专利名称：一种高特异高敏感检测金黄色葡萄球菌的方法
技术领域：
本发明涉及疾病检测技术领域，具体的说，是一种高特异高敏感检测金黄色葡萄球菌的方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus )是人类的一种重要病原菌,隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，有“嗜肉菌〃的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染和食物中毒。急需特异性和敏感度高的快速诊断试剂。环介导等温扩增技术是由日本荣研(EIKEN)株式会社开发的高特异性敏感度的核酸检测系统，无须昂贵的设备，已经成为核酸快速检测法的良好手段，本发明结合环介导等温扩增技术，设计针对金黄色葡萄球菌特异性基因序列的一对外引物(SA-F3和SA-B3)和一对内引物(SA-FIP和SA-BIP)进行环介导等温扩增。
发明内容
本发明公开了一种高特异高敏感检测金黄色葡萄球菌的方法，提高了它的检测和诊断效率。样处理厂的告知系统为实 现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种高特异高敏感检测金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤:
步骤I)制备反应液 反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM
4M甜菜碱IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
内引物
SA-FIP40umol
SA-BIP40umol
外引物
SA-F35umol
SA-B35umol
标本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul;
步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性；
步骤3)提取临床分离金黄色葡萄球菌及金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923，以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。进一步的，所述外引物SA-F3的序列为CCAGACTCGGGTCAGGAA。进一步的，所述外引物SA-B3的序列为ACTTCCCAAAATGCGCTCC。
进一步的，所述内引物SA-FIP的序列为 AACGGCTTAGTGGCTGTGTCAT-CTCCATAGTCGCGACGTTTC。进一步的，所述内引物SA-BIP 的序列为 TTACGAAGGCGATGTGTGCCG-GGTCGTGCAGCAATTCAGG。
进一步的，所述反应液中加入突光显示物质溴化乙锭、I丐黄绿素进行实时检查。本发明的有益效果是:
本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测金黄色葡萄球菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。
具体实施例方式下面将结合实施例，来详细说明本发明。一种高特异高敏感检测金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤:
步骤I)制备反应液
反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM
4M甜菜碱IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
内引物
SA-FIP40umol
SA-BIP40umol
外引物
SA-F35umol
SA-B35umol
标本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul。选取金黄色葡萄球菌特异性基因基因(基因序列来源美国国立生物技术信息中心-NCBI )，设计引物序列。所述外引物SA-F3的序列为CCAGACTCGGGTCAGGAA，所述外引物SA-B3的序列为ACTTCCCAAAATGCGCTCC，所述内引物SA-FIP的序列为
AACGGCTTAGTGGCTGTGTCAT-CTCCATAGTCGCGACGTTTC，所述内引物 SA-BIP 的序列为 TTACGAAGGCGATGTGTGCCG-GGTCGTGCAGCAATTCAGGo进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性；
步骤3)提取临床分离金黄色葡萄球菌11株及金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923，以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。结果显示:11株金黄色葡萄球菌均为阳性，其余菌种为阴性。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包 含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种高特异高敏感检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤I)制备反应液 反应液组成及含量为 8u/ul Bst核酸聚合酶8u IOX耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM4M甜菜碱IM IOmM d-NTP 混合液400 μ M 内引物 SA-FIP40umol SA-BIP40umol 外引物 SA-F35umol SA-B35umol标本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul; 步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性； 步骤3)提取临床分离金黄色葡萄球菌及金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923，以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。
2.根据权利要求1所述的高特异高敏感检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于:所述外引物SA-F3的序列为CCAGACTCGGGTCAGGAA。
3.根据权利要求2所述的高特异高敏感检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于:所述外引物 SA-B3 的序列为 ACTTCCCAAAATGCGCTCC。
4.根据权利要求3所述的高特异高敏感检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于:所述内引物SA-FIP的序列为AACGGCTTAGTGGCTGTGTCAT-CTCCATAGTCGCGACGTTTC。
5.根据权利要求4所述的高特异高敏感检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于:所述内引物 SA-BIP 的序列为 TTACGAAGGCGATGTGTGCCG-GGTCGTGCAGCAATTCAGG。
6.根据权利要求5所述的高特异高敏感检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于:所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
全文摘要
本发明公开了一种高特异高敏感检测金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤步骤1)制备反应液；步骤2)将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;步骤3)提取临床分离金黄色葡萄球菌及金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923，以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸,多次进行反应，观察它们的阴阳性。本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测金黄色葡萄球菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。
文档编号C12Q1/68GK103205491SQ20131008056
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月14日 优先权日2013年3月14日
发明者郦芳华, 吴妹英, 金京勋, 沈永林, 贾宇玲, 赵静, 吴兴福 申请人:苏州市第五人民医院