合作用地转 化为油（3)。对于生物柴油，对于油原料从蔬菜油向微生物油生产的转变具有大量的其他优 势：能适应多样的物料，在对土地的需求上非常灵活，有效的加工循环转换，并且很容易进 行规模扩大（4)。用于微生物生产的生物平台也更容易在遗传上进行操纵，利于进一步的优 化。
[0042] 由碳水化合物转化为油的经济有效微生物技术的关键是高碳水化合物向油的转 化产率。随着使能技术应用于此，代谢工程已经出现，并且有大量的实例证明成功的途径工 程改造能显著地提高微生物催化剂在化学、药学和燃料产品的合成中的效能（5)。先前在 工程改造具有高脂质合成的微生物的努力集中于扩大脂肪酸合成途径中推测的限速步骤 (6)。然而这些努力都产生了好坏参半的结果，可以是因为调控脂肪酸流导致饱和脂肪酸水 平升高，饱和脂肪酸是脂肪酸生物合成酶的有力的变构抑制剂，也为脂肪酸生物合成创造 了负反馈循环（7)。本文描述了结合上游代谢物形成途径的扩大和类似地增加下游代谢物 消耗途径中代谢流的方法。如果得到平衡，则这种推-和-拉策略可产生大的代谢流的扩 增，而中间产物代谢物的浓度不会明显偏离其的稳态生理水平。
[0043] 产油酵母解脂耶氏酵母是生物柴油生产的一个有吸引力候选者，其也在其他工 业应用中有广泛用途：柠檬酸生产、蛋白质生产（例如，蛋白酶和酯酶）以及生物修复 (8-10)。随着对其基因组的完全测序和遗传工程工具不断完善，要完成对解脂耶氏酵母的 工程改造相对容易（11)。而且还发现解脂耶氏酵母在培养基中生长旺盛，能够在多种底物 上生长，并且也可用于在农业工业废品、工业甘油及工业脂肪上生产脂质（12-14)。其具有 极佳的脂质积累能力，通常能积累高达36%细胞干重（DCW)的脂质（15)。
[0044] 已经开始对解脂耶氏酵母中从头开始的脂质合成的代谢途径进行完整的作图，图 1中阐明了目前的脂质合成模型：进入糖酵解过程的葡萄糖会进入线粒体，用作TCA循环 中的丙酮酸；然而，多余的乙酰-CoA是通过柠檬酸穿梭途径从线粒体进入细胞溶胶的。然 后细胞溶胶中的乙酰-CoA被乙酰-CoA羧化酶（ACC)转化为丙二酰-CoA，这是脂肪酸合成 的第一个步骤。在脂肪酸合成后，甘油三酯（TAG)合成沿着肯尼迪途径进行，这是在内质 网（ER)和脂质小体中进行的。酰基-CoA是酰基化成甘油-3-磷酸骨架以形成溶血磷脂 酸（LPA)的前体，后者进一步酰基化形成磷脂酸（PA)。随后PA去磷酸化形成二脂酰甘油 (DAG)，最后二脂酰甘油酰基转移酶（DGA)进行一步酰化反应产生TAG。
[0045] 乙酰-CoA从线粒体向细胞溶胶的运输是通过以下进行的：ATP-通过柠檬酸穿梭 的柠檬酸裂解酶（ACL)介导的柠檬酸裂解产生乙酰-CoA和草酰乙酸（0ΑΑ)。然后乙酰-CoA 羧化酶（ACC)催化进行脂质生物合成的第一个关键步骤，将细胞溶胶中乙酰-CoA转化为丙 二酰-CoA，后者是脂肪酸链延伸的主要前体。然后完整的脂肪酰-CoA链被运输到内质网 (ER)或脂质小体膜，通过肯尼迪途径进行甘油三酯（TAG)的最后组装。解脂耶氏酵母中生 产的超过80 %的储存脂质都是TAG形式（16)。细胞溶胶0ΑΑ被苹果酸脱氢酶转化为苹果 酸并运输回线粒体，以完成柠檬酸穿梭循环。NADPH形式的还原性等价物可由磷酸戊糖途径 或转氢酶途径中的苹果酸酶来提供。在解脂耶氏酵母中，有高的PPP代谢流且苹果酸酶过 表达没有效果，这表明前者是NADPH的主要来源（4, 17)。
[0046] 细胞内脂质积累可经由两种方法进行：从头开始的脂质合成或外源脂肪酸和脂质 的外部并入。在营养供应耗尽时又有多余碳源存在下，最常发生脂质的积累。在培养中，这 种状态通常与静止期的开始相吻合。在实践中，最常用的限制性营养是氮，因为在培养基组 合物中非常容易控制氮的含量（15)。除了这些可诱导的条件，脂质合成途径是受到高度调 节的，这样生物体能够使细胞生长与能量储存达到平衡。例如，仅仅是ACC就在多个水平上 受到多种因素的调节（7)。
[0047] 这种紧密的调节在特定情况下也可以进行规避。通过消除过氧化物酶体氧化途 径及对甘油代谢进行工程改造，解脂耶氏酵母能够通过从头脂质积累达到40% -70 %脂质 (18, 19)。Λ 6-和Λ 12-去饱和酶基因的共表达使得细胞产生显著量的γ-亚麻酸（GLA) (20)。然而，在解脂耶氏酵母中工程改造脂质生物合成途径相对而言依然没有得到很好的 探索，人们依然在发展用于有效工程改造脂质生产途径以使产率最大化的策略。
[0048] 本公开的一些方面提供了工程改造的微生物，用于生产生物燃料或生物燃料前 体。术语"生物燃料"指的是衍生于生物学来源如活细胞、微生物、真菌或植物的燃料。该术 语包括例如直接由生物学来源获得，例如，通过常规萃取、蒸馏或精炼方法得到的燃料，以 及通过加工获自生物学来源的生物燃料前体而生产的燃料，如通过化学修饰如酯交换步骤 进行加工。直接获得的生物燃料的实例为酒精类，如乙醇、丙醇和丁醇，脂肪和油。可通过 加工生物燃料前体（例如脂质）而获得的生物燃料的实例为生物柴油（例如通过对脂质进 行酯交换反应产生）以及绿色柴油/改性油染料（例如通过对油进行脱氢反应产生）。生 物柴油，也称为脂肪酸甲酯（或乙酯）是现今在经济上最重要的生物燃料之一，可以通过对 脂质进行酯交换反应在工业规模上进行生产，在所述酯交换反应中，氢氧化钠和甲醇（或 乙醇）与脂质如甘油三酯发生反应，产生生物柴油和甘油。
[0049] 生物柴油的工业规模生产的原料包括动物脂肪、植物油、棕榈油、麻、大豆、油菜 籽、亚麻、向日葵、油质和产油藻类。在其他方法中，由微生物将生物质转化为生物燃料前体 如脂质，随后将所述前体进行萃取并进一步加工生成生物燃料。术语"生物质"指的是通过 培养和/或繁殖活细胞或生物体（例如微生物）产生的物质。生物质可以包含细胞、微生 物和/或细胞间内含物，例如细胞脂肪酸和TAGS，以及细胞外物质。细胞外物质包括但不限 于细胞分泌的化合物，例如分泌到细胞外的脂肪酸或TAG。用于生物燃料生产的重要的生物 质类型为藻类生物质和植物衍生的生物质，例如玉米秸杆和木纤维。在一些实施方式中，用 于生物燃料或生物燃料前体生产的生物质可包含植物衍生的糖类，例如蔗糖或玉米衍生糖 类。
[0050] 本公开的一些方面涉及脂质的微生物来源的工程改造和开发，其可用于例如经济 上可行的工业规模生物柴油生产。术语"脂质"指的是脂肪酸及其衍生物。相应地，脂质的 实例包括脂肪酸（FA，包括饱和及不饱和）；甘油酯或甘油脂，也称为酰基甘油（如单甘油酯 (单酰基甘油）、甘油二酯（二酰基甘油）、甘油三酯（三酰基甘油，TAG，或中性脂肪）；磷酸 甘油酯（甘油磷酸酯）；非甘油酯（鞘脂，固醇脂，包括胆固醇和类固醇激素，异戊烯醇脂包 括萜类，脂肪醇，蜡和聚酮化合物）；以及复合脂质衍生物（糖连接的脂质或糖脂，和蛋白连 接的脂质）。脂质是活细胞和微生物细胞质膜中至关重要的部分。一些细胞和微生物还生 产脂质用于储存能量，例如以三酰基甘油的形式，存在于脂质小体、脂肪滴或液泡中。
[0051] 本发明的一些方面涉及工程改造的微生物用于生物燃料或生物燃料前体的生产。 在一些实施方式中，本文提供的微生物经过工程改造以优化其脂质代谢以生产脂质。术语 "脂质代谢"指的是涉及脂质的制造或降解的分子过程。脂肪酸合成、脂肪酸氧化、脂肪酸去 饱和、TAG合成、TAG储存以及TAG降解都是细胞中脂质代谢组成部分的实例。因此，术语 "脂肪酸代谢"指的是涉及脂肪酸合成、产生、转化或降解的所有细胞或生物体的过程。脂肪 酸合成、脂肪酸氧化、脂肪酸去饱和、TAG合成以及TAG降解都是细胞中脂肪酸代谢组成部 分的实例。
[0052] 术语"三酰基甘油"（TAG，有时也称为甘油三酯）指的是如下分子，其包含通过酯 键共价连接于三个脂肪酸分子（为一元的脂肪族羧酸）的甘油的单个分子，在甘油分子的 三个羟基（0H)基团上分别连接一个脂肪酸分子。三酰基甘油是代谢能量的高度浓缩的储 备，因为其特征为体积小、不含水，并且是生物柴油生产的合适的原料。
[0053] 许多细胞和生物体都以脂肪酸和脂肪酸衍生物的形式储存代谢能量，如TAG。月旨 肪酸及其衍生物，如TAG，提供了储存代谢能量的理想形式。在C-C键中包含的能量可通过 β_氧化反应得到有效释放，这在形式上是等价于脂肪酸生物合成的逆反应的一个反应过 程，但是是由不同的酶组成的不同分子途径介导和调节的。微生物可由外部供应、内部转换 及从头合成而获取脂肪酸。本发明的一些方面涉及基于微生物有效地从外部供应的碳源合 成及储存脂肪酸或脂肪酸衍生物如TAG的能力，鉴别用于生物燃料或生物燃料前体生产的 微生物。
[0054] 天然脂肪酸分子通常具有4-28个碳原子的无分支的脂肪链或尾巴。如果脂肪链 的所有碳原子都是经由C-C单键连接，则脂肪酸被称为"饱和的"，如果两个或更多个碳原 子是经由C-C双键连接，则脂肪酸被称为"不饱和的"。不饱和脂肪酸在膜的流动性、细胞活 性、代谢和控制基因转录的核内事件中起重要作用。
[0055] 酵母中的脂肪酸谱主要由C16和C18脂肪酸组合，例如棕榈酸（C16)、棕榈油酸 (C16)、硬脂酸（C18)和油酸（C18)。棕榈酸是无支链的饱和脂肪酸，脂肪链具有16个碳原子 (碳原子/不饱和键：16. 0)。硬脂酸是无支链的饱和脂肪酸，脂肪链有18个碳原子（18. 0)。 棕榈油酸是单不饱和脂肪，脂肪链有16个碳原子（16. 1)。油酸是单不饱和脂肪，脂肪链有 18个碳原子（18. 1)。酵母中有少数脂肪酸种类包括C14和C26脂肪酸，这些在蛋白质修饰 中起至关重要的作用或分别作为鞘脂及GPI锚定物的组成部分。
[0056] 脂肪酸的从头合成利用了大量代谢物、乙酰-CoA、ATP和NADPH，因此与依赖于这 些化合物的其他细胞过程相竞争。脂肪酸延伸循环中有两个还原步骤都需要NADPH，这将脂 肪酸合成与细胞的代谢状态关联起来，使脂肪酸合成被限制在细胞具有高的能量负荷（表 现为ATP/AMP比率增加，还原性当量升高及乙酰-CoA库升高）的条件下。几乎所有亚细胞 细胞器都参与到脂肪酸代谢中，这表明脂肪酸平衡的维持需要在多种水平上进行调节。生 成用于脂质生物合成的代谢物、乙酰_CoA、ATP或NADPH的脂质合成步骤在本文中有时被称 为脂质合成的"推步骤"。例如通过过表达介导如代谢物生产过程的基因产物对增加细胞中 脂质生物合成的代谢物、乙酰-CoA、ATP或NADPH的生产的这些过程进行扩增，在本文有时 被称为"推修饰"。
[0057] 包括酵母在内的大多数生物体能够由多种碳源从头合成脂肪酸。在起始步骤中， 乙酰-CoA由乙酰-CoA羧化酶（ACC ;在酵母中由ACC1和HFA1编码）通过将C02添加到 丙二酰-CoA上进行羧化。生物素是该反应中一个至关重要的辅助因子，其通过生物素：载 脂蛋白连接酶（在酵母中由BPL1/ACC2编码）这种酶的作用共价连接于ACC载脂蛋白上。 ACC是一种具有三重功能的酶，其具有生物素羧基运载蛋白（BCCP)结构域、生物素-羧化酶 (BC)结构域和羧基转移酶（CT)结构域。在多数细菌中，这些结构域是作为单独的多肽表 达，并组装成异聚体复合物。相反，包括线粒体ACC变体（酵母中的Hfal)在内的真核ACC 是在单多肽上具有上述这些功能。由ACC产生的丙二酰-CoA在由脂肪酸合成酶、FAS和延 伸酶催化的循环系列反应中作为两个碳原子的供体发挥作用。
[0058] 从头开始的脂肪酸合成的直接产物是饱和脂肪酸。已知在包括酵母在内的真核细 胞中，饱和脂肪酸是不饱和脂肪酸的前体。通常不饱和脂肪酸是通过由特殊的酶类（称为 去饱和酶）对饱和脂肪酸中的C-C单键进行去饱和作用而产生的。对掌控饱和脂肪酸向不 饱和脂肪酸的转化的控制机制还没有得到深入了解。在真核细胞中，不饱和脂肪酸在膜的 流动性、细胞活性、代谢和控制基因转录的细胞核事件的调控中起重要作用。通常，酵母脂 肪酸的大约80%为单不饱和脂肪酸，这意味着它们在其脂肪链上含有一个不饱和键。
[0059] 脂肪酸是脂肪酸合成的有效抑制剂，脂肪酸对脂肪酸合成的反馈抑制是对微生物 进行工程改造用于油生产的主要障碍。本公开的一些方面是基于这样的认识，即尽管脂质 合成的推修饰通常不能盖过脂肪酸介导的脂质合成的反馈抑制，然而推修饰（例如ACC1过 表达）与拉修饰（例如DGA1过表达）的组合能有效地绕过反馈抑制，由此全面实现脂质合 成途径的碳流增加，例如在细胞的脂质小体或液泡中储存的TGA。
[0060] 本公开的一些方面提供了工程改造微生物用于油生产的策略。在一些实施方式 中，这些策略采用了对产油微生物如解脂酵母进行遗传工程改造，以同时扩增脂质合成的 推和拉步骤。如本文所公开的，使用这些策略使得产油酵母宿主细胞中的脂质生产得到显 著增加。
[0061] 本公开的一些方面基于这样的认识，即推-和-拉修饰如同时扩增生产脂质合成 途径的代谢物生产的代谢步骤及隔离脂质合成的合成产物介导的反馈抑制的代谢步骤，导 致进入脂质合成途径的碳流比只有推或只有拉修饰的工程改造情况得到显著增加。本发明 的一些方面涉及一项惊人的发现，即DGA1基因产物在产油微生物如解脂耶氏酵母中的过 表达导致向脂质合成途径中碳流的极大增加，同时过表达ACC1基因产物与DGA1过表达产 生协同作用，导致推-和-拉修饰的微生物具有碳流特性极大地增强，这一点适合于由多种 碳底物进行工业规模的油生产。
[0062] 对微生物中的代谢物生成步骤（如丙二酰-CoA的产生）以及产物隔离代谢步骤 (如二酰基甘油酰基化成为三酰基甘油）进行平衡的调控会使得进入脂质合成的净碳流 有显著增加，这一发现对在工程改造的细胞的帮助下以可再生碳源转化为生物燃料或生物 燃料前体为目标的过程具有重要意义。基于本发明的一些方面，现在对微生物如产油酵母 (如解脂耶氏酵母）的脂质合成代谢进行修饰是可以的，以这样的方式进行：赋予高度希 望的表型以进行工业规模的碳水化合物向生物燃料或生物燃料前体的转化，例如脂肪酸合 成、TAG合成，以及脂质小体或液泡中脂肪酸和TAG储存的极大增加。
[0063] 根据本发明的一些方面，在根据本文提供的方法微生物中修饰脂质代谢使得能够 生成优化的用于生物燃料或生物燃料前体生产过程的微生物，所述方法为例如同时过表达 介导代谢物生成（推）步骤的基因产物以及介导产物隔离（拉）步骤的基因产物。本发明 的一些方面提供了用于工程改造微生物中脂肪酸代谢的策略和方法，使得微生物中脂肪酸 及脂肪酸衍生物的合成速率及累积得到增加，这是通过同时扩增脂质生物合成的推步骤和 拉步骤而进行的。
[0064] 本发明的一些方面提供了方法，其包括遗传修饰，使得调控用于生物燃料或生物 燃料前体生产的微生物的脂质代谢的基因产物表达和/或活性得到调制。根据本发明的一 些方面，这些遗传修饰的目标是增加碳水化合物向脂肪酸和/或TAG的转化，以优化所修饰 的微生物用于由碳源（例如碳水化合物）的大规模生产脂质。根据本发明的一些方面所提 供的一些修饰，如对特定基因产物的过表达、敲除、敲低、激活和/或抑制可单独发挥作用 或与本领域技术人员已知的其他修饰组合而发挥作用。术语"修饰"指的是遗传操纵，例如 对特定基因产物的过表达、敲除、敲低、激活和/或抑制；以及非遗传操纵，例如对生长培养 基、底物、底物预处理、pH、温度、转化过程等等的操纵。
[0065] 基因表达的修饰-在本文也称作对基因表达的调制-可以是对天然的表 达调节的破坏或抑制，对给定基因的过表达、表达的抑制或完全消除。将异源启动子插 入原生基因序列，如原生DGA1或ACC1基因序列的上游，或在启动子内部删除调控序 列，如介导饱和脂肪酸对DGA1或ACC1基因的反馈抑制的调控序列，这些都是对表达的 天然调控的破坏或抑制的实例。用于调制基因表达的策略可包括遗传改变，例如通过 重组技术如基因靶向或病毒转导进行；或非遗传改变，例如对已知会导致基因表达上 调或下调的环境进行改变；或调制子的瞬时递送，例如将药物或小RNA分子递送至靶 标细胞。用于对微生物进行遗传和非遗传改变的方法对本领域技术人员已知，在例如 以下著作中有所描述：J. Sambrook 和 D. Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；3rd edition(January15, 2001)； David C.Amberg, Daniel J.Burke ；和 Jeffrey N.Strathern, Methods in Yeast Genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April2005) ；John N.Abelson, Melvin I.Simon,Christine Guthrie,和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volumel94(Methods in Enzymology Series, 194), Academic Press(Marchll, 2004)； Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, Volume350(Methods in Enzymology, V〇1350), Academic Press ； 1st edition(July2, 2002) ；Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C,Volume351, Academic Press ； 1st edition (July9,2002) ；Gregory N. Stephanopoulos,Aristos A. Aristidou 和 Jens Nielsen, Metabolic Engineering:Principles and Methodologies, Academic Press ；ledition(0ctoberl6, 1998)；以及 Christina Smolke, The Metabolic Pathway Engineering Handbook:Fundamentals,CRC Press ;ledition(July28, 2009)，其以全部并 入本文作为参考。宿主细胞包括细菌、酵母、藻类、昆虫、哺乳动物和植物细胞。
[0066] 如本文所使用的，术语"过表达"指的是给定基因产物在给定细胞、细胞类型或细 胞状态中表达水平相比于参考细胞得到增加，所述参考细胞为例如相同细胞类型的野生型 细胞或相同细胞类型但缺乏特定修饰（例如遗传修饰）的细胞。解脂耶氏酵母细胞中DGA1 和/或ACC1基因的驱动的持续表达显示浓度饱和脂肪酸，这样的浓度会在野生型细胞中抑 制DGA1或ACC1基因表达，这是基因过表达的一个实例。
[0067] 本发明一些方面提供了用于操纵微生物中二酰基甘油酰基转移酶1(DGA1)基因 产物的活性用于生物燃料或生物燃料前体生产的方法。DGA1基因编码酰基转移酶，其催化 三酰基甘油（TAG)形成的最后一步，使用酰基-CoA作为酰基供体对二酰基甘油进行酰基化 作用。此酰基转移酶反应的结果是产生了三酰基甘油，其不会显示像脂肪酸本身那样的对 脂肪酸合成的抑制反馈效应。TAG通常储存在产脂细胞的脂质小体或液泡中。在一些实施 方式中，所述的操纵为过表达。在一些实施方式中，所述操纵是通过将用于生物燃料或生物 燃料前体生产的微生物与包含编码DGA1基因产物（例如DGAT2蛋白质）并可操作地连接于 异源启动子如组成型或诱导型启动子的核酸的表达构建体接触而产生效应的。在一些实施 方式中，编码DGA1基因产物的核酸包含SEQ ID NO: 1的编码序列。在一些实施方式中，所述 DGA1为解脂耶氏酵母DGA1，例如包含SEQ ID勵:2的氨基酸序列的解脂耶氏酵母06八1。在 一些实施方式中，所述微生物为解脂耶氏酵母。在一些实施方式中，对微生物中DGA1基因 产物活性的操纵能够赋予其有益的表型以将碳水化合物大规模地转化为脂质，所述表型为 例如增加的脂肪合成速率、增加的碳水化合物至脂质的转化效率、增加的脂质储存和、增加 的生长速率、对碳源或脂质产物浓度升高的耐受性增加。DGA1基因及基因产物序列对于本 领域技术人员是已知的。示例性地，代表基因和基因产物序列可在NCBI数据库（www.ncbi. nlm. nih. gov)中以索引号 XM_504700 找到。
[0068] DGA1核酸及蛋白质序列的合适序列的非限制性实例在下文提供。其他的合适的 DGA1序列，包括来自其他物种的序列对本领域技术人员是清楚的，本发明在此方面并不受 到限制。
[0069] >gi | 5〇554582 | ref | ΧΜ_5〇47〇0· 11 解脂耶氏酵母 YALI0E32769p (YALI0E32769g) mRNA,完全 cds
[0070] ATGACTATCGACTCACAATACTACAAGTCGCGAGACAAAAACGACACGGCACCCAAAATCGCGGGAATC CGATATGCCCCGCTATCGACACCATTACTCAACCGATGTGAGACCTTCTCTCTGGTCTGGCACATTTTCAGCATTCC CACTTTCCTCACAATTTTCATGCTATGCTGCGCAATTCCACTGCTCTGGCCATTTGTGATTGCGTATGTAGTGTACG CTGTTAAAGACGACTCCCCGTCCAACGGAGGAGTGGTCAAGCGATACTCGCCTATTTCAAGAAACTTCTTCATCTGG AAGCTCTTTGGCCGCTACTTCCCCATAACTCTGCACAAGACGGTGGATCTGGAGCCCACGCACACATACTACCCTCT GGACGTCCAGGAGTATCACCTGATTGCTGAGAGATACTGGCCGCAGAACAAGTACCTCCGAGCAATCATCTCCACCA TCGAGTACTTTCTGCCCGCCTTCATGAAACGGTCTCTTTCTATCAACGAGCAGGAGCAGCCTGCCGAGCGAGATCCT CTCCTGTCTCCCGTTTCTCCCAGCTCTCCGGGTTCTCAACCTGACAAGTGGATTAACCACGACAGCAGATATAGCCG TGGAGAATCATCTGGCTCCAACGGCCACGCCTCGGGCTCCGAACTTAACGGCAACGGCAACAATGGCACCACTAACC GACGACCTTTGTCGTCCGCCTCTGCTGGCTCCACTGCATCTGATTCCACGCTTCTTAACGGGTCCCTCAACTCCTAC GCCAACCAGATCATTGGCGAAAACGACCCACAGCTGTCGCCCACAAAACTCAAGCCCACTGGCAGAAAATACATCTT CGGCTACCACCCCCACGGCATTATCGGCATGGGAGCCTTTGGTGGAATTGCCACCGAGGGAGCTGGATGGTCCAAGC TCTTTCCGGGCATCCCTGTTTCTCTTATGACTCTCACCAACAACTTCCGAGTGCCTCTCTACAGAGAGTACCTCATG AGTCTGGGAGTCGCTTCTGTCTCCAAGAAGTCCTGCAAGGCCCTCCTCAAGCGAAACCAGTCTATCTGCATTGTCGT TGGTGGAGCACAGGAAAGTCTTCTGGCCAGACCCGGTGTCATGGACCTGGTGCTACTCAAGCGAAAGGGTTTTGTTC GACTTGGTATGGAGGTCGGAAATGTCGCCCTTGTTCCCATCATGGCCTTTGGTGAGAACGACCTCTATGACCAGGTT AGCAACGACAAGTCGTCCAAGCTGTACCGATTCCAGCAGTTTGTCAAGAACTTCCTTGGATTCACCCTTCCTTTGAT GCATGCCCGAGGCGTCTTCAACTACGATGTCGGTCTTGTCCCCTACAGGCGACCCGTCAACATTGTGGTTGGTTCCC CCATTGACTTGCCTTATCTCCCACACCCCACCGACGAAGAAGTGTCCGAATACCACGACCGATACATCGCCGAGCTG CAGCGAATCTACAACGAGCACAAGGATGAATATTTCATCGATTGGACCGAGGAGGGCAAAGGAGCCCCAGAGTTCCG AATGATTGAGTAA(SEQ ID N0:1)
[0071] >gi I 5〇554583 I ref I XP_5〇47〇0. 11YALI0E32769P [解脂耶氏酵母]
[0072] MTIDSQYYKSRDKNDTAPKIAGIRYAPLSTPLLNRCETFSLVWHIFSIPTFLTIFMLCCAIPLLWPFVI AYVVYAVKDDSPSNGGVVKRYSPISRNFFIWKLFGRYFPITLHKTVDLEPTHTYYPLDVQEYHLIAERYWPQNKYLR AIISTIEYFLPAFMKRSLSINEQEQPAERDPLLSPVSPSSPGSQPDKWINHDSRYSRGESSGSNGHASGSELNGNGN NGTTNRRPLSSASAGSTASDSTLLNGSLNSYANQIIGENDPQLSPTKLKPTGRKYIFGYHPHGIIGMGAFGGIATEG AGWSKLFPGIPVSLMTLTNNFRVPLYREYLMSLGVASVSKKSCKALLKRNQSICIVVGGAQESLLARPGVMDLVLLK RKGFVRLGMEVGNVALVPIMAFGENDLYDQVSNDKSSKLYRFQQFVKNFLGFTLPLMHARGVFNYDVGLVPYRRPVN IVVGSPIDLPYLPHPTDEEVSEYHDRYIAELQRIYNEHKDEYFIDWTEEGKGAPEFRMIE(SEQ ID NO:2)
[0073] 本发明的一些方面提供了用于在用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物如 解脂耶氏酵母中操纵乙酰-CoA羧化酶（ACC)基因产物的方法。ACC基因产物介导了乙 酰-CoA向丙二酰-CoA的转化，其中前者为脂肪酸合成中主要的C2-前体，此步骤被认为是 脂肪酸合成中第一个关键步骤，因此被认为也是脂肪酸合成中的限速步骤（见Cao Y，Yang J,Xian M,Xu X,Liu W. Increasing unsaturated fatty acid contents in Escherichia coli by coexpression of three different genes. Appl Microbiol Biotechnol. 2010)〇 在一些实施方式中，ACC活性操纵是将ACC进行过表达。在一些实施方式中，所述操纵是通 过将用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物与包含编码ACC基因产物（例如ACC1蛋 白）的核酸的表达构建体接触而实现，所述核酸可操作地连接于异源启动子如组成型或诱 导型启动子。在一些实施方式中，编码ACC基因产物的核酸包含SEQ ID N0:3的编码序列。 在一些实施方式中，ACC基因产物是包含SEQ ID N0:4氨基酸序列的ACC1蛋白质。在一些 实施方式中，微生物中ACC的过表达增加了脂肪酸合成速率及/或赋予微生物有益的表型， 用于将碳水化合物大规模转化为生物燃料或生物燃料前体，例如增加的脂质合成速率、增 加的碳水化合物向脂质转化效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、增加的对特定物 质如碳源、生物燃料或生物燃料前体的浓度的耐受性。ACC基因及基因产物序列对本领域技 术人员是已知的。示例性地，代表基因和基因产物序列可在NCBI数据库（www. ncbi.nlm. nih. gov)中在登记号GenelD:855750和2909424的条目下，或以索引号NC_006069找到。
[0074] 合适的ACC核酸序列和蛋白质序列的非限制性实例在下文提供。其他的合适的 ACC序列，包括来自其他物种的序列对本领域技术人员是清楚的，本发明在此方面并不受到 限制。
[0075] ACC编码核酸序列：
[0076] atgcgactgcaattgaggacactaacacgtcggtttttcaggtgagtaaacgacggtggccgtggc ca cgacagccgaggcgtcacgatgggccagacgagcacattctcgccgccacaacctcgccagca caagaaactaacc cagtatggcttcaggatcttcaacgccagatgtggctcccttggtggacccca acattcacaaaggtctcgcctct catttctttggactcaattctgtccacacagccaagccctcaaaa gtcaaggagtttgtggcttctcacggaggtc atacagttatcaacaaggtgagtatttgacgtttaga ctgtataacaggcggccgcagtgcaacaacgaccaaaaa gggtcgaaaaagggtcgaaaacgg acacaaaagctggaaaacaagagtgtaatacattcttacacgtccaattgtt agacaaacacggct gttcggtcccaaaaccaccagtatcacctattttccacttgtgtctcggatctgatcataat ctgatct caagatgaaatttacgccaccgacatgatattgtgattttcggattctccagaccgagcagattcca g caataccaccacttgcccaccttcagcggcctctcggcgcgattcgccactttccccaacgagtgtt actaaccca ggtcctcatcgctaacaacggtattgccgcagtaaaggagatccgttcagtacgaaa atgggcctacgagaccttt ggcgacgagcgagcaatctcgttcaccgtcatggccacccccgaaga tctcgctgccaacgccgactacattagaa tggccgatcagtacgtcgaggtgcccggaggaaccaa caacaacaactacgccaacgtcgagctgattgtcgacgt ggctgagcgattcggcgtcgatgccgt 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atccttccaaggtcaagcatgccaagccctttgagggccagcttcccgagcttggaccccccactct cage ggtaacaagcctcatcagcgatacgagcactgccagaacgtgctccataacattctgcttgg tttcgataaccagg tggtgatgaagtccactcttcaggagatggttggtctgctccgaaaccctgag cttccttatctccagtgggctca tcaggtgtcttctctgcacacccgaatgagcgccaagctggatgc tactcttgctggtctcattgacaaggccaag cagcgaggtggcgagtttcctgccaagcagcttctg cgagcccttgagaaggaggcgagctctggcgaggtcgatg cgctcttccagcaaactcttgctcctc tgtttgaccttgctcgagagtaccaggacggtcttgctatccacgagct tcaggttgctgcaggcctt ctgcaggcctactacgactctgaggcccggttctgcggacccaacgtacgtgacgag gatgtcattc tcaagcttcgagaggagaaccgagattctcttcgaaaggttgtgatggcccagctgtctcattctc g agtcggagccaagaacaaccttgtgctggcccttctcgatgaatacaaggtggccgaccaggctgg caccgact ctcctgcctccaacgtgcacgttgcaaagtacttgcgacctgtgctgcgaaagattgtg gagctggaatctcgagc ttctgccaaggtatctctgaaagcccgagagattctcatccagtgcgctc tgccctctctaaaggagcgaactgac cagcttgagcacattctgcgatcttctgtcgtcgagtctcga tacggagaggttggtctggagcaccgaactcccc gagccgatattctcaaggaggttgtcgactcc aagtacattgtctttgatgtgcttgcccagttctttgcccacga tgatccctggatcgtccttgctgccc tggagctgtacatccgacgagcttgcaaggcctactccatcctggacatc aactaccaccaggact cggacctgcctcccgtcatctcgtggcgatttagactgcctaccatgtcgtctgctttgt acaactcag tagtgtcttctggctccaaaacccccacttccccctcggtgtctcgagctgattccgtctccgactt ttc gtacaccgttgagcgagactctgctcccgctcgaaccggagcgattgttgccgtgcctcatctggat gatct ggaggatgctctgactcgtgttctggagaacctgcccaaacggggcgctggtcttgccatct ctgttggtgctagc aacaagagtgccgctgcttctgctcgtgacgctgctgctgctgccgcttcatcc gttgacactggcctgtccaaca tttgcaacgttatgattggtcgggttgatgagtctgatgacgacga cactctgattgcccgaatctcccaggtcat tgaggactttaaggaggactttgaggcctgttctctgc gacgaatcaccttctccttcggcaactcccgaggtact tatcccaagtatttcacgttccgaggcccc gcatacgaggaggaccccactatccgacacattgagcctgctctgg ccttccagctggagctcgcc cgtctgtccaacttcgacatcaagcctgtccacaccgacaaccgaaacatccacgt gtacgaggct actggcaagaacgctgcttccgacaagcggttcttcacccgaggtatcgtacgacctggtcgtctt c gagagaacatccccacctcggagtatctcatttccgaggctgaccggctcatgagcgatattttgga cgctcta gaggtgattggaaccaccaactcggatctcaaccacattttcatcaacttctcagccgtct ttgctctgaagcccg aggaggttgaagctgcctttggcggtttcctggagcgatttggccgacgtctg tggcgacttcgagtcaccggtgc cgagatccgaatgatggtatccgaccccgaaactggctctgctt tccctctgcgagcaatgatcaacaacgtctct ggttacgttgtgcagtctgagctgtacgctgaggcc aagaacgacaagggccagtggattttcaagtctctgggca agcccggctccatgcacatgcggtct atcaacactccctaccccaccaaggagtggctgcagcccaagcggtacaa ggcccatctgatgggt accacctactgctatgacttccccgagctgttccgacagtccattgagtcggactggaag aagtatg acggcaaggctcccgacgatctcatgacttgcaacgagctgattctcgatgaggactctggcgagc tg caggaggtgaaccgagagcccggcgccaacaacgtcggtatggttgcgtggaagtttgaggcc aagacccccgagt accctcgaggccgatctttcatcgtggtggccaacgatatcaccttccagattg gttcgtttggccctgctgagga ccagttcttcttcaaggtgacggagctggctcgaaagctcggtatt cctcgaatctatctgtctgccaactctggt gctcgaatcggcattgctgacgagctcgttggcaagta caaggttgcgtggaacgacgagactgacccctccaagg gcttcaagtacctttacttcacccctgag tctcttgccaccctcaagcccgacactgttgtcaccactgagattga ggaggagggtcccaacggc gtggagaagcgtcatgtgatcgactacattgtcggagagaaggacggtctcggagtc gagtgtctg cggggctctggtctcattgcaggcgccacttctcgagcctacaaggatatcttcactctcactcttg tc acctgtcgatccgttggtatcggtgcttaccttgttcgtcttggtcaacgagccatccagattgagggc cage ccatcattctcactggtgcccccgccatcaacaagctgcttggtcgagaggtctactcttccaa ettgeagettgg tggtactcagatcatgtacaacaacggtgtgtctcatctgactgcccgagatgate tcaacggtgtccacaagatc atgcagtggctgtcatacatccctgcttctcgaggtcttccagtgcct gttctccctcacaagaccgatgtgtggg atcgagacgtgacgttccagcctgtccgaggcgagcag tacgatgttagatggcttatttctggccgaactctcga ggatggtgctttcgagtctggtctctttgac aaggactctttccaggagactctgtctggctgggccaagggtgtt gttgttggtcgagctcgtcttgg cggcattcccttcggtgtcattggtgtcgagactgcgaccgtcgacaatacta cccctgccgatcccg ccaacccggactctattgagatgagcacctctgaagccggccaggtttggtaccccaactc ggcctt caagacctctcaggccatcaacgacttcaaccatggtgaggcgcttcctctcatgattcttgctaact g gcgaggcttttctggtggtcagcgagacatgtacaatgaggttctcaagtacggatctttcattgtt gatgctctg gttgactacaagcagcccatcatggtgtacatccctcccaccggtgagetgcgaggtg gttcttgggttgtggttg accccaccatcaactcggacatgatggagatgtacgctgacgtcgagtct cgaggtggtgtgctggagcccgaggg aatggtcggtatcaagtaccgacgagacaagctactgga caccatggctcgtctggatcccgagtactcctctctc aagaagcagcttgaggagtctcccgattctg aggagctcaaggtcaagctcagcgtgcgagagaagtctctcatgc ccatctaccagcagatctccg tgcagtttgccgacttgcatgaccgagctggccgaatggaggccaagggtgtcat tegtgaggetet tgtgtggaaggatgctcgtcgattcttcttctggcgaatccgacgacgattagtcgaggagtac ctca ttaccaagatcaatagcattctgccctcttgcactcggcttgagtgtctggctcgaatcaagtcgtgg aag cctgccactcttgatcagggctctgaccggggtgttgccgagtggtttgacgagaactctgatg ccgtctctgctc gactcagcgagctcaagaaggacgcttctgcccagtcgtttgcttctcaactgaga aaggaccgacagggtactct ccagggcatgaagcaggctctcgcttctctttctgaggctgagcgg getgagetgctcaaggggttgtga (SEQ ID NO :3)
[0077] >gi |5〇5485〇3|ref|XP_5〇l 72l. 1 |YALIOCll4〇7p [解脂耶氏酵母]
[0078] MRLQLRTLTRRFFSMASGSSTPDVAPLVDPNIHKGLASHFFGLNSVHTAKPSKVKEFVASHGGHTVINK VLIANNGIAAVKEIRSVRKWAYETFGDERAISFTVMATPEDLAANADYIRMADQYVEVPGGTNNNNYANVELIVDVA ERFGVDAVWAGWGHASENPLLPESLAASPRKIVFIGPPGAAMRSLGDKISSTIVAQHAKVPCIPWSGTGVDEVVVDK STNLVSVSEEVYTKGCTTGPKQGLEKAKQIGFPVMIKASEGGGGKGIRKVEREEDFEAAYHQVEGEIPGSPIFIMQL AGNARHLEVQLLADQYGNNISLFGRDCSVQRRHQKIIEEAPVTVAGQQTFTAMEKAAVRLGKLVGYVSAGTVEYLYS HEDDKFYFLELNPRLQVEHPTTEMVTGVNLPAAQLQIAMGIPLDRIKDIRLFYGVNPHTTTPIDFDFSGEDADKTQR RPVPRGHTTACRITSEDPGEGFKPSGGTMHELNFRSSSNVWGYFSVGNQGGIHSFSDSQFGHIFAFGENRSASRKHM VVALKELSIRGDFRTTVEYLIKLLETPDFEDNTITTGWLDELISNKLTAERPDSFLAVVCGAATKAHRASEDSIATY MASLEKGQVPARDILKTLFPVDFIYEGQRYKFTATRSSEDSYTLFINGSRCDIGVRPLSDGGILCLVGGRSHNVYWK EEVGATRLSVDSKTCLLEVENDPTQLRSPSPGKLVKFLVENGDHVRANQPYAEIEVMKMYMTLTAQEDGIVQLMKQP GSTIEAGDILGILALDDPSKVKHAKPFEGQLPELGPPTLSGNKPHQRYEHCQNVLHNILLGFDNQVVMKSTLQEMVG LLRNPELPYLQWAHQVSSLHTRMSAKLDATLAGLIDKAKQRGGEFPAKQLLRALEKEASSGEVDALFQQTLAPLFDL AREYQDGLAIHELQVAAGLLQAYYDSEARFCGPNVRDEDVILKLREENRDSLRKVVMAQLSHSRVGAKNNLVLALLD EYKVADQAGTDSPASNVHVAKYLRPVLRKIVELESRASAKVSLKAREILIQCALPSLKERTDQLEHILRSSVVESRY GEVGLEHRTPRADILKEVVDSKYIVFDVLAQFFAHDDPWIVLAALELYIRRACKAYSILDINYHQDSDLPPVISWRF RLPTMSSALYNSVVSSGSKTPTSPSVSRADSVSDFSYTVERDSAPARTGAIVAVPHLDDLEDALTRVLENLPKRGAG LAISVGASNKSAAASARDAAAAAASSVDTGLSNICNVMIGRVDESDDDDTLIARISQVIEDFKEDFEACSLRRITFS FGNSRGTYPKYFTFRGPAYEEDPTIRHIEPALAFQLELARLSNFDIKPVHTDNRNIHVYEATGKNAASDKRFFTRGI VRPGRLRENIPTSEYLISEADRLMSDILDALEVIGTTNSDLNHIFINFSAVFALKPEEVEAAFGGFLERFGRRLWRL RVTGAEIRMMVSDPETGSAFPLRAMINNVSGYVVQSELYAEAKNDKGQWIFKSLGKPGSMHMRSINTPYPTKEWLQP KRYKAHLMGTTYCYDFPELFRQSIESDWKKYDGKAPDDLMTCNELILDEDSGELQEVNREPGANNVGMVAWKFEAKT PEYPRGRSFIVVANDITFQIGSFGPAEDQFFFKVTELARKLGIPRIYLSANSGARIGIADELVGKYKVAWNDETDPS KGFKYLYFTPESLATLKPDTVVTTEIEEEGPNGVEKRHVIDYIVGEKDGLGVECLRGSGLIAGATSRAYKDIFTLTL VTCRSVGIGAYLVRLGQRAIQIEGQPIILTGAPAINKLLGREVYSSNLQLGGTQIMYNNGVSHLTARDDLNGVHKIM QffLSYIPASRGLPVPVLPHKTDVWDRDVTFQPVRGEQYDVRWLISGRTLEDGAFESGLFDKDSFQETLSGWAKGVVV GRARLGGIPFGVIGVETATVDNTTPADPANPDSIEMSTSEAGQVWYPNSAFKTSQAINDFNHGEALPLMILANWRGF SGGQRDMYNEVLKYGSFIVDALVDYKQPIMVYIPPTGELRGGSWVVVDPTINSDMMEMYADVESRGGVLEPEGMVGI KYRRDKLLDTMARLDPEYSSLKKQLEESPDSEELKVKLSVREKSLMPIYQQISVQFADLHDRAGRMEAKGVIREALV WKDARRFFFWRIRRRLVEEYLITKINSILPSCTRLECLARIKSWKPATLDQGSDRGVAEffFDENSDAVSARLSELKK DASAQSFASQLRKDRQGTLQGMKQALASLSEAERAELLKGL(SEQ ID NO:4).
[0079] 本发明的一些方面提供了用于在用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物中 操纵硬脂酰-CoA-去饱和酶（S⑶）活性的方法。S⑶是一种Λ 9去饱和酶，其能够在偶联 于CoA的硬脂酸的C9和C10之间插入双键，这是生成去饱和脂肪酸及其衍生物的一个关键 步骤，这在本文其他地方有更详尽的描述。在一些实施方式中，所述操纵是进行过表达。在 一些实施方式中，所述操纵是通过将用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物与包含编 码SCD基因产物（例如SCD蛋白）的核酸的表达构建体接触而实现，所述核酸可操作地连 接于异源启动子如组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码SCD基因产物的核酸 包含SEQ ID N0:5的编码序列。在一些实施方式中，S⑶基因产物是解脂耶氏酵母的S⑶， 例如包含SEQ ID N0:6氨基酸序列的解脂耶氏酵母SCD。在一些实施方式中，所述微生物为 解脂耶氏酵母在一些实施方式中，微生物中对SCD活性的操纵赋予微生物有益的表型，用 于将碳水化合物大规模转化为生物燃料或生物燃料前体，例如增加的脂质合成速率、增加 的碳水化合物向脂质转化效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、增加的对碳源或脂 质产物浓度升高的耐受性。硬脂酰-CoA去饱和酶基因及基因产物序列对本领域技术人员 是已知的。示例性地，代表基因和基因产物序列可在NCBI数据库（www. ncbi. nlm. nih. gov) 中在登记号GenelD :852825的条目下找到。
[0080] 合适的SCD核酸序列和蛋白质序列的非限制性实例在下文提供。其他的合适的 SCD序列，包括来自其他物种的序列对本领域技术人员是清楚的，本发明在此方面并不受到 限制。
[0081] >gi |5〇548〇52|ref|XM_5〇l 496· 11 解脂耶氏酵母 YALIOC〇595lp(YALIOC〇595lg) mRNA,完整 cds
[0082] ATGGTGAAAAACGTGGACCAAGTGGATCTCTCGCAGGTCGACACCATTGCCTCCGGCCGAGATGTCAAC TACAAGGTCAAGTACACCTCCGGCGTTAAGATGAGCCAGGGCGCCTACGACGACAAGGGCCGCCACATTTCCGAGCA GCCCTTCACCTGGGCCAACTGGCACCAGCACATCAACTGGCTCAACTTCATTCTGGTGATTGCGCTGCCTCTGTCGT CCTTTGCTGCCGCTCCCTTCGTCTCCTTCAACTGGAAGACCGCCGCGTTTGCTGTCGGCTATTACATGTGCACCGGT CTCGGTATCACCGCCGGCTACCACCGAATGTGGGCCCATCGAGCCTACAAGGCCGCTCTGCCCGTTCGAATCATCCT TGCTCTGTTTGGAGGAGGAGCTGTCGAGGGCTCCATCCGATGGTGGGCCTCGTCTCACCGAGTCCACCACCGATGGA CCGACTCCAACAAGGACCCTTACGACGCCCGAAAGGGATTCTGGTTCTCCCACTTTGGCTGGATGCTGCTTGTGCCC AACCCCAAGAACAAGGGCCGAACTGACATTTCTGACCTCAACAACGACTGGGTTGTCCGACTCCAGCACAAGTACTA CGTTTACGTTCTCGTCTTCATGGCCATTGTTCTGCCCACCCTCGTCTGTGGCTTTGGCTGGGGCGACTGGAAGGGAG GTCTTGTCTACGCCGGTATCATGCGATACACCTTTGTGCAGCAGGTGACTTTCTGTGTCAACTCCCTTGCCCACTGG ATTGGAGAGCAGCCCTTCGACGACCGACGAACTCCCCGAGACCACGCTCTTACCGCCCTGGTCACCTTTGGAGAGGG CTACCACAACTTCCACCACGAGTTCCCCTCGGACTACCGAAACGCCCTCATCTGGTACCAGTACGACCCCACCAAGT GGCTCATCTGGACCCTCAAGCAGGTTGGTCTCGCCTGGGACCTCCAGACCTTCTCCCAGAACGCCATCGAGCAGGGT CTCGTGCAGCAGCGACAGAAGAAGCTGGACAAGTGGCGAAACAACCTCAACTGGGGTATCCCCATTGAGCAGCTGCC TGTCATTGAGTTTGAGGAGTTCCAAGAGCAGGCCAAGACCCGAGATCTGGTTCTCATTTCTGGCATTGTCCACGACG TGTCTGCCTTTGTCGAGCACCACCCTGGTGGAAAGGCCCTCATTATGAGCGCCGTCGGCAAGGACGGTACCGCTGTC TTCAACGGAGGTGTCTACCGACACTCCAACGCTGGCCACAACCTGCTTGCCACCATGCGAGTTTCGGTCATTCGAG GCGGCATGGAGGTTGAGGTGTGGAAGACTGCCCAGAACGAAAAGAAGGACCAGAACATTGTCTCCGATGAGAGTGGA AACCGAATCCACCGAGCTGGTCTCCAGGCCACCCGGGTCGAGAACCCCGGTATGTCTGGCATGGCTGCTTAG(SEQ ID NO :5)
[0083] >gi I 5〇548〇53 I ref I XP_5〇l496· 11 YALIOC〇595lp [解脂耶氏酵母]
[0084] MVKNVDQVDLSQVDTIASGRDVNYKVKYTSGVKMSQGAYDDKGRHISEQPFTWANWHQHINWLNFILVI ALPLSSFAAAPFVSFNWKTAAFAVGYYMCTGLGITAGYHRMWAHRAYKAALPVRIILALFGGGAVEGSIRffffASSHR VHHRWTDSNKDPYDARKGFWFSHFGWMLLVPNPKNKGRTDISDLNNDffVVRLQHKYYVYVLVFMAIVLPTLVCGFGW GDWKGGLVYAGIMRYTFVQQVTFCVNSLAHWIGEQPFDDRRTPRDHALTALVTFGEGYHNFHHEFPSDYRNALIWYQ YDPTKWLIWTLKQVGLAWDLQTFSQNAIEQGLVQQRQKKLDKffRNNLNWGIPIEQLPVIEFEEFQEQAKTRDLVLIS GIVHDVSAFVEHHPGGKALIMSAVGKDGTAVFNGGVYRHSNAGHNLLATMRVSVIRGGMEVEVWKTAQNEKKDQNIV SDESGNRIHRAGLQATRVENPGMSGMAA(SEQ ID NO :6)
[0085] 本发明的一些方面提供了用于在用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物中 操纵ATP-柠檬酸裂解酶（ACL)活性的方法。ACL通过裂解作为TCA循环产物从线粒体中 穿梭出来的柠檬酸而提供细胞溶胶乙酰-CoA。ACL基因产物将柠檬酸裂解为草酰乙酸和乙 酰-CoA，由此为ACC提供了乙酰-CoA底物，后者随后介导乙酰-C 〇A(这是脂肪酸合成中的 主要C2-前体）向丙二酰-CoA的转化，这一过程被视为脂肪酸合成中的第一关键步骤并 在本文其他地方会有更详尽的描述。在一些实施方式中，ACL基因产物是由分别的基因编码 的两个亚基组成的蛋白质。在一些实施方式中，ACL基因产物是由相同基因编码的两个亚基 组成的。在一些实施方式中，所述操纵是进行过表达。在一些实施方式中，所述操纵是通过 将用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物与包含编码ACL基因产物（例如ACL蛋白） 的核酸的表达构建体接触而实现，所述核酸可操作地连接于异源启动子如组成型或诱导型 启动子。在一些实施方式中，编码ACL基因产物的核酸包含SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:9 的编码序列。在一些实施方式中，所述ACL是解脂耶氏酵母的ACL，例如包含SEQ ID NO: 8 和SEQ ID N0:10氨基酸序列的解脂耶氏酵母ACL。在一些实施方式中，所述微生物为解脂 耶氏酵母。在一些实施方式中，微生物中对ACL活性的操纵赋予微生物有益的表型，用于将 碳水化合物大规模转化为生物燃料或生物燃料前体，例如增加的脂质合成速率、增加的碳 水化合物向脂质转化效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、增加的对碳源或脂质产 物浓度升高的耐受性。ATP-柠檬酸裂解酶基因及基因产物序列对本领域技术人员是已知 的。示例性地，代表基因和基因产物序列可在NCBI数据库（www. ncbi. nlm. nih. gov)中在 GeneID:2912101 和 2910381 的条目下找到。
[0086] 合适的ACL核酸序列和蛋白质序列的非限制性实例在下文提供。其他的合适的 ACL序列，包括来自其他物种的序列对本领域技术人员是清楚的，本发明在此方面并不受到 限制。
[0087] ATP柠檬酸裂解酶（解脂耶氏酵母）亚基1，ACL1DNA
[0088] YALI0E34793g
[0089] XM-504787
[0090] atgtctgccaacgagaacatctcccgattcgacgcccctgtgggcaaggagcaccccgcctacgag ct cttccataaccacacacgatctttcgtctatggtctccagcctcgagcctgccagggtatgctgga cttcgacttc atctgtaagcgagagaacccctccgtggccggtgtcatctatcccttcggcggccagt tcgtcaccaagatgtact ggggcaccaaggagactcttctccctgtctaccagcaggtcgagaagg ccgctgccaagcaccccgaggtcgatgt cgtggtcaactttgcctcctctcgatccgtctactcctcta ccatggagctgctcgagtacccccagttccgaacc atcgccattattgccgagggtgtccccgagcg acgagcccgagagatcctccacaaggcccagaagaagggtgtga ccatcattggtcccgctaccg tcggaggtatcaagcccggttgcttcaaggttggaaacaccggaggtatgatgga caacattgtcg cctccaagctctaccgacccggctccgttgcctacgtctccaagtccggaggaatgtccaacgag ct gaacaacattatctctcacaccaccgacggtgtctacgagggtattgctattggtggtgaccgatac cctggt actaccttcattgaccatatcctgcgatacgaggccgaccccaagtgtaagatcatcgtcct ccttggtgaggttg gtggtgttgaggagtaccgagtcatcgaggctgttaagaacggccagatcaa gaagcccatcgtcgcttgggccat tggtacttgtgcctccatgttcaagactgaggttcagttcggcc acgccggctccatggccaactccgacctggag actgccaaggctaagaacgccgccatgaagtct gctggcttctacgtccccgataccttcgaggacatgcccgagg tccttgccgagctctacgagaaga tggtcgccaagggcgagctgtctcgaatctctgagcctgaggtccccaagat ccccattgactactc ttgggcccaggagcttggtcttatccgaaagcccgctgctttcatctccactatttccgat gaccgag gccaggagcttctgtacgctggcatgcccatttccgaggttttcaaggaggacattggtatcggcgg t gtcatgtctctgctgtggttccgacgacgactccccgactacgcctccaagtttcttgagatggttct catgctta ctgctgaccacggtcccgccgtatccggtgccatgaacaccattatcaccacccgagct ggtaaggatctcatttc ttccctggttgctggtctcctgaccattggtacccgattcggaggtgctctt gacggtgctgccaccgagttcacc actgcctacgacaagggtctgtccccccgacagttcgttgata ccatgcgaaagcagaacaagctgattcctggta ttggccatcgagtcaagtctcgaaacaaccccg atttccgagtcgagcttgtcaaggactttgttaagaagaactt cccctccacccagctgctcgactac gcccttgctgtcgaggaggtcaccacctccaagaaggacaacctgattctg aacgttgacggtgct attgctgtttcttttgtcgatctcatgcgatcttgcggtgcctttactgtggaggagactg aggactac ctcaagaacggtgttctcaacggtctgttcgttctcggtcgatccattggtctcattgcccaccatct c gatcagaagcgactcaagaccggtctgtaccgacatccttgggacgatatcacctacctggttggc caggaggc tatccagaagaagcgagtcgagatcagcgccggcgacgtttccaaggccaagactc gatcatag(SEQ ID NO :7)
[0091] ATP柠檬酸裂解酶（解脂耶氏酵母）亚基1，ACL1蛋白质
[0092] YALI0E34793p
[0093] XP_504787
[0094] MSANENISRFDAPVGKEHPAYELFHNHTRSFVYGLQPRACQGMLDFDFICKRENPSVAGVIYPFGGQFV TKMYWGTKETLLPVYQQVEKAAAKHPEVDVVVNFASSRSVYSSTMELLEYPQFRTIAIIAEGVPERRAREILHKAQK KGVTIIGPATVGGIKPGCFKVGNTGGMMDNIVASKLYRPGSVAYVSKSGGMSNELNNIISHTTDGVYEGIAIGGDRY PGTTFIDHILRYEADPKCKIIVLLGEVGGVEEYRVIEAVKNGQIKKPIVAWAIGTCASMFKTEVQFGHAGSMANSDL ETAKAKNAAMKSAGFYVPDTFEDMPEVLAELYEKMVAKGELSRISEPEVPKIPIDYSWAQELGLIRKPAAFISTISD DRGQELLYAGMPISEVFKEDIGIGGVMSLLWFRRRLPDYASKFLEMVLMLTADHGPAVSGAMNTIITTRAGKDLISS LVAGLLTIGTRFGGALDGAATEFTTAYDKGLSPRQFVDTMRKQNKLIPGIGHRVKSRNNPDFRVELVKDFVKKNFPS TQLLDYALAVEEVTTSKKDNLILNVDGAIAVSFVDLMRSCGAFTVEETEDYLKNGVLNGLFVLGRSIGLIAHHLDQK RLKTGLYRHPWDDITYLVGQEAIQKKRVEISAGDVSKAKTRS(SEQ ID N0:8)
[0095] ATP柠檬酸裂解酶（解脂耶氏酵母）亚基2, ACL2DNA
[0096] YALI0D24431g
[0097] XM-503231
[0098] atgtcagcgaaatccattcacgaggccgacggcaaggccctgctcgcacactttctgtccaaggcg cc cgtgtgggccgagcagcagcccatcaacacgtttgaaatgggcacacccaagctggcgtctctg acgttcgaggac ggcgtggcccccgagcagatcttcgccgccgctgaaaagacctacccctggctg ctggagtccggcgccaagtttg tggccaagcccgaccagctcatcaagcgacgaggcaaggccgg cctgctggtactcaacaagtcgtgggaggagtg caagccctggatcgccgagcgggccgccaagc ccatcaacgtggagggcattgacggagtgctgcgaacgttcctg gtcgagccctttgtgccccacg accagaagcacgagtactacatcaacatccactccgtgcgagagggcgactgga tcctcttctacc acgagggaggagtcgacgtcggcgacgtggacgccaaggccgccaagatcctcatccccgttga c attgagaacgagtacccctccaacgccacgctcaccaaggagctgctggcacacgtgcccgagga ccagcacca gaccctgctcgacttcatcaaccggctctacgccgtctacgtcgatctgcagtttacgt atctggagatcaacccc ctggtcgtgatccccaccgcccagggcgtcgaggtccactacctggatct tgccggcaagctcgaccagaccgcag agtttgagtgcggccccaagtgggctgctgcgcggtcccc cgccgctctgggccaggtcgtcaccattgacgccgg ctccaccaaggtgtccatcgacgccggccc cgccatggtcttccccgctcctttcggtcgagagctgtccaaggag gaggcgtacattgcggagctc gattccaagaccggagcttctctgaagctgactgttctcaatgccaagggccgaa tctggacccttg tggctggtggaggagcctccgtcgtctacgccgacgccattgcgtctgccggctttgctgacga get cgccaactacggcgagtactctggcgctcccaacgagacccagacctacgagtacgccaaaaccg tactgga tctcatgacccggggcgacgctcaccccgagggcaaggtactgttcattggcggaggaa tcgccaacttcacccag gttggatccaccttcaagggcatcatccgggccttccgggactaccagtc ttctctgcacaaccacaaggtgaaga tttacgtgcgacgaggcggtcccaactggcaggagggtct gcggttgatcaagtcggctggcgacgagctgaatct gcccatggagatttacggccccgacatgca cgtgtcgggtattgttcctttggctctgcttggaaagcggcccaag aatgtcaagccttttggcaccg gaccttctactgaggcttccactcctctcggagtttaa(SEQ ID NO :9)
[0099] 柠檬酸裂解酶（解脂耶氏酵母）亚基2, ACL2蛋白质
[0100] YALI0D24431p
[0101] XP_503231
[0102] MSAKSIHEADGKALLAHFLSKAPVWAEQQPINTFEMGTPKLASLTFEDGVAPEQIFAAAEKTYPWLLES GAKFVAKPDQLIKRRGKAGLLVLNKSWEECKPWIAERAAKPINVEGIDGVLRTFLVEPFVPHDQKHEYYINIHSVRE GDWILFYHEGGVDVGDVDAKAAKILIPVDIENEYPSNATLTKELLAHVPEDQHQTLLDFINRLYAVYVDLQFTYLEI NPLVVIPTAQGVEVHYLDLAGKLDQTAEFECGPKWAAARSPAALGQVVTIDAGSTKVSIDAGPAMVFPAPFGRELSK EEAYIAELDSKTGASLKLTVLNAKGRIWTLVAGGGASVVYADAIASAGFADELANYGEYSGAPNETQTYEYAKTVLD LMTRGDAHPEGKVLFIGGGIANFTQVGSTFKGIIRAFRDYQSSLHNHKVKIYVRRGGPNWQEGLRLIKSAGDELNLP MEIYGPDMHVSGIVPLALLGKRPKNVKPFGTGPSTEASTPLGV(SEQ ID NO:10)
[0103] 本发明的一些方面提供了用于油生产的产油微生物，其包含本文描述的任意修 饰，例如本文描述的DGA1修饰、如本文所描述的ACC1修饰及/或如本文所描述的SCD修 饰。在一些实施方式中，提供了修饰的产油微生物，其包含如本文描述的推修饰以及如本文 描述的拉修饰。在一些实施方式中，推修饰包含ACC1基因产物的过表达。在一些实施方式 中，拉修饰包含DGA1和/或S⑶基因产物。
[0104] 本发明的一些方面提供了核酸，其编码的基因产物赋予微生物如解脂耶氏酵母生 产生物燃料或生物燃料前体所需要的和/或希望的表型。在一些实施方式中，所述核酸是 来源于解脂耶氏酵母的核酸。在一些实施方式中，所述核酸编码DGA1基因产物如DGA1蛋 白质。在一些实施方式中，所述核酸编码ACC1基因产物如ACC1蛋白质。在一些实施方式 中，所述核酸编码去饱和酶如Λ 9去饱和酶。在一些实施方式中，所述核酸编码解脂耶氏酵 母Λ9去饱和酶（SCD)。在一些实施方式中，提供了编码基因产物的组合的核酸，例如在多 顺反子中，其包含过表达代表脂质生物合成中的推修饰的基因产物（如ACC1基因产物）和 过表达代表了脂质生物合成中的拉修饰的基因产物（例如DGA1和/或SCD基因产物）。
[0105] 术语"核酸"指的是包含多个相连的核苷酸的分子。"核酸"和"核酸分子"可交 换使用，指代寡核糖核苷酸以及寡脱氧核糖核苷酸。该术语还包括多核苷（即多核苷酸减 去磷酸）及任何其他含有核酸的有机碱。所述有机碱包括腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧 啶、胞嘧啶及肌苷。所述核酸可以为单链或双链。所述核酸可以为天然或非天然存在的。 核酸可获自天然来源，或可使用核酸合成仪进行合成（即合成的）。核酸的分离在本领域 是常规进行的，合适的方法可见于标准分子生物学课本（例如见Maniatis的Handbook of Molecular Biology)。如本文所描述的，所述核酸可以为DNA或RNA如基因组DNA、线粒体 DNA、mRNA、cDNA、rRNA、miRNA、PNA或LNA或其组合。非天然存在的核酸如细菌人工染色体 (BAC)及酵母人工染色体（YAC)也可根据本发明的一些方面而使用。
[0106] 本发明的一些方面涉及核酸衍生物的用途。特定核酸衍生物的用途可通过防止其 被消化而增加本发明核酸的稳定性，尤其是在其接触可以含有核酸酶的生物学样品的情况 下。如本文所使用的，核酸衍生物是非天然存在的核酸或其单元。核酸衍生物可以含有非天 然存在的元素如非天然存在的核苷酸和非天然存在的骨架连接。根据本发明的一些方面的 核酸衍生物可含有骨架修饰，例如但不限于，硫代磷酸酯键、磷酸二酯修饰的核酸、磷酸二 酯和硫代磷酸酯核酸的组合、甲基膦酸酯、烷基膦、磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、 氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，P-乙 氧基，及其组合。核酸的骨架组合物可以为同源或异源的。
[0107] 根据本发明的一些方面，核酸衍生物可以在糖和/或碱基部分含有置换或修饰。 例如，一些核酸衍生物可以包括这样的核酸，其的骨架糖在3'位置共价附着至低分子量有 机基团而不是羟基基团，在5'位置也并非附着至磷酸基团（例如2'-0-烷基化核糖基团）。 核酸衍生物可以包括非核糖的糖类如阿拉伯糖。核酸衍生物可含有置换的嘌呤或嘧啶，如 C-5丙炔修饰的碱基、5-甲基胞嘧陡、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2, 6-二氨基嘌呤、次 黄嘌呤、2-硫尿嘧啶和假异胞嘧啶。
[0108] 在一些实施方式中，核酸可以包含肽核酸（PNA)、锁核酸（LNA)、DNA、RNA或上述核 酸的共-核酸如DNA-LNA共-核酸。
[0109] 如本文所使用的，术语"分离的核酸分子"指的是不在天然环境下的核酸分子，例 如这样的核酸：（i)通过本领域已知的方法从细胞或微生物如细菌或真菌中被提取和/或 纯化的核酸，所述方法为例如对宿主细胞进行碱裂解并随后例如使用硅吸附步骤对核酸进 行纯化；（ii)例如通过聚合酶链反应（PCR)在体外扩增的核酸；（iii)通过克隆而重组生 产的核酸，例如将核酸克隆至表达载体；（iv)经过片断化并通过大小被分离的核酸，例如 通过体外酶消化或通过剪切并随后进行凝胶分离；或（v)例如通过化学合成而合成的核 酸。在一些实施方式中，术语"分离的核酸分子"指的是（vi)在化学上与任何天然存在的 核酸有极大不同的核酸。在一些实施方式中，可通过本领域已知的重组DNA技术容易地对 分离的核酸进行操纵。因此，克隆入载体的核酸或递送到宿主细胞中并整合进入宿主基因 组的核酸被认为是分离的，但以其天然状态在天然宿主中的核酸则不是。分离的核酸可以 大体上得到纯化，但不一定需要如此。例如，在克隆或表达载体内分离的核酸不是纯化的， 因为其可以含有少量百分比的其居留的细胞中的物质。然而如本文所使用的术语一样，这 样的核酸也是分离的。
[0110] 本发明的一些方面涉及这样的核酸，其编码的基因产物赋予微生物需要的或期望 的表型，用于生物燃料或生物燃料前体生产，所述核酸连接于启动子或其他转录激活元件。 在一些实施方式中，编码基因产物并连接于启动子的核酸是包含在表达载体或表达构建体 中的。如本文所使用的，术语"表达载体"或"表达构建体"指的是重组或合成生成的核酸构 建体，具有一系列特异的核酸元件允许特定核酸在宿主微生物如产油酵母中的转录。在一 些实施方式中，表达载体可为质粒、病毒或核酸片段的部分。在一些实施方式中，表达载体 包括可操作地连接于启动子的待转录的编码核酸。启动子是一种核酸元件，其促进待转录 核酸的转录。启动子通常位于其控制转录的核酸序列的相同链上，并位于其上游（或5'）。 在一些实施方式中，表达载体包括可操作地连接于异源启动子的待转录的编码核酸。异源 启动子是并非天然可操作连接于给定核酸序列的启动子。例如，解脂耶氏酵母中的DGA1基 因天然可操作地连接于解脂耶氏酵母DGA1基因启动子。因此例如在表达构建物中野生型 解脂耶氏酵母DGA1基因启动子之外的任何启动子（其可操作地连接于DGA1基因）或其部 分因此在上下文中就是异源启动子。例如，连接于编码DGA1基因产物的核酸的TEF1启动 子对于DGA1来说就是异源启动子。
[0111] 在一些实施方式中，表达载体包括编码核酸，例如编码DGA1，ACC1和/或S⑶基 因产物的核酸，其可操作地连接于组成型启动子。术语"组成型启动子"指的是允许相连 的基因得到持续转录的启动子。在一些实施方式中，表达载体包括编码核酸，例如编码 DGA1，ACC1和/或SCD基因产物的核酸，其可操作地连接于诱导型启动子。术语"诱导型启 动子"在本文可与术语"条件型启动子"交换使用，指的是只在一些在生物或非生物因素下 才允许与其相连的基因进行转录的启动子。药物诱导启动子如四环素/强力霉素诱导的启 动子、他莫昔芬诱导启动子以及依赖于重组事件而被激活的启动子，例如ere-介导的ΙοχΡ 位点的重组，这些都是本领域熟知的诱导型启动子的实例。
[0112] 本公开的一些方面涉及惊人的发现，即产油微生物中给定基因产物在异源启动子 下过表达可通过在相应表达构建物中包含内含子得到显著增强。本发明的一些方面提供 了内含子增强的组成型启动子用于在产油微生物中的基因过表达，并且提供了这种内含子 增强启动子的表达构建体和载体。在一些实施方式中，提供了内含子增强的TEF启动子，其 包含TEF启动子序列、转录起始位点、转录起始位点下游的内含子序列以及编码合适序列， 例如编码DGA1，ACC1和/或SCD基因产物的核酸序列。在一些实施方式中，所述内含子位 于翻译起始位点的下游，但仍然位于基因序列的开放阅读框之内，例如，位于起始密码子之 后，但在编码所述基因产物核酸序列的终止位点之前。在一些实施方式中，所述内含子紧接 着位于翻译起始位点如ATG起始密码子下游，但仍然在编码序列的其余部分的上游。为了 阐述清楚，提供如下所示的内含子增强表达构建体的非限制的示例性结构：
[0113] 5' 一TEF启动子一转录起始位点-内含子一DGA1编码序列一3'。下文提供了 另一个内含子增强表达构建体的非限制的示例性结构：
[0114] 5' 一TEF启动子一转录起始位点-起始密码子一内含子一DGA1编码序列-终 止密码子一3'。ACC1和S⑶基因产物的表达构建体分别具有DGA1编码序列置换ACC或 S⑶编码序列。
[0115] 合适的TEF启动子序列及合适的内含子序列对本领域技术人员是清楚的。一些无 内含子TEF启动子序列在例如美国专利#6, 265, 185中已经公开。下文提供了一些示例代 表性序列。然而，要理解的是本发明在此方面不限于此。
[0116] 示例性TEF启动子序列：
[0117] agagaccgggttggcggcgcatttgtgtcccaaaaaacagccccaattgccccaattgaccc caaatt gacccagtagcgggcccaaccccggcgagagcccccttctccccacatatcaaacctccc ccggttcccacacttg ccgttaagggcgtagggtactgcagtctggaatctacgcttgttcagacttt gtactagtttctttgtctggccat ccgggtaacccatgccggacgcaaaatagactactgaaaatttt tttgctttgtggttgggactttagccaagggt ataaaagaccaccgtccccgaattacctttcctcttc ttttctctctctccttgtcaactcacacccgaaatcgtt aagcatttccttctgagtataagaatcattc aaa(SEQ ID NO:11)
[0118] 示例性内含子序列：
[0119] gtgagtttcagaggcagcagcaattgccacgggctttgagcacacggccgggtgtggtccc attccca tcgacacaagacgccacgtcatccgaccagcactttttgcagtactaaccgcag(SEQ ID NO:12)
[0120] 在启动子和内含子序列之间含有起始密码子（ATG)的示例性TEF启动子-内含子 序列：
[0121] agagaccgggttggcggcgcatttgtgtcccaaaaaacagccccaattgccccaattgaccc caaatt gacccagtagcgggcccaaccccggcgagagcccccttctccccacatatcaaacctccc ccggttcccacacttg ccgttaagggcgtagggtactgcagtctggaatctacgcttgttcagacttt gtactagtttctttgtctggccat ccgggtaacccatgccggacgcaaaatagactactgaaaatttt tttgctttgtggttgggactttagccaagggt ataaaagaccaccgtccccgaattacctttcctcttc ttttctctctctccttgtcaactcacacccgaaatcgtt aagcatttccttctgagtataagaatcattc aaaATGgtgagtttcagaggcagcagcaattgccacgggctttga gcacacggccgggtgtggt cccattcccatcgacacaagacgccacgtcatccgaccagcactttttgcagtacta accgcag
[0122] (SEQ ID NO: 13)
[0123] 将表达载体或表达构建物递送入微生物如酵母细胞的方法对本领域技术人员 是熟知的。包括表达载体在内的核酸可通过生物相关领域技术人员熟知的多种方法递 送入原核及真核微生物中。根据本发明的一些方面将核酸递送入微生物的方法包括 但不限于不同的化学、电化学及生物学方法，例如热激转化、电穿孔、转染如脂质体介 导的转染、DEAE-葡聚糖-介导的转染或磷酸钙转染。在一些实施方式中，使用媒介物 或载体将核酸构建体如包含DGA1、ACC1和/或SCD编码核酸序列的组合的表达构建 体引入宿主微生物用于转移遗传物质。用于将遗传物质转移至微生物的方法对本领 域技术人员是已知的，包括例如质粒、人工染色体和病毒载体。用于构建核酸构建体 包括含有组成型或诱导型异源启动子的表达构建体、敲除或敲低构建体的方法，以及 将核酸或核酸构建体递送至微生物的方法及载体对本领域技术人员是熟知的，在例如 下列著作中有所描述：J. Sambrook 和 D. Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；3rd edition(January15, 2001)； David C.Amberg, Daniel J.Burke ；和 Jeffrey N.Strathern, Methods in Yeast Genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April2005) ；John N.Abelson, Melvin I.Simon,Christine Guthrie,和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volumel94(Methods in Enzymology Series, 194), Academic Press(Marchll, 2004)； Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, Volume350(Methods in Enzymology, V〇1350), Academic Press ； 1st edition(July2, 2002) ；Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C,Volume351, Academic Press ； 1st edition (July9,2002) ；Gregory N. Stephanopoulos,Aristos A. Aristidou 和 Jens Nielsen, Metabolic Engineering:Principles and Methodologies, Academic Press ；ledition(0ctoberl6, 1998)；以及 Christina Smolke, The Metabolic Pathway Engineering Handbook:Fundamentals,CRC Press ;ledition(July28, 2009)，其以全部并 入本文作为参考。
[0124] 在一些实施方式中，编码基因产物的基因的原生启动子例如原生DGA1、ACC1或 SCD启动子赋予了微生物需要的或希望的表型，在微生物中，这些启动子得到修饰以改变其 转录活性的调节。在一些实施方式中，经过修饰的启动子相比于未修饰的对等物转录活性 增加。如本文所使用的，术语"经修饰启动子"指的是其核苷酸序列受到人为改变的启动子。 单独的核苷酸删除、插入或突变或其组合都是所述人为改变的实例。人为的启动子改变可 以以靶向的方式实现，例如通过同源重组手段如基因靶向、敲除、敲入、定点诱变或人工锌 指核酸酶介导的策略实现。备选地，这样的改变可通过随机或准随机事件实现，如辐射或非 靶向核苷酸整合并随后进行筛选。启动子修饰一般是不断改进的以调制相应启动子转录激 活特性。例如，在对细胞内脂肪酸水平升高作出应答时介导DGA1、ACC1或SCD启动子的抑 制的调节元件的破坏或删除会导致相应的基因甚至在细胞内脂肪酸水平升高的条件下持 续转录激活。类似地，组成型激活的转录激活元件插入条件型启动子区域可以对相应的基 因在正常的抑制性条件下的过表达产生影响。用于在微生物中靶向破坏原生启动子例如原 生DGA1、ACC1或SCD启动子，例如用于靶向破坏使得转录速率增加的方法对本领域技术人 员是熟知的。
[0125] 本发明的一些方面涉及微生物如解脂耶氏酵母的工程改造，以显示用于生物燃料 或生物燃料前体的大规模生产所需要和/或希望的表型。本发明的一些方面涉及脂质合成 途径的代谢工程改造以产生就生物燃料生产而优化的微生物。本发明的一些方面涉及代谢 改造，其包含调制那些调节进入脂质合成途径的碳流的基因的表达的遗传修饰的组合，以 产生就生物燃料生产而优化的微生物。在一些实施方式中，所述遗传修饰的组合包括推修 饰和拉修饰。在一些实施方式中，推修饰包含增加细胞中用于脂质合成的代谢物乙酰-CoA、 ATP或NADPH水平的遗传修饰，例如ACC1基因产物的过表达。在一些实施方式中，拉修饰是 降低脂质合成中那些显示有反馈抑制功能的产物或中间产物，如脂肪酸水平的遗传修饰。 在一些实施方式中，拉修饰包含DGA1和/或S⑶基因产物的过表达。
[0126] 本发明的一些方面提供了通过调制解脂耶氏酵母的原生脂质代谢极大地增加解 脂耶氏酵母介导的碳源向脂质转化效率的方法。显著而意外地，相比于仅仅分别调制推或 拉过程的单独的修饰，根据本发明提供的一些方法的脂质代谢的推-和-拉修饰的组合能 使得进入脂质合成途径的碳流有显著的增加。
[0127] 本发明的一些方面涉及工程改造和/或优化用于大规模生物燃料或生物燃料前 体生产的微生物。在一些实施方式中，提供了工程改造的微生物，其已经通过本发明的一些 方面提供的方法或使用了本发明的一些方面提供的核酸或蛋白质进行操纵，所述核酸或蛋 白质为例如本文提供的表达构建体或表达构建体组合，其导致介导脂质合成推过程的基因 产物（例如ACC1产物）与介导脂质合成拉过程的基因产物（例如DGA1和/或SCD基因产 物）的组合的过表达。在一些实施方式中，提供了工程改造的微生物，其过表达的基因产物 的推-和-拉的组合，根据本发明的一些实施方式赋予所述微生物用于生物燃料或生物燃 料前体生产必需的及/或希望的表型。在一些实施方式中，提供了微生物，其包含的DGA1、 ACC1和/或SCD基因产物活性得到增加。在一些实施方式中，所述微生物显示了增加的脂 肪酸合成速率、增加的TAG储存及/或此外的必需或希望的特征。
[0128] 如本文在微生物脂质合成的上下文中所使用的，例如在本文描述的产油微生物的 脂肪酸合成速率的上下文中所使用的，术语"增加的合成速率"或"合成速率增加"指的是 在工程改造的微生物中合成速率相比于相同种属野生型微生物中相应的合成速率得到增 力口。例如，在本文描述的工程改造的解脂耶氏酵母微生物中，TAG合成速率增加指的是脂 质合成速率比野生型TAG合成速率得到增加。在一些实施方式中，增加的脂质合成速率， 例如TAG或总脂质合成速率指的是细胞培养物例如工程改造的微生物培养物中脂肪酸合 成速率。在一些实施方式中，增加的脂质合成速率是脂质合成如TAG合成或总脂质合成速 率为至少0. 〇lg/L/h (脂质克每升培养基每小时）、至少0. 004g/L/h、至少0. 05g/L/h、至少 0· lg/L/h、至少 0· 14g/L/h、至少 0· 15g/L/h、至少 0· 2g/L/h、至少 0· 3g/L/h、至少 0· 4g/L/ h、至少 0. 5g/L/h、至少 0. 6g/L/h、至少 0. 7g/L/h、至少 0. 8g/L/h、至少 0. 9g/L/h、至少 lg/ L/h、至少 2g/L/h、至少 3g/L/h、至少 4g/L/h、至少 5g/L/h、至少 6g/L/h、至少 7g/L/h、至少 8g/L/h、至少 9g/L/h、至少 10g/L/h 或至少 25g/L/h。
[0129] 在一些实施方式中，本上下文中合成速率为生物反应器进行一个完整的运行周期 中测量的合成速率，例如由生物反应器运行总时间内或脂质测量的总时间内合成的脂质例 如TAG总量计算合成速率。这种合成速率的类型在本文有时候称作"总脂质生产效率"或 "总体脂质生产效率"，通常以g/L/h(每小时运行时间每升培养基生产的脂质克数）为单位 提供。在一些实施方式中，提供了工程改造的微生物，例如工程改造的解脂耶氏酵母，其过 表达ACC1基因产物、DGA1基因产物及/或S⑶基因产物，与野生型微生物如野生型解脂耶 氏酵母相比，总脂质生产效率显示了至少5倍的增加、至少6倍的增加、至少7倍的增加、至 少8倍的增力口、至少9倍的增力口、至少10倍的增力口、至少12倍的增力口、至少10倍的增力口、至 少12. 5倍的增加、至少15倍的增加、至少20倍的增加、至少30倍的增加、至少40倍的增 力口、至少50倍的增加、至少60倍的增加、至少70倍的增加、至少80倍的增加、至少90倍的 增加、至少100倍的增加、至少500倍的增加，或至少1000倍的增加。
[0130] 在一些实施方式中，增加的总脂质合成速率或增加的总脂质生产效率为至少 0· 01g/L/h、至少 0· 004g/L/h、至少 0· 05g/L/h、至少 0· lg/L/h、至少 0· 14g/L/h、至少 0· 15g/ L/h、至少 0. 2g/L/h、至少 0. 3g/L/h、至少 0. 4g/L/h、至少 0. 5g/L/h、至少 0. 6g/L/h、至少 0· 7g/L/h、至少 0· 8g/L/h、至少 0· 9g/L/h、至少 lg/L/h、至少 2g/L/h、至少 3g/L/h、至少 4g/ L/h 或至少 5g/L/h。
[0131] 在一些实施方式中，合成速率是在例如优化的生长条件下有营养物的存在下测量 的最大合成速率或峰合成速率。这种类型的合成速率在本文有时候称为"最大脂质生产效 率"。在一些实施方式中，增加的最大脂质合成速率是脂质合成如TAG合成的速率为至少 0· 2g/L/h、至少 0· 3g/L/h、至少 0· 4g/L/h、至少 0· 5g/L/h、至少 0· 6g/L/h、至少 0· 7g/L/h、至 少 0· 8g/L/h、至少 0· 9g/L/h、至少 lg/L/h、至少 2g/L/h、至少 3g/L/h、至少 4g/L/h、至少 5g/ L/h、至少 6g/L/h、至少 7g/L/h、至少 8g/L/h、至少 9g/L/h、至少 10g/L/h，或至少 25g/L/h。
[0132] 在一些实施方式中，工程改造的微生物是产油酵母如解脂耶氏酵母。在一些实施 方式中，本发明提供的工程改造的酵母显示了一种或多种高度所需的且预期外的表型特 征，例如：增加的碳-油转化率或效率，增加的脂质小体中的脂质积累。
[0133] 在一些实施方式中，本发明的某些方面提供的工程改造的微生物，例如工程改造 的酵母，显示的碳-油转化率（本文也称为"脂质产率"）在大约0.02g/g(生产的油、月旨 质或TAG(g)/碳（g)，例如消耗的葡萄糖、醋酸盐或醋酸）-大约0. 3g/g的范围内。在一 些实施方式中，本发明的某些方面提供的工程改造的微生物，例如工程改造的酵母，显示的 碳-油转化率为大约〇· 〇l〇g/g、大约〇· 〇2g/g、大约0· 025g/g、大约0· 03g/g、大约0· 04g/ g、大约 〇· 05g/g、大约 0· 06g/g、大约 0· 07g/g、大约 0· 075g/g、大约 0· 08g/g、大约 0· 09g/ g、大约 〇· lg/g、大约 〇· llg/g、大约 〇· 12g/g、大约 0· 13g/g、大约 0· 14g/g、大约 0· 15g/g、 大约 0· 16g/g、大约 0· 17g/g、大约 0· 18g/g、大约 0· 19g/g、大约 0· 2g/g、大约 0· 21g/g、大 约 0· 22g/g、大约 0· 23g/g、大约 0· 24g/g、大约 0· 25g/g、大约 0· 26g/g、大约 0· 27g/g、大 约0· 28g/g、大约0· 29g/g、大约0· 3g/g、大约0· 31g/g、大约0· 32g/g或接近理论值。在一 些实施方式中，本发明的某些方面提供的工程改造的微生物，例如工程改造的酵母，显示的 碳-油转化率为至少大约〇.〇l〇g/g(生产的脂质（g)/碳（g)，例如，消耗的葡萄糖、醋酸 盐或醋酸）、至少大约〇. 〇2g/g、至少大约〇. 〇25g/g、至少大约0. 03g/g、至少大约0. 04g/ g、至少大约0. 05g/g、至少大约0. 06g/g、至少大约0. 07g/g、至少大约0. 075g/g、至少大约 0· 08g/g、至少大约0· 09g/g、至少大约0· lg/g、至少大约0· llg/g、至少大约0· 12g/g、至少 大约0. 13g/g、至少大约0. 14g/g、至少大约0. 15g/g、至少大约0. 16g/g、至少大约0. 17g/ g、至少大约0. 18g/g、至少大约0. 19g/g、至少大约0. 2g/g、至少大约0. 21g/g、至少大约 0· 22g/g、至少大约0· 23g/g、至少大约0· 24g/g、至少大约0· 25g/g、至少大约0· 26g/g、至少 大约0· 27g/g、至少大约0· 28g/g、至少大约0· 29g/g、至少大约0· 3g/g、至少大约0· 31g/g、 至少大约〇. 32g/g或接近理论值。
[0134] 如本文使用的术语"脂质滴度"在微生物脂质合成的上下文中，例如在本文描述的 产油微生物进行脂肪酸合成的上下文中，指的是每份体积的包含所述产油微生物的微生物 培养物合成的脂质的量。在一些实施方式中，改造的微生物例如本文描述的改造的解脂耶 氏酵母微生物可达到或确实达到的脂质滴度为至少lg/L(脂质克数每升微生物培养物）、 至少2g/L、至少3g/L、至少4g/L、至少5g/L、至少6g/L、至少7g/L、至少8g/L、至少9g/L、 至少10g/L、至少15g/L、至少20g/L、至少25g/L、至少30g/L、至少40g/L、至少50g/L、至少 60g/L、至少 70g/L、至少 80g/L、至少 90g/L、至少 100g/L、至少 200g/L 或至少 250g/L。
[0135] 在一些实施方式中，如本文所提供的工程改造的微生物在碳-油转化中显示了增 加的脂质滴度。如本文在微生物脂质合成的上下文中例如在本文描述的产油微生物进行脂 肪酸合成的上下文中所使用的术语"增加的脂质滴度"指的是每份体积的包含所述产油微 生物的微生物培养物中合成的脂质的量相比于相同种属的野生型微生物在相同条件（例 如，在相同生长基质中、具有相同的C/N比率、等量的氧气、相同的pH、相同的营养物，等等） 下相应的脂质滴度得到增加。例如，本文描述的工程改造的微生物解脂耶氏酵母达到的增 加的脂质滴度指的是脂质滴度相比于同一条件下野生解脂耶氏酵母达到的脂质滴度得到 增加。在一些实施方式中，增加的脂质滴度指的是脂质滴度为至少lg/L(脂质克数每升微 生物培养物）、至少2g/L、至少3g/L、至少4g/L、至少5g/L、至少6g/L、至少7g/L、至少8g/ L、至少9g/L、至少10g/L、至少15g/L、至少20g/L、至少25g/L、至少30g/L、至少40g/L、至 少50g/L、至少60g/L、至少70g/L、至少80g/L、至少90g/L、至少100g/L、至少200g/L或至 少 250g/L。
[0136] 本发明的一些方面提供了工程改造的微生物用于油生产，其可使用多种碳源，包 括但不限于可发酵糖类，例如C6糖，如葡萄糖和有机酸，例如醋酸和/或其他盐，例如醋酸 盐。
[0137] 本发明的一些方面涉及本文提供的遗传修饰的微生物的培养物。在一些实施方式 中，所述培养物包括本文提供的遗传修饰的微生物以及基质，例如液体基质。在一些实施方 式中，所述培养物包含本文提供的遗传修饰的微生物以及碳源，例如可发酵碳水化合物源 或有机酸或其盐。在一些实施方式中，所述培养物包含了本文提供的遗传修饰的微生物以 及构成盐度、渗透压以及pH条件的盐和/或缓冲液，适合于微生物的存活、生长和/或碳水 化合物向生物燃料或生物燃料前体的转化。在一些实施方式中，所述培养物包含其他的组 分例如添加剂。添加剂的非限制性实例为营养物、酶、氨基酸、白蛋白、生长因子、酶抑制剂 (例如蛋白酶抑制剂）、脂肪酸、脂质、激素（例如地塞米松和赤霉酸）、痕量元素、无机化合 物（例如还原试剂如镁）、氧化还原调节剂（例如抗氧化剂）、稳定试剂（例如二甲基亚砜）、 聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、明胶、抗生素（例如，布雷菲德菌素 A)、盐（如NaCl)、螯 合剂（例如EDTA、EGTA)和酶（如纤维素酶、分散酶、透明质酸酶或脱氧核糖核酸酶）。在 一些实施方式中，所述培养物可以包含诱导或抑制条件型或诱导型启动子调控的转录的药 物，例如多西环素、四环素，他莫昔芬，IPTG，激素，或金属离子。
[0138] 虽然特定培养条件如碳源浓度会取决于要培养的工程改造的微生物自身，然 而用于生成微生物培养物的通用方法和培养物条件对本领域技术人员是已知的，在例 如以下著作中有所描述：J. Sambrook 和 D. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press ；3rd edition (January15, 2001)； David C.Amberg, Daniel J.Burke ；和 Jeffrey N.Strathern,Methods in Yeast Genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April2005) ； John N.Abel son, Melvin I.Simon, Christine Guthrie,和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volumel94(Methods in Enzymology Series, 194), Academic Press(Marchll, 2004)； Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, Volume350(Methods in Enzymology, V〇1350), Academic Press ； 1st edition (July2,2002) ；Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C, Volume351, Academic Press ；lst edition(July9, 2002)，其以全部并入本文作为参考。为生成油，本文描述的工程改造的微 生物培养物在适合油积累的条件下进行培养。
[0139] 在一些实施方式中，所述遗传修饰的微生物显示了相对于相同种类野生型微生物 和/或相对于其他微生物（例如通常发现会污染用于碳源向生物燃料或生物燃料前体转化 的微生物培养物的那些微生物）的生长优势。在一些实施方式中，本发明的某些方面提供 的工程改造的微生物的生长和/或增殖优势转化为使用非灭菌培养和发酵条件用于生物 燃料或生物燃料前体的生产的可能性，因为培养物中污染性微生物过度生长的问题能得到 缓解或完全消除。在一些实施方式中，本发明的某些方面提供的工程改造的微生物是在非 灭菌条件下培养的，用于生物燃料或生物燃料前体生产。例如，在一些实施方式中，非灭菌 原料、非灭菌的培养基、非灭菌的补充物或非灭菌的生物反应器（例如在非灭菌环境中的 开放式反应器）被用于生物燃料或生物燃料前体生产。
[0140] 根据本发明的一些方面，多种不同的微生物都可进行遗传修饰并用于工业规 模的生物燃料或生物燃料前体生产，例如来自多种酵母来源如产油酵母、细菌、藻类和 真菌的微生物。合适的酵母细胞的非限制性实例为来自以下种属的细胞：解脂耶氏酵 母（Yarrowia lipolytica)、多形汉逊（Hansenula polymorpha)、毕赤酵母（Pichia pastoris)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、贝酵母（S. bayanus)、乳酸克鲁 维酵母（S. K. lactis)、Waltomyces lipofer、高山被抱霉（Mortierella alpine)、黄 被抱霉（Mortierella isabellina)、多形汉逊、鲁氏毛霉（Mucor rouxii)、皮状丝抱 酵母（Trichosporon cutaneu)、粘红酵母酿酒（Rhodotorula glutinis)、糖化酵母 (Saccharomyces diastasicus)、西方许旺酵母（Schwanniomyces occidentalis)、酿酒酵 母（S. cerevisiae)、树干毕赤酵母（Pichia stipitis)和裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)。合适的细菌的非限制性实例有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)、沙门氏 菌（Salmonella)、大肠埃希氏菌（Escherichia coli)、霍乱弧菌（Vibrio cholerae)、 链霉菌属（Streptomyces)、突光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)、假单胞菌属（Pseudomonas sp·)、红球菌属（Rhodococcus sp·)、链 霉菌属（Streptomyces sp.)和产碱杆菌（Alcaligenes sp)。合适的真菌细胞的非限制性 实例可以培养自，例如，Aspergillus shirousamii、黑曲霉（Aspergillus niger)和里氏 木霉（Trichoderma reesei)等种属。合适的藻细胞的非限制性实例为来自以下种属的细 胞：富油新绿藻（Neochloris oleoabundans)、斜生栅藻（Scenedesmus obliquus)、微绿球 藻属（Nannochloropsis sp·)、杜氏盐藻（Dunaliella tertiolecta)、小球藻（Chlorella vulgaris)、浮水小球藻（Chlorella emersonii)和极大螺旋藻（Spirulina maxima)。
[0141] 本发明的一些方面提供了用于生产生物燃料或生物燃料前体的方法，所述方法使 用了本文提供的遗传修饰的微生物。在一些实施方式中，提供了以工业规模生产生物燃料 或生物燃料前体的方法。
[0142] 使用本文提供的方法和/或遗传修饰的微生物可以将多种碳源转化为生物燃料 或生物燃料前体。在一些实施方式中，碳源包含碳水化合物。糖类、淀粉以及纤维都是适合 于本文提供的转化方法的碳水化合物来源的实例。根据本发明的一些方面，碳水化合物来 源可包含精炼的和/或粗制的糖、淀粉和/或纤维，或这些物质的任意组合。糖的非限制性 的实例为可发酵糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖和乳糖。淀粉的非限制性实例为直链淀粉和 支链淀粉。纤维的非限制性实例为植物纤维如纤维素、半纤维素和木纤维。本发明的一些 方面涉及工业副产品、中间产物、或废品的用作碳源用途，例如植物粗提取物、糖蜜、秸杆或 污水作为碳源。在一些实施方式中，碳源来自藻类。在一些实施方式中，藻类生物质特别生 产为用作微生物介导的生物燃料或生物燃料前体生产中的碳源。
[0143] 在一些实施方式中，提供了用于生产生物燃料或生物燃料前体的方法，包括使用 便宜、丰富且易得的碳源原料作为碳源。在一些实施方式中，纤维素或半纤维素被用作碳 源。在一些实施方式中，纤维素或半纤维素来自工业副产品或废品。在一些实施方式中，纤 维素或半纤维素直接来源于植物或藻类生物质。植物或藻类生物质是最丰富的原料之一， 并且包含显著量的不可发酵糖和纤维，例如纤维素和本纤维素。在一些实施方式中，对生物 质原料进行预处理以将不可发酵糖或纤维转化为可发酵糖类，这样使其能够用于微生物生 长及微生物介导的生物燃料或生物燃料前体生产。在一些实施方式中，生物质原料的预处 理包括使纤维素和/或半纤维素组分解聚为单体糖，所使用的预处理方法对本领域技术人 员是熟知的，例如使用稀释酸或氨纤维膨胀（AFEX)法（见例如，Yang B，Wyman CE. Dilute acid and autohydrolysis pretreatment. Methods Mol Biol. 2009 ;581:103-14 ;Balan V,Bals B,Chundawat SP, Marshall D, Dale BE, Lignocellulosic biomass pretreatment using AFEX Methods Mol Biol. 2009;581:61-77)。其他用于将生物质多聚体解聚为单体 糖的方法对本领域技术人员是熟知的，并且预期会在本发明的一些实施方式中使用。
[0144] 在一些实施方式中，使用了稀释酸法对含有不可发酵糖的生物质原料进行预处 理，将不可发酵糖解聚为单体的可发酵糖。在一些实施方式中，在适度温和的温度下用稀释 的硫酸对生物质处理一段限定的时间。例如，在一些实施方式中，用大约〇. 5%、大约1%、 大约2 %、大约3 %、大约4 %、大约5 %或大约6 %的硫酸对生物质进行处理。在一些实施方 式中，在大约30°C、大约37°C、大约40°C、大约50°C、大约60°C、大约70°C、大约80°C、大约 90°C、大约 100°C、大约 1KTC、大约 120°C、大约 130°C、大约 140°C、大约 150°C、大约 175°C、 大约200°C或大约200°C以上的温度下对生物质进行处理。
[0145] 在一些实施方式中，所得的水解物含有不溶的木质素及溶解的纤维素和半纤维素 多聚物。后者产物可使用本领域技术人员熟知的方法进一步处理，如使用纤维素酶或其他 水解酶处理生产六碳糖和五碳糖，如葡萄糖和木糖单体。在一些实施方式中，用稀释酸对 不可发酵糖进行预处理导致一些副产品的生成，包括毒性化合物，其抑制没有根据本发明 的方面进行工程改造的微生物的生长、降低其活力且/或抑制其的生物燃料或生物燃料生 产。在一些实施方式中，用有助于微生物生长、生物燃料或生物燃料生产的基质对预处理过 的原料进行洗涤和补充，且/或对原料过石灰（over-limed)以脱毒。
[0146] 在一些实施方式中，使用AFEX法对含有不可发酵糖的生物质原料预处理以将不 可发酵糖解聚成单体可发酵糖。在一些实施方式中，在高温高压下用液态氨对生物质进行 一段限定时间的处理。在一些实施方式中，对生物质的处理为大约10分钟、大约20分钟、大 约30分钟、大约40分钟、大约50分钟、大约60分钟、大约70分钟、大约80分钟、大约90分 钟或更长。在一些实施方式中，在大约30°C、大约37°C、大约40°C、大约50°C、大约60°C、大 约70°C、大约80°C、大约90°C、大约KKTC、大约1KTC、大约120°C、大约130°C、大约140°C、 大约150°C、大约175°C、大约200°C或大约200°C以上的温度下对生物质进行处理。在一些 实施方式中，AFEX预处理使原料中所含的结晶纤维素转化为无定形、可发酵的形式。在一 些实施方式中，经过AFEX预处理的生物原料不含有显著量的抑制微生物生长和/或生物燃 料或生物燃料生产的毒性副产品，并且不经过预先的脱毒步骤就可以用作微生物生物燃料 或生物燃料生产。
[0147] 在一些实施方式中，经过或不经过预处理的生物质原料，都用水解或解聚糖多聚 物的酶进行处理，例如使用纤维素酶或半纤维素酶进行处理。在一些实施方式中，将原料与 所述酶在液相中接触，并在允许酶催化解聚或水解反应的温度下孵育一段时间，时间足以 水解或解聚生物质原料中显著量的不可发酵糖或纤维。在一些实施方式中，在孵育进行水 解和解聚后，通过例如离心的方法将原料与酶接触的液相（含有可溶的、可发酵糖部分）与 包含不可发酵糖和纤维的固相相分离。在一些实施方式中，随后将原料的液体部分与微生 物，例如本文的一些方面提供的微生物接触，以转化为生物燃料或生物燃料前体。在一些实 施方式中，不可发酵糖或纤维的酶转化是在综合的生物过程中进行的，例如，所产生的可发 酵糖向生物燃料或生物燃料前体的微生物转化过程也在同时且/或在同一个反应器中发 生。在一些实施方式中，首先进行酶转化，随后将接触了酶的原料与用于生物燃料或生物燃 料前体生产的微生物接触.在一些实施方式中，酶和微生物转化在同时且在同一个反应器 中进行。
[0148] 在一些实施方式中，如本文提供的工程改造的微生物例如过表达DGA1、ACC1和/ 或S⑶基因产物的解脂耶氏酵母，以醋酸盐为主要碳源生长。在一些实施方式中，微生物 生长的溶液中醋酸浓度为大约1 %、大约2%、大约3%、大约4%、大约5%、大约6%、大约 7%、大约 8%、大约 9%、大约 10% vol/vol、大约 20% vol/vol、大约 25% vol/vol,或大约 30% vol/vol。在一些实施方式中，醋酸盐的浓度为3%-10% wt/vol之间。在一些实施方 式中，将包含如本文提供的遗传修饰的微生物并以醋酸盐或醋酸为主要碳源的细胞培养物 与甘油接触或"穿刺（spike)"混入甘油。在一些实施方式中，间歇地将遗传修饰的微生物 与甘油接触。在一些实施方式中，连续或半连续地将微生物与甘油接触。在一些实施方式 中，将微生物与浓度为大约0. 5%、大约1 %、大约2%、大约3%、大约4%或大约5% vol/ vol的甘油接触。将本文提供的工程改造的微生物与甘油接触为TAG的生产提供代谢物，并 为由碳水化合物生产脂肪酸提供还原性部分。在一些实施方式中，甘油穿刺是在使用了醋 酸盐之外的碳源，例如任何本文描述的碳源的物燃料或生物燃料生产方法中进行的。
[0149] 在一些实施方式中，如本文提供的工程改造的微生物，例如过表达DGA1基因产 物，且/可选地表达ACC1和/或S⑶基因产物的解脂耶氏酵母是在碳源例如醋酸盐或醋酸 上生长的，在生长过程中或培养阶段可以得到更新（replenished)，例如在培养一定时间段 之后例如8小时后、24小时后或48小时后通过将微生物与添加量的碳源或与一定量的此外 的碳源接触而更新。在一些实施方式中，如本文提供的工程改造的微生物在包含低碳氮（C/ N)比的培养基中起始培养第一个6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66或72小时，例如(：/^ 比率为大约10、大约20、大约25、大约30、低于大约30、低于25或低于20。在一些实施方 式中，低C/N比率是通过向培养基中补充氮源实现的，如补充氨以达到所需的C/N比率。在 一些实施方式中，例如在其中碳源（例如醋酸盐或醋酸）加料于如本文所述的产油微生物 培养物的实施方式中，在碳源中补充了氮源，如氨。在一些实施方式中，在起始培养一段时 间后停止用氮源进行补充，例如在培养的第一个6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66或72 小时之后，由此使得培养物中工程改造的微生物能消耗氮源，这样进而增加了 C/N比率。C/ N比率的这一变化可通过向没有补充氮源的培养物中加料额外的碳源，例如通过加料不补 充氨或任何其他氮源的醋酸或醋酸盐而得到增强或加速。在一些实施方式中，本文描述的 工程改造的微生物进行油生产的优化的C/N比率在80-120的范围内。
[0150] 在一些实施方式中，用于大规模微生物介导的碳水化合物向脂质转化的发酵过程 可在反应器中施行。如本文所使用的，术语"生物反应器"和"发酵罐"在本文交换使用，指 的是封闭或部分封闭的空间，其中发生生物学和/或化学反应，所述反应至少有一部分涉 及活体生物或活体生物的一部分。"大规模生物反应器"或"工业规模反应器"是用于在商 业或准商业规模上生成产品如生物燃料或生物燃料前体（如脂肪酸和/或TAG)的反应器。 大规模生物反应器通常具有的容积在升、数百升、数千升或者更大的范围内。
[0151] 根据本发明的某些方面的生物反应器可包含微生物或微生物培养物。在一些实施 方式中，生物反应器可包含本发明的某些方面提供的任意微生物的孢子和/或任意种类的 休眠细胞类型，例如干粉状态的细胞。在一些实施方式中，将合适的碳水化合物源加入这样 的生物反应器可导致休眠细胞的活化，例如导致酵母孢子的出牙并随后至少部分地将碳水 化合物源转化为生物燃料或生物燃料前体。
[0152] 根据本发明的某些方面的一些生物反应器可包括细胞培养系统，其中微生物与移 动的液体和/或气泡接触。根据本发明的某些方面的微生物或微生物培养物可悬浮生长或 贴附于固相载体而生长。载体细胞的非限制性实例包括微载体（例如聚合物球、微珠以及 微盘，可以为多孔或无孔的）、负荷特异性化学基团（例如季铵基团）的交联珠子（例如葡 聚糖）、2D微载体（包括捕获在非多孔多聚物纤维中的细胞）、3D微载体（例如载体纤维、 中空纤维、多管反应器、和可包含多孔纤维的半透膜）、离子交换能力减弱的微载体、胶囊细 胞、毛细管以及絮凝物。载体可由物质如葡聚糖、明胶、玻璃和纤维素制造。
[0153] 根据本发明方面的工业规模的碳水化合物向脂质转化的过程可以连续、半连续或 非连续的模式操作。根据本发明的操作模式的非限制性实例为批式、补料批式、延长批式、 重复批式、取出/注满、旋转壁、转瓶和/或灌注的操作模式。
[0154] 在一些实施方式中，可使用允许底物原料如碳水化合物源的连续或半连续更新， 和/或产物如分泌的脂质、包含脂质的有机相和/或显示了所需的脂质含量的细胞与反应 器进行连续或半连续分离的生物反应器。
[0155] 根据本发明的生物反应器的非限制性实例为：搅拌槽发酵罐、由旋转混合设备搅 拌的生物反应器、恒化器、由振荡设备搅拌的生物反应器、气升式发酵罐、堆积床反应器、固 定床反应器、流化床反应器、采用波式诱导搅拌的生物反应器、离心式生物反应器、滚瓶以 及中空纤维生物反应器、滚轮设备（例如台式设备、载车式设备和/或自动控制的这些种 类）、垂直堆放的平板、转瓶、搅拌或摇瓶、振荡的多孔板、MD瓶、T-瓶、Roux瓶、多表面组织 培养繁殖器、修饰的发酵罐以及包被的珠子（例如，由血清蛋白质、硝酸纤维素或羧甲基纤 维素包被珠子以防止细胞附着）。
[0156] 根据本发明的方面的生物反应器和发酵罐可选地包含感受器和/或控制系统以 测量和/或调整反应参数。反应参数的非限制性实例为：生物学参数例如生长速率、细胞大 小、细胞数量、细胞密度、细胞类型或细胞状态，化学参数如pH、氧化还原势能、反应底物和 /或产物的浓度、溶解气体的浓度如氧气浓度和co2浓度、营养物浓度、代谢物浓度、葡萄糖 浓度、谷氨酰胺浓度、丙酮酸浓度、磷石灰浓度、寡肽的浓度、氨基酸的浓度、维生素的浓度、 激素的浓度、添加剂的浓度、血清浓度、离子强度、离子的浓度、相对湿度、摩尔浓度、渗透 压、其他化学物例如缓冲试剂、佐剂或反应副产物的浓度，物理/机械参数如密度、电导率、 搅拌度、压力和流速、剪切力、剪切速率、粘度、颜色、浑浊度、光吸收、混合速率、转化率以及 热动力学参数如温度、光强度/质量等等。
[0157] 机械和电子领域的相关技术人员对能够测量如本文所述的参数的传感器是熟知 的。能够基于如本文所描述的传感器的输入信号调整反应器中参数的控制系统对生物反应 器工程领域的技术人员是熟知的。
[0158] 根据本发明的某些方面的用于向生物燃料或生物燃料前体转化所采用的碳源类 型取决于所采用的特定微生物。本发明的某些方面提供的一些微生物能够有效地转化特定 的碳水化合物源，但是相同的微生物可不能高效地加工不同的碳水化合物来源或根本无法 加工。根据本发明的方面，例如产油酵母解脂耶氏酵母能有效地将糖类如葡萄糖、果糖、蔗 糖和/或乳糖，及富含糖类的碳水化合物，例如糖蜜和植物纤维转化为脂肪酸及其衍生物。
[0159] 在一些实施方式中，由碳源原料生成的生物燃料或生物燃料前体如脂肪酸或三酰 基甘油是由本发明的某些方面提供的微生物例如产油酵母如解脂耶氏酵母细胞分泌的，或 至少由其分泌的。在一些实施方式中，根据本发明的某些方面的微生物与在生物反应器中 的水溶液中的碳水化合物源接触，并且分泌的生物燃料或生物燃料前体形成了可以与水相 相分离的有机相。如本文使用的，术语有机相指的是包含非极性、有机化合物例如脂肪酸、 TAG和/或其他非极性脂质的液相。根据本发明的有机相可以进一步含有微生物、碳水化 合物或在相应生物反应器中其他相的中发现的其他化合物。用于进行工业规模的相分离的 方法对本领域一般技术人员是熟知的。在一些实施方式中，有机相是持续或半持续虹吸出 去。在一些实施方式中，采用了包含分离器的生物反应器，分离器能够连续或半连续地萃取 有机相。
[0160] 在一些实施方式中，根据本发明的某些方面，生物燃料或生物燃料前体在细胞中 积累。在一些实施方式中，例如通过离心、沉淀或过滤的方式，连续或半连续地将积累了所 需量的生物燃料或生物燃料前体的细胞从生物反应器中分离。细胞分离可进一步例如基于 细胞物理特征如细胞大小或密度，通过本领域技术人员熟知的方法实现。随后可使用本领 域技术人员熟知的标准萃取方法如溶剂正己烷萃取法，从相应的细胞中萃取积累的生物燃 料或生物燃料前体。在一些实施方式中，以3倍于所收集的细胞体积的正己烷收集和萃取 微生物细胞。在一些实施方式中，对萃取的生物燃料或生物燃料前体进行进一步的精炼。在 一些实施方式中，使用本领域技术人员熟知的方法例如酯交换步骤将生物燃料前体如三酰 基甘油转化为生物燃料如生物柴油。
[0161] 本发明的这些和其他实施方式的功能和优势将从下文实施例得到更全面的理解。 以下实施例意欲阐述本发明的益处，但并未示例说明本发明的全部范围。因此，要理解的是 实施例章节不意欲限制本发明的范围。 实施例
[0162] 实施例1.
[0163] 材料和方法
[0164] 酵母菌株、生长及培养条件
[0165] 用于本研究的解脂耶氏酵母菌株来自野生型解脂耶氏酵母W29菌株 (ATCC20460)。用于所有转化的营养缺陷型Polg(Leu-)获自Yeastern Biotech公司 (Taipei, Taiwan)。本研究使用的所有菌株列于表1。
[0166] 表1.解脂耶氏酵母菌株的总脂肪酸含量、产率和分布。50mL培养物在100小时之 后的总脂肪酸含量表示为平均值土S.D. (n = 3)(C/N摩尔比率为20)。脂肪酸谱表示为脂 肪酸相对于总脂肪酸的百分比，误差低于2. 5%。
[0167]
【权利要求】
1. 分离的产油细胞，其包含增加 DGA1基因产物的表达的遗传修饰。
2. 权利要求1的分离的产油细胞，其进一步包含增加 ACC1基因产物的表达的遗传修 饰。
3. 权利要求1或权利要求2的分离的产油细胞，其进一步包含增加 SCD基因产物的表 达的遗传修饰。
4. 权利要求1-3的任何一项的分离的产油细胞，其进一步包含增加 ACL基因产物的表 达的遗传修饰。
5. 权利要求1-4的任何一项的分离的产油细胞，其中的遗传修饰包含增加基因产物表 达的核酸构建体，所述核酸构建体包含 (a) 包含在合适的同源或异源启动子的控制下的、编码基因产物的核酸序列的表达盒， 及/或 (b) 当插入细胞基因组时，调制基因产物的表达水平的核酸序列。
6. 权利要求5的分离的产油细胞，其中启动子为诱导型或组成型启动子。
7. 权利要求5或权利要求6的分离的产油细胞，其中启动子为TEF启动子。
8. 权利要求5-7的任何一项的分离的产油细胞，其中表达构建体进一步包含内含子。
9. 权利要求8的分离的产油细胞，其中内含子位于转录起始位点的下游。
10. 权利要求8或权利要求9的分离的产油细胞，其中内含子是在编码基因产物的核酸 序列之内。
11. 权利要求1-10的任何一项的分离的产油细胞，其中核酸构建体抑制或破坏对编码 基因产物的原生基因的天然调控，导致原生基因的过表达。
12. 权利要求11的分离的产油细胞，其中对原生基因的天然调控的抑制或破坏是通过 对调控所述基因表达的调控区域或调控区域的部分进行删除、破坏、突变和/或置换而介 导的。
13. 权利要求1-12的任何一项的分离的产油细胞，其中基因产物是转录物。
14. 权利要求1-13的任何一项的分离的产油细胞，其中基因产物为蛋白质。
15. 权利要求5-14的任何一项的分离的产油细胞，其中核酸构建体插入细胞的基因组 内。
16. 权利要求1-15的任何一项的分离的产油细胞，其中基因产物的表达增加赋予细胞 将碳源向脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或甘油三酯（TAG)转化的有益表型。
17. 权利要求16的分离的产油细胞，其中有益表型包括修饰的脂肪酸谱、修饰的TAG 谱、增加的脂肪酸和/或甘油三酯合成速率、增加的转化产率、增加的细胞中甘油三酯积累 及/或增加的细胞脂质体中甘油三酯的积累。
18. 权利要求16或17的分离的产油细胞，其中细胞的脂肪酸或TAG的合成速率比相同 细胞类型的未修饰细胞增加至少2倍。
19. 权利要求18的分离的产油细胞，其中细胞的脂肪酸或TAG的合成速率比相同类型 细胞类型的未修饰细胞增加至少5倍。
20. 权利要求18的分离的产油细胞，其中细胞的脂肪酸或TAG的合成速率比相同类型 细胞类型的未修饰细胞增加至少10倍。
21. 权利要求16-20的任何一项的分离的产油细胞，其中细胞将碳源转化为脂肪酸或 TAG的转化率在大约0. 025g/g-大约0. 32g/g (产生的TAG g/消耗的葡萄糖g)的范围内。
22. 权利要求21的分离的产油细胞，其中细胞将碳源转化为脂肪酸或TAG的转化率为 至少大约0. llg/g。
23. 权利要求22的分离的产油细胞，其中细胞将碳源转化为脂肪酸或TAG的转化率为 至少大约〇· 195g/g。
24. 权利要求23的分离的产油细胞，其中细胞将碳源转化为脂肪酸或TAG的转化率为 至少大约0. 24g/g。
25. 权利要求24的分离的产油细胞，其中细胞将碳源转化为脂肪酸或TAG的转化率为 至少大约0. 27g/g。
26. 权利要求1-25的任何一项的分离的产油细胞，其中细胞包含脂质小体或液泡。
27. 权利要求1-26的任何一项的分离的产油细胞，其中细胞为细菌细胞、藻类细胞、真 菌细胞或酵母细胞。
28. 权利要求1-27的任何一项的分离的产油细胞，其中细胞为产油酵母细胞。
29. 权利要求1-28的任何一项的分离的产油细胞，其中细胞为解脂耶氏酵母细胞。
30. 培养物，其包含权利要求1-29的任何一项的产油细胞。
31. 权利要求30的培养物，其进一步包含碳源。
32. 权利要求31的培养物，其中碳源包含可发酵糖。
33. 权利要求32的培养物，其中可发酵糖为C6糖。
34. 权利要求33的培养物，其中碳源包含葡萄糖。
35. 权利要求31-34的任何一项的培养物，其中碳源包含有机酸。
36. 权利要求35的培养物，其中有机酸为醋酸。
37. 权利要求36的培养物，其中醋酸的浓度为至少5% vol/vol、至少10% vol/vol、至 少 15% vol/vol、至少 20% vol/vol、至少 25% vol/vol 或至少 30% vol/vol。
38. 权利要求31-37的任何一项的培养物，其中碳源包含醋酸。
39. 权利要求38的培养物，其中醋酸盐的浓度为至少1% vol/vol。
40. 权利要求38的培养物，其中醋酸盐的浓度为至少2% vol/vol。
41. 权利要求38的培养物，其中醋酸盐的浓度为至少3% vol/vol。
42. 权利要求38的培养物，其中醋酸盐的浓度为至少4% vol/vol。
43. 权利要求38的培养物，其中醋酸盐的浓度为至少5% vol/vol。
44. 权利要求30-43的任何一项的培养物，其中培养物包含甘油。
45. 权利要求44的培养物，其中甘油浓度为大约2% vol/vol。
46. 权利要求30-45的任何一项的培养物，其中培养物包含溶解氧水平为至少5%、至 少10%、至少15%或至少20%。
47. 权利要求30-46的任何一项的培养物，其中培养物显示的pH在pH7. 0-pH7. 5的范 围内。
48. 权利要求30-47的任何一项的培养物，其中培养物包含硫酸铵。
49. 权利要求48的培养物，其中培养物包含以1:2比率的硫酸铵和醋酸。
50. 权利要求30-49的任何一项的培养物，其中培养物显示5g/l-60g/l之间的脂质滴 度。
51. 权利要求30-50的任何一项的培养物，其中培养物显示0. 04g/l/h-0. 60g/l/h之间 的脂质生广。
52. 权利要求30-51的任何一项的培养物，其中培养物显示0. lg/1/h-lg/l/h之间的最 大脂质生产效率。
53. 方法，其包含 将碳源与分离的产油细胞接触，所述细胞包含增加 DGA1基因产物的表达的遗传修饰； 以及 将碳源与细胞接触在适合细胞将至少部分碳源转化为脂肪酸或甘油三酯的条件下进 行孵育。
54. 权利要求53的方法，其中产油细胞进一步包含增加 ACC1基因产物的表达的遗传修 饰。
55. 权利要求53或权利要求54的方法，其中产油细胞进一步包含增加 SCD基因产物的 表达的遗传修饰。
56. 权利要求53-55的任何一项的方法，其中产油细胞进一步包含增加 ACL基因产物的 表达的遗传修饰。
57. 权利要求53-56的任何一项的方法，其中分离的产油细胞是权利要求1-27中任何 一项的分离的产油细胞。
58. 权利要求53-57的任何一项的方法，其中碳源包含可发酵糖。
59. 权利要求58的方法，其中碳源包含葡萄糖。
60. 权利要求53-59的任何一项的方法，其中碳源包含醋酸盐。
61. 权利要求60的方法，其中醋酸盐的浓度为至少1% vol/vol。
62. 权利要求60的方法，其中醋酸盐的浓度为至少2% vol/vol。
63. 权利要求60的方法，其中醋酸盐的浓度为至少3% vol/vol。
64. 权利要求60的方法，其中醋酸盐的浓度为至少4% vol/vol。
65. 权利要求60的方法，其中醋酸盐的浓度为至少5% vol/vol。
66. 权利要求53-65的任何一项的方法，其中碳源包含醋酸。
67. 权利要求66的方法，其中醋酸的浓度为至少5% vol/vol、至少10% vol/vol、至少 15% vol/vol、至少 20% vol/vol、至少 25% vol/vol 或至少 30% vol/vol。
68. 权利要求53-67的任何一项的方法，其中方法包括将细胞与溶解氧接触，其中溶解 氧水平为至少5%、至少10%、至少15%，或至少20%。
69. 权利要求53-68的任何一项的方法，其中的接触和/或孵育是在pH7. 0-pH7. 5的 pH范围内进行的。
70. 权利要求53-69的任何一项的方法，其中的方法包括将细胞与硫酸铵接触。
71. 权利要求70的方法，其中方法包括将细胞与比率为1:2的硫酸铵和醋酸接触。
72. 权利要求53-71的任何一项的方法，其中方法进一步包含将细胞与甘油接触。
73. 权利要求72的方法，其中方法包括将细胞与浓度为大约2% vol/vol的甘油接触。
74. 权利要求53-73的任何一项的方法，其中与分离的产油细胞接触的碳源在反应器 中进行孵育。
75. 权利要求53-74的任何一项的方法，其中将碳源与分离的产油细胞接触，并在分批 补料过程中进行孵育，使碳源转化为脂肪酸或甘油三酯。
76. 权利要求53-75的任何一项的方法，其中将碳源与分离的产油细胞接触，并在连续 过程中进行孵育，使碳源转化为脂肪酸或甘油三酯。
77. 权利要求53-76的任何一项的方法，其进一步包括在孵育步骤中一次或多次地将 额外量的碳源或一定量的额外碳源与接触分离的产油细胞的碳源进行接触。
78. 权利要求53-77的任何一项的方法，其中通过溶剂萃取法从接触分离的产油细胞 的碳源中萃取脂肪酸或甘油三酯。
79. 权利要求78的方法，其中溶剂萃取包括氯仿甲醇萃取。
80. 权利要求78的方法，其中溶剂萃取包括正己烷萃取。
81. 权利要求53-80的任何一项的方法，其中将脂肪酸或甘油三酯与接触分离的产油 细胞的碳源分离，并随后通过酯交换反应进行精炼。
82. 方法，其包括通过增加细胞中DGA1基因产物的表达以在产油细胞中修饰脂肪酸 谱、甘油三酯谱、脂肪酸合成速率、甘油三酯合成速率、脂肪酸衍生物积累的程度、脂肪酸衍 生物分泌速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化率、和/或碳水化合物向脂肪 酸或脂肪酸衍生物转化的有效产率。
83. 权利要求82的方法，其进一步包括增加细胞中ACC1基因产物的表达。
84. 权利要求82或权利要求83的方法，其进一步包括增加细胞中SCD基因产物的表达
85. 权利要求82-84的任何一项的方法，其进一步包括增加细胞中ACL基因产物的表 达。
86. 权利要求82-85的任何一项的方法，其中脂肪酸衍生物积累的程度是脂肪酸衍生 物在脂质小体中积累的程度。
87. 权利要求82-86的任何一项的方法，其中脂肪酸衍生物为甘油三酯。
88. 权利要求82-87的任何一项的方法，其中对产油细胞中脂肪酸谱、甘油三酯谱、月旨 肪酸合成速率、甘油三酯合成速率、脂肪酸衍生物积累的程度、脂肪酸衍生物分泌速率、碳 水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化率、和/或碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物 转化的有效产率的修饰包含增加产油细胞中的脂肪酸合成速率、甘油三酯合成速率、脂肪 酸衍生物积累的程度、脂肪酸衍生物分泌速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转 化率、和/或碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物转化的有效产率。
89. 权利要求88的方法，其中对细胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化效 率的修饰包含使转化效率增加至少2倍。
90. 权利要求88的方法，其中对细胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化效 率的修饰包含使转化效率增加至少3倍。
91. 权利要求88的方法，其中对细胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化效 率的修饰包含使转化效率增加至少4倍。
92. 权利要求88的方法，其中对细胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化效 率的修饰包含使转化效率增加至少5倍。
93. 权利要求82-92的任何一项的方法，其中细胞为酵母细胞。
94. 权利要求93的方法，其中酵母细胞为耶氏酵母属细胞。
95. 权利要求94的方法，其中产油酵母为解脂耶氏酵母。
96. 分离的核酸分子，其包含： a) 编码SEQ ID N0:2(解脂耶氏酵母DGA1)的核苷酸序列，或 b) 与a)的核苷酸序列至少85%相同的核苷酸序列。
97. 权利要求96的分离的核酸分子，其中编码SEQ ID NO: 2的核苷酸序列包含SEQ ID N0:1。
98. 表达盒，其包含权利要求96或97的分离的核酸分子以及异源启动子。
99. 权利要求98的表达盒，其中启动子为组成型启动子或诱导型启动子。
100. 权利要求99的表达盒，其中异源启动子为翻译延长因子（TEF)启动子。
101. 权利要求98-100的任何一项的表达盒，其中异源启动子包含内含子。
102. 权利要求98-101的任何一项的表达盒，其中异源启动子进一步包含起始密码子。
103. 权利要求102的表达盒，其中内含子位于编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的翻译 起始位点的下游。
104. 载体，其包含权利要求98-103中任何一项的表达盒。
105. 细胞，其包含权利要求98-104中任何一项的表达盒或权利要求104的载体的至少 一部分。
【文档编号】C12P7/64GK104160020SQ201280060959
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2012年10月19日 优先权日:2011年10月19日
【发明者】G·斯蒂芬诺珀罗斯, M·泰, S·查克拉伯蒂 申请人:麻省理工学院