酵母菌及其在污水处理中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种酵母菌Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｎｔａｍａｒｉａｅ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ ２９５９和Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｋｉｙｏｓｈｉｄａｉｎｕｍ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ ３１５０及其在低温高盐污水处理中的应用。本发明通过将保藏的菌种选择ＭＹＧＰ培养基，ｐＨ自然，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ，以平板划线或涂布的方法接种于ＭＹＰＧ培养基表面，在最适培养温度下恒温培养３－５天，将增殖培养的菌株单独或混合接种于生活污水、工业废水中，在１０－２０℃下通培养、检测，菌种混合在有机废水生物处理中作用突显，有效提高低温高盐条件下有机废水生物处理效率，优于单独菌在有机废水生物处理中作用，本发明菌种广泛应用于低温污水处理领域。
【专利说明】酵母菌及其在污水处理中的应用 发明领域
[0001] 本发明涉及污水生物处理【技术领域】，特别是涉及耐低温高盐酵母菌及其在污水 处理中应用的【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 随着经济的发展和社会的进步，人们越来越重视环境的保护和可持续发展，污水 的处理是其中不可忽视的问题之一。水质的恶化，生态环境的破坏，严重威胁人们的生存 环境，所以加强污水处理，对于保障我国水资源可持续发展具有重要的社会和经济意义。
[0003] 在我国广大的北方寒冷地区低温污水处理已成为水处理工程界和科学界的难点 问题。冬季城市污水的水温一般在10°c左右，少数地区降至4_6°C，传统生物处理技术中 微生物的代谢能力受低温高盐条件有所抑制，其活性、种群组成、细胞的增殖、产酶性能和 絮凝沉降性能等都受到低温的影响，有机物的去除效果差。因此筛选耐低温菌进行污水处 理，对于缓解严寒地区的环境污染、进一步降低寒冷地区污水处理项目建设的投资、节约 能源等方面起到巨大的推动作用。
[0004] 酵母菌污水处理技术是20世纪70年代从日本兴起的一种污水处理技术，比传 统的活性污泥法工艺具有一定特异性，效率是活性污泥法工艺的8?10倍。因其具有细 菌的特点，如以单细胞形式存在、生长繁殖快、能形成较好的絮凝体；又具有丝状真菌的特 点，如细胞较大、代谢旺盛，对C0D的去除速度较快，而成为近几年来开发出的一种新型污 水处理工艺，在处理负荷、污泥生成量、需氧量等方面具有很大的优势。酵母菌喜在含糖较 高的酸性水生环境中生长，利用其处理含较多糖类、淀粉、油脂和蛋白质等的生活污水和 含糖、油脂、味精、赖氨酸等的工业废水，都能取得很好的效果，表现出明显的优越性。因耐 低温酵母菌对环境温度的适应范围较宽，在低温条件下具有较好的生长特性，使其很适合 在低温污水处理中加以利用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于通过获得耐低温高盐酵母菌以及通过对获得菌发酵培养进行 有机废水的生物处理，以提高低温条件下生物处理的效率。
[0006] 本发明提供了耐低温高盐酵母菌Candida santamariae CGMCC No 2959和 Trichosporon akiyoshidainum CGMCC No 3150及其在低温高盐污水处理中的应用。
[0007] 本发明耐冷菌株都是从新疆低温环境中分离筛选，其中L231和L194的获得具有 低温高盐污水处理功能，经微生物学分类与鉴定，确定L231为Candida santamariae, L194 为Trichosporon akiyoshidainum,同时经验证获得菌种混合在有机废水生物处理中作用 突显，有效提高低温条件下有机废水生物处理效率，优于单独菌在有机废水生物处理中作 用。
[0008] 具体的，本发明提供的菌L231，其能够在有机废水生物处理中应用，提高在低温 高盐条件下生物处理的效率。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏 单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)。地址：北京市朝阳区大 屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：1〇〇1〇1，保藏日期是2009年3月18日，保藏号是 CGMCC No 2959。经微生物学鉴定为Candida santamariae。该耐低温酵母L231，该菌生 长温度范围〇_35°C，最适生长温度10_15°C ;该菌生长于在MYPG培养基为麦芽浸粉3g，酵 母膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂30g，H20 100〇1111，口!1自然，1211€灭菌2〇111；[11，菌落 呈白色，光滑，蜡状，圆形，边缘整齐；菌体细胞呈椭圆形，出芽生殖，能形成假菌丝；参照 Barnett等编著的《酵母菌：特征与鉴定》对L231菌株进行形态学，生理生化鉴定，再经 ITS1、ITS2序列测定与同源进化对比分析，最终确定为Candida santamariae L231。
[0009] 本发明提供的菌L194,其能够在有机废水生物处理中应用，提高在低温高盐条件 下生物处理的效率。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)。地址：北京市朝阳区大屯路，中 国科学院微生物研究所，邮编：1〇〇1〇1，保藏日期是2009年6月29日，保藏号是CGMCC No 3150。经微生物学鉴定为Trichosporon akiyoshidainum。该耐低温酵母菌L194,该菌生 长温度范围〇_35°C，最适生长温度15-20°C ;该菌生长于MYPG培养基为麦芽浸粉3g，酵母 膏3g，蛋白胨5g,葡萄糖10g，琼脂30g，H20 1000ml，pH自然，121/C灭菌20min，表面菌体细 胞芽殖，芽殖孢子卵形或椭圆形；有菌丝生成，有假菌丝和桶空型隔膜的有隔菌丝，产生分 生节孢子，节孢子矩形，两端圆滑；参照Barnett等编著的《酵母菌：特征与鉴定》对L194 菌株进行形态学，生理生化鉴定，再经ITSUITS2序列测定与同源进化对比分析，最终确定 为 Trichosporon akiyoshidainum。
[0010] L194和L231可采用斜面传代培养保存方式，或真空冷冻干燥方法，或液体石腊 包埋的方法进行长期的保藏。其中斜面培养方式适合于L194和L231的固体培养基进行 培养，最适培养温度分别为15_20°C、10_15°C、培养时间为3?5天，待菌落形成后置于4°C 下恒温保藏，3?6个月传代一次。利用真空干燥法或液体石腊包埋法进行菌种保藏，在低 温或常温下可保藏1年以上。
[0011] 长期保藏的菌种在使用之前首先在适宜于L194和L231菌株生长的培养基上进 行增殖培养，在本发明中选择MYGP培养基，pH自然，121°C灭菌20min，以平板划线或涂布 的方法拉接种于MYPG培养基表面，要最适培养温度下恒温培养3-5天，同时检测是否有杂 菌污染。将增殖培养的L194和L231菌株单独或混合接种于生活污水、工业废水中，本发 明优选富含有机质的生活污水或工业废水，在10-20°C下通培养，检测培养过程中C0D的 变化情况。
[0012] 通过实施本发明具体的
【发明内容】
，可以达到以下有益效果：
[0013] 本发明定向筛选到耐冷菌：Candida santamariae CGMCC No 2959和 Trichosporon akiyoshidainum CGMCC No 3150,经实验证明获得菌种混合在有机废水生 物处理中作用突显，有效提高低温条件下有机废水生物处理效率，优于单独菌在有机废水 生物处理中作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1显示为菌株L194和L231在10°C条件下生长曲线的测定；
【具体实施方式】
[0015] 下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述 的说明中，如无特别说明，则％皆指质量百分比。
[0016] 在以下实施例中，如无特别说明，所用的菌株培殖培养基为MYPG培养基，污水处 理效果实验使用如下模拟生活污水培养基。
[0017] 模拟生活污水：葡萄糖0. 17g，可溶性淀粉0. 16g，CH3C00Na 0. 233g，NH4C1 0.0255g，蛋白胨 0.158g，牛肉膏 0.04g，（NH4)2S04 0 . 0 2 84g，KH2P04 0 . 07g，Na2C030 . 06g，H20 1000ml，pH 5. 5-6. 0,以加水的方式调整COD为590mg/L左右。
[0018] 实施例一：菌株的筛选、鉴定
[0019] 通过从新疆低温环境中分离筛选，经微生物学分类与鉴定，确定L231为Candida santamariae,L194 为 Trichosporon akiyoshidainum。
[0020] 具体的，菌L231已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)。地址：北京市朝阳区大屯路，中国 科学院微生物研究所，邮编：1〇〇1〇1，保藏日期是2009年3月18日，保藏号是CGMCC No 2959。经微生物学鉴定为Candida santamariae。该耐低温酵母L231，该菌生长温度范围 〇-35°C，最适生长温度10_15°C ;该菌生长于在MYPG培养基为麦芽浸粉3g，酵母膏3g，蛋 白胨5g，葡萄糖10g，琼脂30g，H20 100〇1111，口!1自然，1211€灭菌2〇111；[11，菌落呈白色，光滑， 蜡状，圆形，边缘整齐；菌体细胞呈椭圆形，出芽生殖，能形成假菌丝；参照Barnett等编 著的《酵母菌：特征与鉴定》对L231菌株进行形态学，生理生化鉴定，再经ITSUITS2序列 测定与同源进化对比分析，最终确定为Candida santamariae L231。L231主要生理生化特 性如表1所示。
[0021] 表1 L231菌株主要生理生化特性
[0022] 测试项特征测试项特征测试项特征 Acetic Acid - Formic Acid - Propionic Acid - Succinic Acid - SuccinicAcid Mono- Methly - L-Aspartic Acid - L-Glutamic Acid - D-Proline - D-Gluconic Acid - Dextrin - Inulin - D-Cellobiose - Gentiobiose - Maltose - Maltotriose - D-Melezitose - D-Melibiose - Palatinose - D-Raffinose -Stachyose - Sucrose - D-Trehalose + Turanose - N-Acetyl-D-Glucosamine + a-D-Glucose + D-Galactose + D-Psicose + L-Sorbose - Salicin - D-Mannitol + D-Sorbitol + D-Arobitol w Xylitol Glycerol + TWEEN 80 - Fumaric Acid - L-Malic Acid - Bromosuccinic Acid - y-Aminobutyric Acid - a-Ketoglutaric Acid - 2-Ket〇-D_Gluconic Acid - D-Glucosamine -L-Rhamnose - a-Methyl-D-Glucoside - β -Methyl-D-Glucoside - Amygdalin - Arbutin - Maltitol - Adonitol - I-Erythritol - L-Arabinose - D-Arabinose - D-Ribose - D-Xylose - Succinc Acid Methyl Ester plus- D-Xylose - N-Acetyl-L-Glutamic Acid plus D-Xylose - Quinic Acid plus D- Xylose - D-Glucuronic Acid plus D-Xylose - Dextrin plus D-Xylose -a-D-Lactose plus D_ Xylose - D-Melibiose plus D-Xylose w D-Galactose plus D- Xylose w m-Inositol plus D-Xylose - 1，2-Propanediol plus D-Xylose - Acetoin plus D-Xylose -注：" + "为阳性反应；为阴性反应；"w"为弱 阳性，不确定结果
[0023] 菌L194已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微 生物研究所，邮编：1〇〇1〇1，保藏日期是2009年6月29日，保藏号是CGMCC No 3150。经 微生物学鉴定为Trichosporon akiyoshidainum。 该耐低温酵母菌L194,该菌生长温度 范围0-35°C，最适生长温度15-20°C ;该菌生长于MYPG培养基为麦芽浸粉3g，酵母膏3g， 蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂30g，H20 100〇11114!1自然，1211：灭菌2〇1^11，表面菌体细胞芽 殖，芽殖孢子卵形或椭圆形；有菌丝生成，有假菌丝和桶空型隔膜的有隔菌丝，产生分生 节孢子，节孢子矩形，两端圆滑；参照Barnett等编著的《酵母菌：特征与鉴定》对L194菌 株进行形态学，生理生化鉴定，再经ITS1、ITS2序列测定与同源进化对比分析，最终确定 为Trichosporon akiyoshidainum。L194主要生理生化特性如表2所不。
[0024] 表2 L194菌株主要生理生化特性
[0025] 测试项特征测试项特征测试项特征 Acetic Acid w Formic Acid w Propionic Acid w Succinic Acid w Succinic Acid Mono- Methly w L-Aspartic Acid + L-Glutamic Acid + D-Proline - D-Gluconic Acid + Dextrin + D-Cellobiose + Gentiobiose + Maltose + Maltotriose + D-Melezitose - D-Melibiose + Palatinose + D-Raffinose + Stachyose + Sucrose + D-Trehalose + N-Acetyl-D-Glucosamine + a-D-Glucos + D-Galactose + D-Psicose - L-Sorbose + Salicin + D-Mannitol w D-Sorbitol - D-Arobitol - Xylitol w Glycerol + Fumaric Acid w L-Malic Acid + Bromosuccinic Acid + y-Aminobutyric Acid + a-Ketoglutaric Acid + 2-Ket〇-D_Gluconic Acid + D-Glucosamine + L-Rhamnose + β -Methyl-D-Glucoside + Amygdalin - Arbutin - Maltitol + Sorbitol + Adonitol + D-Arabitol w I-Erythritol - Tween 80 + Turanose + Inulin - L-Arabinose + D-Arabinose w D-Ribose + Succinc Acid Methyl Ester plus-D-Xylose - N-Acetyl-L-Glutamic Acid plus D-Xylose w Quinic Acid plus D-Xylose w D-Glucuronic Acid plus + Dextrin plus D-Xylose + a-D-Lactose plus +D-Xylose D-XyloseD-Melibiose plus D_ Xylose + D-Galactose plus D_ Xylose + m-Inositol plus D_ Xylose +1，2-Propanediol plus D_ Xylose w Acetoin plus D-Xylose -注：" + "为阳性反应；为阴性反应；"w"为弱阳性，不确定结 果
[0026] 通过从新疆低温环境中分离筛选，并经微生物学分类与鉴定，确定L231为 Candida santamariae, L194 为 Trichosporon akiyoshidainum,其中 L231 和 L194 的获得 具有低温污水处理功能，同时经验证获得菌种混合在有机废水生物处理中作用突显，有效 提高低温条件下有机废水生物处理效率，优于单独菌在有机废水生物处理中作用。
[0027] 实施例二：酵母菌株L194和L231生长曲线的测定
[0028] 将酵母菌株L194和L231分别种于25ml MYPG液体培养基中，10°C、180rpm培养 24h后，再分别取0. lml的菌悬液接种于25ml新鲜的完全液体培养基中，相同条件下培养， 间隔一定时间取样测定菌体的吸光值（〇D_)，绘制生长曲线。结果参见附图1所示，表明 酵母菌株L194和L231在10°C下可获得良好的生长。
[0029] 实施例三：温度对L194和L231菌株处理污水效果的影响
[0030] 将酵母菌株L194和L231分别按实施例1中所示增殖培养方法进行增殖培养，以 10%接种量分别接种于模拟生活污水中，将接种后的模拟污水分别置于10 °C、20°C、30°C 下恒温培养，180rpm，检测模拟生活污水24小时内COD的变化情况，
[0031] 结果表明，菌株L194和L231在测定的10°C、20°C、3(rC下均可保持较好的C0D去 除效果，低温条件下的处理效果较为显著；其中L194菌株在20°C左右对C0D去除效果最 好，L231在10°C左右对C0D去除效果最好，在低温条件下处理效果优势显著。
[0032] 实施例四：初始C0D对L194和L231处理污水效果的影响
[0033] 按实施例二中所示的方法，对菌株L194和L231进行增殖培养，并接种于起始C0D 分别为 400mg/L、500mg/L、600mg/L、800mg/L、900mg/L、1100mg/L 的模拟生活污水中，10°C、 180rpm下恒温培养，检测培养过程中24小时内COD的变化情况，
[0034] 结果表明，初始C0D值对菌株处理效果具有较强的影响作用，在400-1100 mg/L范 围内，两菌株均可保持较好的处理效果；在起始C0D值在400-800mg/L范围内，随起始C0D 值的增加，菌株的处理效果逐步提高；在起始COD值大于800mg/L以后，随COD值的提高， 处理效果有所下降；说明两株菌适宜于在低温条件下进行有机废水的生物处治。
[0035] 实施例五：L194和L231接种量对污水处理效果的影响
[0036] 按实施例二中所示的方法，分别对菌株L194和L231进行增殖培养24小时，将所 获得的培养物经4500rpm离心收集后，以无菌生理盐水重悬浮制成0D600值为0. 8的菌悬 液，分别以5%、10%、15%和20%的接种量接种模拟生活污水，101：、180印111下恒温培养， 测定24小时内C0D的变化情况。结果表明，接种量对这两株菌处理模拟生活污水的效果有 所影响。在接种量5-20 %范围内，L194菌株随接种量的增加处理效率有所提高，而L231菌 株处理效率在接种量大于10%后处理效率有所下降。
[0037] 实施例六：L194和L231共同作用污水的处理效果
[0038] 按实施例二中所示的方法，分别对菌株L194和L231进行增殖培养24小时，将 所得的培养物按1 : 1的比例制成混菌液，以10%的接种量接种模拟生活污水中，l〇°C、 180rpm下恒温培养，测定24小时内模拟生活污水中COD的变化情况。结果表明，与等接种 量的单一菌进行比较，混菌的C0D降解效率优于单菌，其降解效率比单菌提高15% -35%， 且在10-20°C有较高的C0D转化效率，低温处理效果明显。
【权利要求】
1. 一种在进行有机废水低温污水处理中的耐低温酵母菌Candida santamariae CGMCC No 2959 和 Trichosporon akiyoshidainum CGMCC No 3150。
2. 如权利要求1所述的耐低温酵母菌Candida santamariae CGMCC No 2959。
3. 如权利要求1所述的耐低温酵母菌Trichosporon akiyoshidainum CGMCC No 3150。
4. 一种利用权利要求1所述的耐低温酵母菌：Candida santamariae CGMCC No 2959 和Trichosporon akiyoshidainum CGMCC No 3150在进行有机废水高盐低温污水处理中 的应用。
5. -种利用权利要求2所述的耐低温酵母菌Candida santamariae CGMCC No 2959在 进行有机废水低温污水处理中的应用。
6. -种利用权利要求3所述的耐低温高盐酵母菌Trichosporon akiyoshidainum CGMCC No 3150在进行有机废水低温污水处理中的应用。
【文档编号】C12R1/72GK104099257SQ201310116180
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月3日 优先权日:2013年4月3日
【发明者】王余标, 阮安徽, 叶海斌, 朱文杰, 蔡雪梅, 关彦丰, 林飞, 张会展, 林泽民, 张伟宝, 蟠龙, 邓永金, 孙元帅 申请人:王余标