专利名称：金针菇产漆酶的发酵条件的制作方法
技术领域：
本发明所属微生物发酵技术领域。本发明涉及金针菇产漆酶的发酵条件研究，适合工业化应用。
背景技术：
漆酶(laccase,ECl.10.3.2)是一种含铜多酌.氧化酶(polyphenol oxidases,PPO)，与植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝铜氧化酶家族，在结构和功能上存在许多相似之处。在自然界中，漆酶分布于多种植物、真菌体内，以及少数昆虫和细菌中。它可以催化氧化酚类化合物脱去羟基上的电子或质子，形成自由基，导致酚类及木素类化合物裂解，同时分子氧被还原为水。1883年，日本学者Yoshida首次从日本紫胶漆树(Rhus verniciflua)漆液中发现一种可催化漆固化过程的蛋白质；1894年Bertrand将其命名为漆酶。随后人们发现一些高等真菌也能分泌漆酶，漆酶广泛存在于担子菌亚门(Basidiomycotina)的多孔菌(Polyporus)、子囊菌亚门(Ascomycotina)的脉孢菌(Neurospora)和柄孢壳菌(Podospora)及半知菌亚门(Deuteromycotina)的曲霉菌(Aspergillus)等，其中最重要的生产者是担子菌中的白腐菌。近年来研 究表明，漆酶具有广泛的作用底物。由于它能降解木质素，可与有毒的酚类物质作用，使苯氧基类除草剂、石油工业废水去除毒性，还可以氧化降解一些有机磷毒物，以及在微生物菌体形态形成和植物病原等方面的功能，使之在食品工业、环境保护、造纸工业及其它领域具有很大的研究价值和应用潜力，具有广阔的开发前景。金针菇学名毛柄金钱菌，俗称构菌、朴菇、冬菇等，属伞菌目口蘑科金针菇属。金针菇在自然界广为分布，且具有价格低廉、易于培养的特点。作为一种常见的食用白腐菌已被证实可以产生漆酶。许多微生物均可以产生漆酶，鉴于白腐菌比其它微生物能更快和更广泛降解木质纤维素，而且其所产漆酶为胞外酶，便于酶的分离和提纯，因此具有广泛的工业应用前景。然而当前有关金针菇产漆酶的研究较少，特别是在优化培养方面。关于发酵条件虽然也有人做了研究(王洪波，2009 ;饶玉鹏，2007 ;等)，但发酵液所得酶活都不很高，限制了该酶的生产。由于漆酶的活性受到培养条件等诸多因素的制约，菌株分泌漆酶受到多种因子的影响，因此本发明根据此原因，对一株金针菇(金杂19)产漆酶条件和培养基进行了优化，探究金针菇发酵培养的培养基和最适宜条件，为漆酶的工业化生产和应用奠积丰富资料。
发明内容
1.本发明涉及金针菇产漆酶条件的优化，其特征在金针菇产漆酶条件的优化方法，包括以下过程:步骤(一):将保存的金针菇原种转接于PDA斜面培养基复活，28°C恒温培养6 8d天，4°C保存；
步骤(二):取步骤(一)保存的菌种接到PDA平板上，28°C恒温培养6 8天，至菌丝长满平板；步骤(三):步骤(二)培养的菌丝用打孔器制成直径10毫米的菌片，接种4片菌片到装有50毫升发酵培养基(内含60微摩尔/升铜离子和10微摩尔/升二甲氧基苯甲酸)的250毫升三角瓶中，28°C，180r/min摇瓶培养7天；步骤(四):步骤(三)发酵后的发酵液在4000r/min离心15分钟，上清液即为粗酶液；步骤(五):步骤(四)中的粗酶液以邻联甲苯胺为底物，在醋酸缓冲体系下测定其酶活，以每分钟光密度增加0.01为一个酶活力单位(U/mL)。2.根据本发明所述，发酵的最佳培养时间是7天，发酵培养基的pH是5.5，装液量是50毫升/250毫升三角瓶，培养温度是28°C，摇床速度180r/min。3.根据本发明所述，金针菇金杂9产漆酶的发酵培养基为(克/升):葡萄糖20，尿素 2，KH2PO 3.0, MgSO 1.5，ZnSO 0.05，MnSO 0.05。4.根据本发明所述，金针菇金杂9产漆酶的诱导物为二价铜离子和二甲氧基苯甲酸，最佳加入量分别为60微摩尔/升、10微摩尔/升。
具体实施方式
本发明所述的涉及金针菇金杂9产漆酶的发酵条件，包括以下实施例，下面的实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1:金针菇金杂9产漆酶发酵条件单因子实验I材料与方法1.1 材料1.1.1菌种金针菇金杂19号购自山东省农科院农业资源研究所，菌丝在PDA培养基上4°C条件下保存备用。1.1.2试剂邻联甲苯胺(上海化学试剂总厂分析纯)；其他分析试剂均为国产分析纯。1.1.3仪器722E型可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)。1.1.4 培养基PDA培养基(g/L):马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，？!1值自然，1211:灭菌201^11。液体培养基(g/L):马铃薯200，葡萄糖20，酵母膏5.0，KH2P043.0，MgS041.5，ZnSO40.05，MnSO40.05，pH 自然，121。。灭菌 20min。1.2 方法1.2.1菌种活化将保存的菌种转接于PDA斜面培养基上，28°C恒温培养7 8d，置4°C冰箱中保存备用，一个月左右活化一次。1.2.2培养方法将保存的菌种接到PDA平板上，28°C恒温培养8 10d，待菌丝长满平板，用打孔器制成直径IOmm的菌塞，接种4片菌塞到装有70mL液体培养基的250mL三角瓶中，28°C，180r/min摇瓶培养。
1.2.3粗酶液制备离心机4000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。1.2.4酶活测定0.2mol/LpH4.6醋酸缓冲液3.5ml，加入3.36mol/L邻联甲苯胺0.5mL，再加入适当稀释的粗酶液0.5mL, 25°C保温5min后，立即于722E可见分光光度计测A595nm处光密度值(0D值)，酶活力以样品与底物反应5min后光密度的改变值表示，以每分钟光密度增加0.01为一个酶活力单位(U/mL)。2.结果与讨论2.1分泌漆酶的时间将培养8d的平板菌种接种至液体发酵培养基中，28°C，180r/min摇瓶培养，从第3d起，每24h取样测定漆酶活力，结果发现:随发酵时间的延长，酶活逐渐升高，到第7d酶活最高(4-8d的酶活分别为:23，28，30，36，30U/mL)，所以选择7d作为最佳产酶时间。2.2碳源对产漆酶的影响分别以蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、柠檬酸、羧甲基纤维素钠作为碳源代替液体发酵培养基中的葡萄糖，28°C, 180r/min摇床恒温培养7d后测定漆酶活性,结果发现菌株对柠檬酸、蔗糖的利用能力较弱，产漆酶活性较低。对葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、羧甲基纤维素钠的利用能力较强(分别为:101，79，60，69U/mL)，以葡萄糖为碳源时漆酶活性最高。2.3氮源对产漆酶的影响分别用牛肉膏、尿素、蛋白胨、硫酸铵、酒石酸铵代替酵母膏作为液态发酵培养基中的氮源进行发酵培养，7d后测定漆酶`酶活，结果发现以牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵作为氮源时，菌株产漆酶酶活较低。以尿素、酵母膏、酒石酸铵作为氮源，产漆酶活性较好(分别为:100，59，71U/mL)，且以尿素为氮源活性最好。2.4培养基初始pH值对金针菇产漆酶的影响用醋酸缓冲液把液态发酵培养基的初始PH值分别调为4.0,4.5,5.0,5.5,6.0、6.5,7.0，摇瓶培养7d后测定漆酶酶活，结果发现，在pH5.0-6.0的范围内金针菇产漆酶的活性相对较高(分别为79，98，71U/mL)，以pH5.5时漆酶活力最高，2.5装液量对产漆酶的影响在250ml三角瓶中分别装入30_90ml液体培养基，28°C，180r/min摇床恒温培养7d后测定漆酶活性。结果分别为:60，102，70，30U/mL，在装液量为50mL时，金针菇产漆酶酶活达到最高，，达102U/mL。这可能与菌株自身生长和产生漆酶需要消耗大量的氧有关。实施例2正交试验根据实例I单因子实验，选取对酶分泌量最大的几个因素:碳氮源、装液量和pH进行正交实验。采用L9 (34)正交试验因素水平表进行正交试验。根据实验设计表I进行9组实验，正交试验结果方差分析见表2。表IL9 (34)正交试验设计Tab.1Analysis of the L9(34)orthogonal array design
权利要求
1.本发明涉及金针菇产漆酶条件的优化，其特征在金针菇产漆酶条件的优化方法，包括以下过程: 步骤(一):将保存的金针菇原种转接于PDA斜面培养基复活，28°C恒温培养6 8d天，4°C保存； 步骤(二):取步骤(一)保存的菌种接到PDA平板上，28°C恒温培养6 8天，至菌丝长满平板； 步骤(三):步骤(二)培养的菌丝用打孔器制成直径10毫米的菌片，接种4片菌片到装有50毫升发酵培养基(内含60微摩尔/升铜离子和10微摩尔/升二甲氧基苯甲酸)的250毫升三角瓶中，28°C，180r/min摇瓶培养7天； 步骤(四):步骤(三)发酵后的发酵液在4000r/min离心15分钟，上清液即为粗酶液； 步骤(五):步骤(四)中的粗酶液以邻联甲苯胺为底物，在醋酸缓冲体系下测定其酶活，以每分钟光密度增加0.01为一个酶活力单位(U/mL)。
2.根据本发明所述1，发酵的最佳培养时间是7天，发酵培养基的pH是5.5，装液量是50毫升/250毫升三角瓶，培养温度是28°C，摇床速度180r/min。
3.根据本发明所述1，金针菇金杂9产漆酶的发酵培养基为(克/升):葡萄糖20，尿素 2，KH2PO 3.0, MgSO 1.5，ZnSO 0.05，MnSO 0.05。
4.根据本发明所述1，金 针菇金杂9产漆酶的诱导物为二价铜离子和二甲氧基苯甲酸，最佳加入量分别为60微摩尔/升、10微摩尔/升。
全文摘要
本发明所属微生物发酵技术领域。本发明涉及金针菇金杂9产漆酶的发酵条件。将保存的金针菇金杂9原种转接于PDA斜面培养基，28℃恒温培养7天，再转接到PDA平板上，28℃恒温培养7天，至菌丝长满平板；培养的菌丝用打孔器制成直径10毫米的菌片，接种4片菌片到装有50毫升发酵培养基的250毫升三角瓶中进行发酵培养。培养条件是温度28℃，180r/min摇瓶培养7天，发酵培养基的pH是5.5；金针菇金杂9产漆酶的发酵培养基为(克/升)葡萄糖20，尿素2，KH2PO3.0，MgSO 1.5，ZnSO 0.05，MnSO 0.05。发酵培养基内含60微摩尔/升铜离子和10微摩尔/升二甲氧基苯甲酸。
文档编号C12N9/02GK103205402SQ20131012847
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月4日 优先权日2013年4月4日
发明者朱启忠 申请人:山东大学(威海)