一种对人类白血球抗原基因位点进行以测序为基础的分型系统及方法
【专利摘要】本发明公开了一种对人类白血球抗原基因位点（HLA?locus）进行以测序为基础的分型（SBT）系统，其包含：(a)用于根据一实验的设定方案而进行PCR和测序的自动化移液装置；及(b)用于产生该实验的设定方案的电脑装置，其通过包含以下步骤的方法产生该实验的设定方案：(i)接收一个体于该HLA基因位点的初步分型结果；(ii)根据已知的HLA等位基因型，计算该初步分型结果的所有不确定性组合；及(iii)以解开最多的步骤(ii)所得的不确定性组合为前提，选择一或多个引物。
【专利说明】一种对人类白血球抗原基因位点进行以测序为基础的分型 系统及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人类白血球抗原（HLA)测序分型（SBT)的方法，本发明还涉及用于HLA 测序分型的系统。
【背景技术】
[0002] 人类白血球抗原（HLA)系统即人类的主要组织相容性复合体（MHC)。主要的HLA 抗原对于免疫功能不可或缺。任何表现"非自体"HLA抗原的细胞，人体的免疫系统会视之 为入侵者而导致带有这些细胞的组织被人体排斥，由于此种情况将造成移植的排斥反应， 因此在涉及组织移植的情况下尤显重要。基于HLA在移植上的重要性，目前常通过血清学 检验及PCR来进行HLA基因位点的分型。
[0003] MHC的各基因位点是哺乳类动物中遗传变异性最高的基因位点之一，而人类的 HLA基因位点也不例外。目前有两种HLA的命名系统：第一种也是最早的命名系统，是基于 血清(抗体）的辩识系统，在此系统中，白血球抗原最后以字母或数字命名（例如，HLA-B27); 另外也发展出一种可以更精确定义各等位基因型（alleles)的命名系统，在此系统中，以 "HLA"与及四码或更多码的数字连接，作为某一 HLA基因位点的特定等位基因型的命名 (例如，HLA-B*08:12 及 HLA-A*24:01)。
[0004] 基因测序可提供最可罪和准确的基因 DNA序列资讯，因此，在决定HLA的基因 多态性的完整内容和复杂度上特别重要。过去数年，HLA基因的以测序为基础的分型 (sequencing-based typing; SBT)有明显的进展，使得HLA分型的PCR-SBT于常规应用得以 实现。然而，如果分型的结果具有不确定性时，那么使用现有的PCR-SBT方法及系统(例如， Protrans公司所提供的软体及Eppendorf公司所提供的自动化移液装置tpMotion? )即 无法主动和自动地解开这些不确定性，而操作者就必须进一步再通过使用其他供应商的系 统来检测样本以获得答案。因此，目前仍需要更佳的PCR-SBT方法或系统来解决该问题。
【发明内容】
[0005] 因此，在一方面，本发明提供一种对人类白血球抗原基因位点（HLA locus)进行 以测序为基础的分型（SBT)方法，其包含：(A)提供来自一个体的受测样本和该个体于该 人类白血球抗原基因位点的初步分型结果；及（B)通过一方法以决定用于该受测样本的 PCR-SBT的一或多个引物，该方法包括以下步骤：（a)根据已知的HLA等位基因型，计算该初 步分型结果的所有不确定性组合；及（b)以解开最多的步骤（a)所得的不确定性组合为前 提，选择一或多个引物。
[0006] 该初步分型结果可通过血清学方法或以DNA为基础的方法(例如，SS0P、rSSOP、 SSP及SBT)取得。
[0007] 另一方面，本发明提供一种对人类白血球抗原基因位点（HLA locus)进行以测序 为基础的分型（SBT)系统，其包含：(a)用于根据一实验的设定方案进行PCR和测序的自动 化移液装置；及（b)用于产生该实验的设定方案的电脑装置，其通过包含以下步骤的方法 产生该实验的设定方案：（i)接收一个体于该人类白血球抗原基因位点的初步分型结果；
[11] 根据已知的HLA等位基因型，计算该初步分型结果的所有不确定性组合；及（iii)以 解开最多步骤（ii)所得的不确定性组合为前提，选择一或多个引物。
[0008] 无须进一步的阐述，相信本发明所属领域的技术人员基于前述说明即可利用本发 明至最广的程度。因此，可以理解以下的说明仅仅是作为例示说明之用，而非以任何方式限 制其余的揭露内容。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1是先前技术中典型的HLA的PCR-SBT系统的流程图。
[0010] 图2是根据本发明的一具体实施例的HLA测序分型的系统所绘制的流程图。
【具体实施方式】
[0011] 除非另有指明，所有在此处使用的技术性和科学性术语具有如同本发明所属技术 领域的技术人员一般所了解的意义。
[0012] 本文所使用的"一"一词，如未特别指明，是指至少一个(一个或一个以上）的数量。
[0013] 本文所使用的"个体（a subject)-词"，是指接受HLA分型的动物，较佳为哺乳动 物，更佳为人。
[0014] 在一方面，本发明提供一种对人类白血球抗原（HLA)基因位点进行以测序为基础 的分型（sequencing-based typing, SBT)方法，其包含：(A)提供来自一个体的受测样本和 该个体于该人类白血球抗原基因位点的初步分型结果；及（B)通过一方法以决定用于该受 测样本的PCR-SBT的一或多个引物，该方法包括以下步骤：（a)根据已知的HLA等位基因 型，计算该初步分型结果的所有不确定性组合；及（b)以解开最多的步骤（a)所得的不确定 性组合为前提，选择一或多个引物。
[0015] HLA是人类染色体中最具多态性的基因之一，而已知的HLA等位基因型的总数 从1999年4月到2012年4月增加了 8倍。根据安东尼.诺兰研究所（Anthony Nolan Institute)(与欧洲生物资讯研究所合作）的线上公共资料库（http://www. ebi. ac. uk/ imgt/hla/stats. html),目前世界上已知有8, 496个HLA等位基因型。为了解决因为不断 增加的HLA等位基因型而造成的测序不确定性，目前供应商通过增加用于解开等位基因型 不确定性的"群组特定的测序引物"（Group Specific Sequencing Primers ;GSSP)或"群 组特定的扩增引物"（Group Specific Amplification Primers ;GSA)的数目来解决这个 问题。
[0016] 本发明的方法是利用欲分型的HLA的一初步分型结果，在进行PCR-SBT之前，计算 所有可能的不确定性组合，以主动和自动解决该不确定性，简化使用者操作上的程序并减 少获得分型结果的时间。另外，本发明以计算所有可能的不确定性组合为前提，选择一或多 个引物执行PCR-SBT，相较于使用目前供应商提供的方法，可降低实验材料不必要的浪费。
[0017] 该初步分型结果提供该HLA基因位点的初步(或粗略）HLA型别。根据本发明，该 初步分型结果提供低分辨度至中分辨度的HLA型别(例如，A*02为一低分辨度的HLA型别， A*02:01-02为一中分辨度的HLA型别)，该初步分型的结果可通过一血清学方法或一以DNA 为基础的方法（DNA-based method)获得。
[0018] 在本发明的特定具体实施例中，该初步分型结果是通过选自于由序列特异的寡核 苷酸探针法（sequence-specific oligonucleotide probe ;SS0P)、反向序列特异的寡核苷 酸探针法（reverse sequence-specific oligonucleotide probe ;rSS0P)、序列特异的引 物法（sequence-specific primer ;SSP)及测序分型法（sequencing-based typing ;SBT) 的一以DNA为基础的方法而获得。
[0019] 本文所使用的"不确定性组合"（ambiguity combination)是指两组或两组以上 等位基因组合在基因测序后发现其联合碱基序列相同而具有不确定性（ambiguity)，因此， 无法确定受测样本在欲测序的基因位点的确切等位基因序列组合。
[0020] 本文所使用的"联合碱基序列"（combined base pair sequence)是以单一碱基 序列来表示一组等位基因组合在基因测序的结果，除各碱基的代号，例如，A、T、C及G，本领 域亦使用如下表的代号，可用于表示等位基因组合在基因测序的结果：
[0021] 表1 :碱基代号表
[0022] R~|嘌呤(A或G) ?~嘧啶（C或T) N~任何碱基 W~弱碱基(A或T)~ S~强碱基（G或C)~ Μ~氨碱基(Α或C)~ Κ~酮碱基（G或Τ)~ Β~非A (G或C或Τ) ?~非G (Α或C或Τ) D~非C (Α或G或Τ) V~非Τ (Α或G或C)
[0023] 基于该初步分型结果和可获得自公共资料库(例如，欧洲生物资讯研究所的MGT/ HLA 资料库 http: //www. ebi. ac. uk/imgt/hla/stats. html)的已知 HLA 等位基因型资 讯，可以计算该初步分型结果的可能的不确定性组合，此亦即为来自该个体的受测样本在 PCR-SBT中可能产生的不确定性组合。在本发明的较佳具体实施例中，可能的不确定性组合 通过包含下列步骤的方法计算：（i)根据已知的HLA等位基因型，并列（aligning)所有等位 基因组合的序列(基于该初步分型结果）；（ii)比对任两组等位基因组合的联合碱基对序列 (combined base pair sequence);及（iii)若该两组等位基因组合具有相同的联合碱基序 列，则决定该两组等位基因组合为一不确定性组合。
[0024] 由于超过90%的人在每一个HLA基因位点皆为异型的（heterozygous)，要将HLA 分型至等位基因的层次，只证实特定序列的存在是不足够的，必须进一步证明这些特定序 列在两个单倍体上是如何组合(连接）的，也就是个别的单倍体上的特定片段序列究竟为 何。同理，为了决定任两组等位基因组合在测序上是否具有不确定性，则须定义与比较每一 等位基因组合的联合喊基对序列。由于联合喊基对序列指的是一等位基因组合中代表两个 单倍体序列的一般碱基对。因此，如果两组等位基因组合具有相同的联合碱基序列，它们在 测序上即具有不确定性。
[0025] 在初步分型结果的所有可能的不确定性组合，被加以计算和决定后，即能于解开 最多不确定性组合的前提下，针对该不确定性组合的群组设计或选择特定的引物，以进行 该受测样本的PCR-SBT。根据本发明，能决定特定个体使用PCR-SBT分型方法的"最佳"引 物，因此可在在使用最少的实验材料和时间下主动的解开这些不确定性。
[0026] 另一方面，本发明提供一种对人类白血球抗原基因位点（HLA locus)进行以测序 为基础的分型（SBT)系统，其包含：（a)用于根据一实验的设定方案（experimental setup protocol)进行PCR和测序的自动化移液装置；及（b)用于产生该实验的设定方案的电脑 装置，其通过包含以下步骤之方法产生该实验的设定方案：（i)接收一个体于该HLA基因位 点的初步分型结果；（ii)根据已知的HLA等位基因型，计算该初步分型结果的所有不确定 性组合；及（iii)以解开最多的步骤（ii)所得的不确定性组合为前提，选择一或多个引物。
[0027] 用于PCR和测序的自动化移液装置（automated pipetting device)可经由商业 渠道获得，例如，Texas BioGene的DX-A Pipettor系统。
[0028] 该自动化移液装置根据一实验的设定方案（experimental setup protocol)进行 自动化PCR和测序程序，该实验的设定方案可由一操作者输入或设定。在先前技术中，该实 验的设定方案仅指示该自动化移液装置使用一组预设或常规的引物进行PCR和测序。在本 发明中，利用一电脑装置（a computer means)来决定针对特定受测个体的"最佳"引物组， 再依此产生实验的设定方案，以指示该自动化移液装置使用该"最佳"引物组进行PCR和测 序，能主动解决不确定性的问题、节省实验时间并降低实验材料不必要的浪费。
[0029] 根据本发明，该电脑装置通过包含下列步骤的方法产生该实验的设定方案：（i) 接收一个体于该人类白血球抗原基因位点的初步分型结果；（ii)根据已知的HLA等位基因 型，计算该初步分型结果的所有不确定性组合；及（iii)以解开最多的步骤（ii)所得的不 确定性组合为前提，选择一或多个引物。该电脑装置可选自于，例如，由电脑系统、桌上型电 脑、笔记型电脑及可携式计算装置所组成的群组。
[0030] 该初步分型结果可由操作者手动输入。该初步分型结果提供该HLA基因位 点的一初步(或粗略）HLA型别。根据本发明，该初步分型结果提供低分辨度至中分辨 度的HLA型别，其可通过一血清学方法或一以DNA为基础的方法而获得。在本发明 的特定具体实施例中，该初步分型结果是通过选自于由序列特异的寡核苷酸探针法 (sequence-specific oligonucleotide probe ;SS0P)、反向序列特异的寡核苷酸探针 法（reverse sequence-specific oligonucleotide probe ;rSS0P)、序列特异的引物法 (sequence-specific primer ;SSP)及测序分型法（sequencing-based typing ;SBT)的一 以DNA为基础的方法而获得。
[0031] 基于该初步分型结果和可自公共资料库(例如，欧洲生物资讯研究所的頂GT/HLA 资料库http: //www. ebi. ac. uk/imgt/hla/stats. html)获得的已知HLA等位基因型资讯， 可以计算该初步分型结果的可能的不确定性组合，此亦即为来自该受测样本在PCR-SBT中 所可能产生的不确定性组合。
[0032] 在本发明的较佳具体实施例中，可能的不确定性组合通过包含下列步骤的方法 计算：（1)根据已知的HLA等位基因型，并列（aligning)所有等位基因组合的序列（基于 该初步分型结果）；（2)比对任两组等位基因组合的联合碱基对序列（combined base pair sequence);及（3)若该两组等位基因组合具有相同的联合碱基序列，则决定该两组等位基 因组合为一不确定性组合。
[0033] 在该初步分型结果的所有可能的不确定性组合被计算和决定后，可以在解开最多 该不确定性组合的前提下，选择群组特定的引物，然后该电脑装置即可根据所选择的群组 特定引物产生该实验的设计方案。
[0034] 本发明以下列实例做进一步阐明，但发明范围不受于此限。
[0035] 实施例1 :HLA的PCR-SBT方法流程
[0036] 图1是先前技术中典型的HLA的PCR-SBT系统的流程图。如图1所示，在输入受 测样本的ID及欲进行的SBT试验后，先前技术中的SBT系统将直接输出实验的设计方案至 自动化系统并开始执行PCR-SBT。如果试验的结果包含不确定性，必须人工以其他供应商的 系统进行额外的试验。
[0037] 图2是根据本发明的一具体实施例的HLA测序分型的系统所绘制的流程图。如图 2所示，本发明的PCR-SBT系统会先根据先前的分型资讯(初步分型结果）检验是否有不确 定性的存在，并通过决定所有可能的不确定性组合后选择能够解开不确定性的最佳引物或 引物组合。因为本发明是针对特定个体决定和使用"最佳"引物于PCR-SBT试验，因此可在 使用最少的实验材料和时间下主动解开该不确定性。
[0038] 实施例2 :联合碱基对序列的比对及引物的选择--(1)
[0039] 在一个体于HLA-A位点的初步分型结果为A*02/A*04的情况下，Α*02:01:01/7 八*04:01:01和斿02:02:01//^*04:02:01是已知的!11^等位基因组合的其中之二(可见于公 共资料库)。上述两组等位基因组合的联合碱基对的比对例示说明如下：
[0040] Pos. A Pos. B
[0041] A*02:01:01 ...ACGGTCC...
[0042] A*04:01:01 ...AGGGGCC...
[0043] 联合碱基对 ….ASGGKCC···
[0044] Pos. A Pos. B
[0045] A*02:02:01 ...ACGGGCC...
[0046] A*04:02:01 ...AGGGTCC...
[0047] 联合碱基对 ….ASGGKCC···
[0048] 上述两组等位基因组合的联合碱基对是相同的，代表在测序上将具不确定性，因 此它们构成一组不确定性组合。若要确定哪一组等位基因组合是真实的基因序列，可设计 或选择仅可结合到Pos. A的C或G其中之一的引物，然后测序确认Pos. B的碱基。
[0049] 实施例3 :联合碱基对序列之比对及引物之选择一(2)
[0050] 在一个体于HLA-A位点的初步分型结果为A*01/A*01的情况下，A*01:01:01:01// A*01:20和A*01:02//A*01:66是已知的HLA等位基因组合的其中之二(可见于公共资料 库)。上述两组等位基因组合的联合碱基对的比对例示说明如下：
[0051] Pos. 127 Pos. 355
[0052] A*01:20 . . . A A.........................G AT...
[0053] A*01:01:01:01 . . . G A.........................A AT...
[0054] 联合碱基对 · · · R A..........................R AT...
[0055] Pos. 127 Pos. 355
[0056] A*01:02 . . . A A.........................A AT...
[0057] A*01:66 . . . G A.........................G AT...
[0058] 联合碱基对 · · · R A.........................R AT...
[0059] 上述两组等位基因组合的联合碱基对是相同的，代表在测序上将具不确定性，因 此它们构成一组不确定性组合。然而，若设计可结合至序列107-127且在3'端的碱基为 「A」的引物，则此引物可与A*01:01:01:01和A*01:66的序列结合。接着朝向Pos. 355测 序，若 Pos. 355 为 "A"，则正确的组合为 A*01:01:01:01//A*01:20 ;若 Pos. 355 为 "G"，则正 确的组合为 A*01:02//A*01:66。
[0060] 实施例4 :不确定性组合及引物的选择
[0061] 在一个体于HLA-A位点的初步分型结果为A*02/A*04的情况下，可能的不确定性 组合可以是如下表的形式：
[0062] 表2 :A*02/A*04可能的不确定性组合
[0063]
【权利要求】
1. 一种用于对人类白血球抗原基因位点（HLA基因位点）进行以测序为基础的分型 (SBT)系统测序，其包含： (a) 用于根据一实验的设计方案进行PCR和测序的自动化移液装置；及 (b) 用于产生该实验的设计方案的电脑装置，其通过包含以下步骤的方法产生该实验 的设计方案： (i) 接收一个体于该HLA基因位点的初步分型结果； (ii) 根据已知的HLA等位基因型，计算该初步分型结果的所有不确定性组合；及 (iii) 以解开最多的步骤（ii)所得的不确定性组合为前提，选择一或多个引物。
2. 根据权利要求1的系统，其中该电脑装置选自于由电脑系统、桌上型电脑、笔记型电 脑及可携式计算装置所组成的群组。
3. 根据权利要求1的系统，其中该初步分型结果为一低分辨度至中分辨度的HLA型别。
4. 根据权利要求1的系统，其中该步骤（ii)包含以下步骤： (1) 根据已知的HLA等位基因型，并列所有等位基因组合的序列； (2) 比对任两组等位基因组合的联合碱基对序列；及 (3) 若该两组等位基因组合具有相同的联合碱基序列，则决定该两组等位基因组合为 一不确定性组合。
5. -种用于对人类白血球抗原基因位点（HLA基因位点）进行以测序为基础的分型测 序方法，其包含： (A) 提供来自一个体的受测样本和该个体于该HLA基因位点的初步分型结果；及 (B) 通过一方法以决定用于该受测样本的PCR-SBT的一或多个引物，该方法包括以下 步骤： (a) 根据已知的HLA等位基因型，计算该初步分型结果的所有不确定性组合；及 (b) 以解开最多的步骤（a)所得的不确定性组合为前提，选择一或多个引物。
6. 根据权利要求5的方法，其中该初步分型结果通过一血清学方法或一以DNA为基础 的方法获得。
7. 根据权利要求6的方法，其中该以DNA为基础的方法选自于由SSOP、rSSOP、SSP及 SBT所组成的群组。
8. 根据权利要求5的方法，其中该初步分型结果为一低分辨度至中分辨度的HLA型别。
9. 根据权利要求5的方法，其中该步骤（a)包含以下步骤： (1) 根据已知的HLA等位基因型，并列所有等位基因组合的序列； (2) 比对任两组等位基因组合的联合碱基对序列；及 (3) 若该两组等位基因组合具有相同的联合碱基序列，则决定该两组等位基因组合为 一不确定性组合。
【文档编号】C12Q1/68GK104102855SQ201310116383
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月3日 优先权日:2013年4月3日
【发明者】许明聪, 吴崇楷 申请人:德必碁生物科技（厦门）有限公司