用于分离核酸的组合物及方法
【专利摘要】本发明提供用于分离核酸之组合物，包括至少一种卤烃化合物、至少一种盐类以及至少一种表面活性物质，其中，该卤烃化合物的含量为该组合物总重量的1～70重量%。
【专利说明】用于分离核酸的组合物及方法
【技术领域】
[0001]本发明关于快速分离、纯化生物样本中之核酸的组合物及方法。原理为将核酸与蛋白质分离，增加纯化产物的纯度。
【背景技术】
[0002]习知用于分离核酸的市售试剂,例如Qiagen、Ambion等,存在有磨取组织及纯化核酸的时间过长以 及因分管操作而可能发生污染的问题。而且，对于新鲜或冷冻样本中的核酸纯化，目前市售的试剂普遍无法分离出高纯度的核酸，并且存在盐类残留而造成后续核酸分析受阻的困难。目前市售的试剂亦局限于对特定的生物样本进行操作。
[0003]因此，为了降低操作中的污染风险、提高分离的核酸纯度、以及减少操作步骤及时间，有发展新颖方法及试剂的需求。
【发明内容】
[0004]全氟化烃习知系作为电子产品的冷却液，被广泛地应用于电子产业。然本发明人等在研发新颖方法及分离核酸之组合物之时，了解到全氟化烃可分离蛋白质的干扰，而且在高温及低温环境中具有化学稳定性且不残留于纯化过程中，因此可提高分离的核酸纯度，并达到简化操作步骤等超越习知方法的优越性。
[0005]本发明一实施形态提供一种用于分离核酸的组合物，包括:至少一种卤烃化合物、至少一种盐类以及至少一种表面活性物质,其中，该卤烃化合物的含量为该组合物总重
量的I~70重量％。
[0006]本发明另一实施形态提供一种分离核酸的方法，包括下列步骤:于一生物样本中添加含有至少一种齒烃化合物、至少一种盐类以及至少一种表面活性物质之组合物，形成一均质溶液；以及分离该均质溶液中的核酸；其中该卤烃化合物的含量为该组合物总重量
的I~70重量％。
[0007]本发明所提供之组合物有提升纯化效果、减少操作步骤、缩短纯化时间、样本种类广泛及无害于人体及环境等之优于习知技术的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]第IA图为显示一般习知核酸分离流程之示意图。
[0009]第IB图为显示本发明一实施例之操作流程之示意图。
[0010]第2图为显示本发明一实施例之萃取组织中RNA的电泳图，图中包括与使用市售试剂(Qiagen)者的比较。
[0011]第3图为显示本发明一实施例之萃取多种组织中RNA的电泳图。
[0012]第4图为显示本发明一实施例之以离心纯化方法萃取多种组织中RNA的RNA总量之柱状图。
[0013]第5图为显示本发明一实施例之以磁性纯化方法萃取多种组织中RNA的RNA总量之柱状图。
[0014]第6图为显示本发明一实施例之以离心纯化方法萃取多种组织中RNA的RIN值之柱状图。
[0015]第7图为显示本发明一实施例之以磁性纯化方法萃取多种组织中RNA的RIN值之柱状图。
【具体实施方式】
[0016]本发明之具体实施详细说明如下，然而以下的实施例仅用于进一步揭露本发明之技术内容，不应藉以限制本发明的发明范畴。
[0017]习知核酸分离的步骤，参见第IA图，需经过样本的均质化(homogenize)、胞解(lysis)、核酸分子连结(binding)于分离装置、洗涤、以及将连结于分离装置的核酸分子冲提(洗脱elution)等的各步骤。
[0018]然而，习知的核酸分离操作流程需分管进行，容易使样本受到污染，操作时间也因此增长。再者，必须使用酚、氯仿等的有毒溶剂，对操作者及环境并不友善。其次，习知的核酸分离方法局限于单一类型样本且样本量约10~40mg始可得到较佳的纯化结果，不利于多种不同样本类型及微量或大量的样本体积之操作。
[0019]然而，根据本发明所提供之组合物，可以单一步骤、单一管操作取代习知核酸分离步骤中所需的均质化、胞解及核酸分子连结于分离装置之分管操作的步骤(参见第IB图)，藉此可大幅降低样本受到污染的机 会，并且缩短操作时间及步骤。再者，根据本发明之组合物，不含有酚、氯仿等的有毒溶剂，可减少操作过程中对环境及操作者的毒害。而且，本发明之组合物，如后述之具体实施例，对于各样本类型，例如各类组织，皆可获得优异的核酸纯化效果，并且可操作的样本体积扩大至约10μ g~约IOOmg的范围,可有利于广泛的生物样本分析。因此，相较于习知核酸分离方法，本发明提供纯化效果佳、减少操作步骤、缩短纯化时间、样本种类广泛及无害于人体及环境之组合物及方法，在生物【技术领域】上具有贡献。
[0020]更具体地说，本发明一实施形态所提供之用于分离核酸的组合物，包括至少一种卤烃化合物、至少一种盐类以及至少一种表面活性物质。
[0021 ] 本发明所述之齒烃化合物可包括氟烃化合物、氯烃化合物、溴烃化合物或碘烃化合物等，其中以全氟化烃为佳。全氟化烃习知系作为电子产品的冷却液，被广泛地应用于电子产业。然本发明人等在研发分离核酸之组合物之时，了解到全氟化烃可分离蛋白质的干扰，而且在高温及低温环境中具有化学稳定性且不残留于纯化过程中，因此可提高分离的核酸纯度。
[0022]本发明所使用之全氟化烃可包括碳数I~12的全氟烷类,包括四氟甲烷、六氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷或全氟辛烷等；以及碳数3~12的全氟环烷类，例如全氟环丙烷、全氟环丁烷、全氟环戊烷、全氟环己烷、全氟环庚烷或全氟环辛烧等。
[0023]本发明所使用之盐类可包括碱金属盐、碱土金属盐、胍盐、或这些的组合。此述之碱金属盐可包括锂盐、钠盐或钾盐等，例如氯化锂(LiCl)、氯化钠(NaCl)或氯化钾(KCl)等。此述之碱土金属盐可包括镁盐或钙盐等，例如氯化镁或碳酸钙等。此述之胍盐可包括氯化胍(GuCl)、硫化氰胍(GuSCN)等。[0024]本发明所使用之表面活性物质可包括适用于核酸分离的表面活性物质，没有特另1J限制，具体例如聚山梨糖醇酯(polysorbate)，如Tween20、Tween80,或聚乙二醇-对(I, I, 3, 3-四甲基丁基)苯基醚(polyethylene glycol4- (I, I, 3, 3-tetramethylbutyl) -phenyl ether),如 Triton X-100,或其组合等。
[0025]本发明所述之用于分离核酸的组合物中，该卤烃化合物的含量较佳为该组合物总重量的I~70重量％，更佳为10~60重量％，再更佳为20~50重量％。本发明所述之表面活性物质的含量，相对于该组合物的总重量，较佳为0.01~10重量％，更佳为0.1~8重量％，再更佳为I~5重量％。本发明所述之盐类的含量，相对于该组合物的总重量，较佳为5~80重量％，更佳为20~70重量％，再更佳为30~60重量％。本案一实施例中，可使用氯化锂(LiCl)与硫化氰胍(GuSCN)的混合物作为该组合物中的盐类，其中相对于盐类100重量％而言，氯化锂(LiCl)较佳为14.83~63.58重量％，硫化氰胍(GuSCN)较佳为
11.816 ~70.896 重量 ％。。
[0026]为了便于分离核酸，本发明所述之用于分离核酸的组合物可更包括磁性粒子。此述的磁性粒子可为适用于分子生物领域中的磁性粒子，没有特别限定，例如氧化铁纳米粒子、超顺磁氧化铁纳米粒子(Ultra-small Super Paramagnetic Iron Oxide ；USP10)等。
[0027]本发明另一实施形态提供一种分离核酸的方法，包括下列步骤:
[0028]于一生物样本中添加含有至少一种卤烃化合物、至少一种盐类以及至少一种表面活性物质之组合物，形成一均质溶液；以及分离该均质溶液中的核酸。
[0029]此述之卤烃化合物、盐类及表面活性物质与上述定义相同。如上所述，根据本发明之分离核酸的方法，可提供 纯化效果佳、减少操作步骤、缩短纯化时间、样本种类广泛及无害于人体及环境等之优于习知技术的效果。
[0030]根据本发明之分离核酸的方法，可广泛分析各类型的生物样本，包括细胞、组织、血液、尿液、羊膜液、淋巴液、组织液、或这些的组合。
[0031 ] 本发明之分离核酸的方法中，从该均质溶液分离核酸之步骤，可采用离心、层析法等方法分离，也可进一步使用磁性粒子进行核酸的分离。更具体地说，本发明所述之含有至少一种齒烃化合物、至少一种盐类及至少一种表面活性物质之组合物，可进一步地包含磁性粒子。藉由混合胞解的生物样本与含有磁性粒子的本发明组合物，可使得生物样本中的核酸分子与磁性粒子连结。再透过磁性收集装置，例如磁台，收集所有磁性粒子，经由特定溶液冲提(elute)磁性粒子，可获得连结于磁性粒子表面的核酸分子，藉此获得分离、纯化的核酸。
[0032]此述的磁性粒子可包含适用于分子生物领域中的磁性粒子，没有特别限定，例如氧化铁纳米粒子、超顺磁氧化铁纳米粒子(Ultra-small Super Paramagnetic Iron Oxide ；USP10)等。磁性分离装置及冲提的条件可根据所选用的磁性粒子特性、欲分离的核酸分子特性等条件而适当选用。可使用的磁性分离装置可例如磁盘(magnetic plate)、磁环(ringmagnet)、或类似的磁性装置等。冲提的溶液可包括市售之冲提缓冲液(elution buffer),例如磷酸二氢钠(NaH2P03)、尿素(urea)、硫化尿素(thiourea)、盐酸胍(GuCl)、三(轻甲基)胺甲烷(Tris Cl)、或其组合等。
[0033]为了提高核酸的纯度，本发明所提供之分离核酸的方法可于在分离均质溶液中的核酸之前，更包括一洗涤步骤，分离均质溶液中的蛋白杂质。此述洗涤步骤可使用市售之洗漆缓冲液(washing buffer),例如包括去离子水(ddH20)、乙醇、或其组合等。
[0034]本发明所述之磁性粒子、冲提缓冲液及洗涤缓冲液也可依欲处理的生物样本选用合适的市售磁性粒子套组，以提高纯化效率。
[0035]根据本发明之分离核酸的组合物及方法，可简化从生物样本中分离包括例如单链核酸、双链核酸、核酸片段或其组合之核酸分子，并对广范围的样本型态及样本体积皆可达成优良的核酸分离、纯化效果。
[0036][实施例1]
[0037]1.利用本案组合物进行组织核酸纯化
[0038](I)组合物(I)之制备
[0039]取500 μ I 的全氟己烷(FluorinertTM)、190.75 μ I 的 4.5MLiCl/5MGuCl 及 I μ I的TritonX-1OO均匀混合,形成组合物(I),作为下述使用之胞解缓冲液(lysis buffer)。
[0040](2)组织核酸纯化
[0041]取小鼠肝组织Img加入含有上述组合物(I)之胞解缓冲液的研磨管中研磨约5分钟。以1000 μ I缓冲液(300 μ I的3.5Μ LiCl与700 μ I的70%的乙醇的混合液)清洗10次后，加入 20 μ I 的磁珠(Ambion Magmax total RNA pure beads)后均匀混合。
[0042]将此溶液以磁台(Ambion)分离出结合RNA的磁珠，以焦碳酸乙二酯(DEPC)水溶液、冲提速度20次/分钟冲提磁珠，获得纯化的生物样本(称为ITRI样本)，上述以组合物(I)进行纯化的时间约20分钟。
[0043]2.利用市售商品进行组织核酸纯化
[0044]另一方面,于一试管内加入市售Qiagen R!N_Aeasy_缓冲液Img以及RNA稳定液600 μ 1，于震荡器(Vortex)震荡约20~40秒。
[0045]于该试管中加入Img小鼠肝组织，继续震荡10分钟。之后加入市售QiagenRNAeasy? 的胞解缓冲液(lysate buffer) 500 μ I，均匀混合后，将 Qiagen RNAeasy?
的胞解缓冲液分批放入离心管柱内，全速离心5分钟。离心后之Qiagen RNAeasy?的胞解缓冲液移至新的试管，加入350 μ I的市售RLT缓冲液，震荡后以300g离心5分钟以打破细胞。试管内的溶液经抽吸20次,重复上述胞解步骤5次。
[0046]之后将经过上述处理的Qiagen RNAeasy?胞解缓冲液更换至新的试管，全速离心2分钟，去除上清液。之后再震荡(vortex) 30秒，加入700 μ I的70%乙醇清洗，移至旋转柱(spin column)离心。之后，重复上述步骤2次。再加入700 μ I的市售RWl缓冲液，全速离心2分钟。之后加入500 μ I的市售RPE缓冲液，移至旋转柱(spin column)离心。之后，重复上述步骤2次。最后更换下管以去除上清液，重复离心动作。再加入50μ1的RNA DEPC水，获得Qiagen纯化的生物样本。上述以市售商品Qiagen RANassay?进行纯化的时间约120分钟。
[0047]3.分析纯化的RNA样本
[0048]之后，将上述ITRI样本、Qiagen纯化的生物样本溶液进行75V、TAE胶的电泳，获得第2图所示之电泳图，其中第L栏表示样品条带(ladder)，第I栏表示上述所得的ITRI样本，第2栏表示上述所得的Qiagen纯化的生物样本。
[0049]以RNA检测仪(Nanodrop/Tecane)全光谱扫描检测ITRI样本、Qiagen纯化的生物样本溶液中的RNA总量以及在波长0D260、0D280及0D230的吸光度，计算0D260/0D280、0D260/0D230的比值，结果如下表1。
[0050][表 I]
【权利要求】
1.一种用于分离核酸的组合物，包括: 至少一种卤烃化合物、至少一种盐类以及至少一种表面活性物质， 其中，该卤烃化合物的含量为该组合物总重量的I~70重量％。
2.权利要求1所述之用于分离核酸的组合物，其中该卤烃化合物包括全氟化烃。
3.权利要求2所述之用于分离核酸的组合物，其中该全氟化烃包括四氟甲烷、六氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷或全氟辛烷。
4.权利要求1所述之用于分离核酸的组合物，其中该盐类包括碱金属盐、碱土金属盐、胍盐、或其组合。
5.权利要求1所述之用于分离核酸的组合物，其中该盐类的含量为该组合物总重量的5~80重量％。
6.权利要求1所述之用于分离核酸的组合物，其中该表面活性物质包括聚山梨糖醇酯、聚乙二醇对(1，1，3，3_四甲基丁基)苯基醚、或其组合。
7.权利要求1所述之用于分离核酸的组合物，其中该表面活性物质的含量为该组合物总重量的0.01~10重量％。
8.权利要求1所述之用于分离核酸的组合物，其中该组合物可更包括磁性粒子。
9.权利要求1所述之用于分离核酸的组合物，其中，该磁性粒子包括氧化铁纳米粒子、超顺磁氧化铁纳米粒子、或其组合。、
10.权利要求1所述之用于分离核酸的组合物，其中该核酸包括单链核酸、双链核酸、核酸片段、或其组合。
11.一种分离核酸的方法，包括下列步骤: 于一生物样本中添加含有至少一种卤烃化合物(halocarbon)、至少一种盐类以及至少一种表面活性物质之组合物，形成一均质溶液；以及分离该均质溶液中的核酸； 其中该卤烃化合物的含量为该组合物总重量的I~70重量％。
12.权利要求11所述之分离核酸的方法，其中该卤烃化合物包括全氟化烃。
13.权利要求12所述之分离核酸的方法，其中该全氟化烃包括四氟甲烷、六氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷或全氟辛烷。
14.权利要求13所述之分离核酸的方法，其中该盐类包括碱金属盐、碱土金属盐、胍盐、或其组合。
15.权利要求13所述之分离核酸的方法，其中该盐类的含量为该组合物总重量的5~80重量％。
16.权利要求11所述之分离核酸的方法，其中该表面活性物质包括聚山梨糖醇酯、聚乙二醇对(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基醚、或其组合。
17.权利要求11所述之分离核酸的方法，其中该表面活性物质的含量为该组合物总重量的0.01~10重量％。
18.权利要求11所述之分离核酸的方法，其中该生物样本包括细胞、组织、血液、血清、尿液、羊膜液、淋巴液、唾液、粪便、或其组合。
19.权利要求11所述之分离核酸的方法，其中该核酸包括单链核酸、双链核酸、核酸片段、或其组合。
20.权利要求11所述之分离核酸的方法，其中该分离包括离心方法或层析法。
21.权利要求11所述之分离核酸的方法，其中，该组合物更包含磁性粒子。
22.权利要求21所述之分离核酸的方法，其中，该磁性粒子包括氧化铁纳米粒子、超顺磁氧化铁纳米粒子、或其组合。
23.权利要求22所述之分离核酸的方法，其中该分离包括分离该磁性粒子及冲提连结于该磁性粒子之核酸。
24.权利要求11所述之 分离核酸的方法，更包括一洗涤步骤，于分离步骤之前，以分离蛋白质。
【文档编号】C12N15/10GK103571824SQ201310170889
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年5月10日 优先权日:2012年8月9日
【发明者】陈奕璋, 蔡秀娟 申请人:财团法人工业技术研究院