用于治疗hbv感染及相关疾病的多肽及抗体的制作方法【专利摘要】本发明涉及可用于治疗乙型肝炎病毒感染的表位肽（或其变体），包含此类表位肽（或其变体）以及载体蛋白的重组蛋白，以及此类表位肽（或其变体）和重组蛋白的用途。本发明还涉及针对此类表位肽的抗体，产生所述抗体的细胞株，以及它们的用途。本发明还涉及可用于治疗或减轻乙型肝炎病毒感染相关的一种或多种症状的疫苗或药物组合物，它们分别包含本发明的重组蛋白或抗体。【专利说明】用于治疗HBV感染及相关疾病的多肽及抗体【
技术领域：
】[0001]本发明涉及分子病毒学和免疫学领域，特别是乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)感染治疗领域。具体而言，本发明涉及可用于治疗乙型肝炎病毒感染的表位肽(或其变体)，包含此类表位肽(或其变体)以及载体蛋白的重组蛋白，以及此类表位肽(或其变体)和重组蛋白的用途。本发明还涉及针对此类表位肽的抗体，产生所述抗体的细胞株，以及它们的用途。本发明还涉及可用于治疗或减轻乙型肝炎病毒感染相关的一种或多种症状的疫苗或药物组合物，它们分别包含本发明的重组蛋白或抗体。【
背景技术：
】[0002]乙型肝炎病毒感染，尤其是慢性HBV感染是全球最为重要的公共卫生问题之一(DienstagJL.HepatitisBvirusinfection.NEnglJMed2008Oct2;359(14):1486-1500)。慢性HBV感染可导致慢性乙型病毒性肝炎(ChronichepatitisB，CHB)、肝硬化(Livercirrhosis,LC)和原发性肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)等一系列肝脏疾病(LiawYF,ChuCM.HepatitisBvirusinfection.Lancet2009Febl4;373(9663):582-592)。据报道，目前全球约有20亿人曾经感染过HBV，现约有3.5亿的慢性乙型肝炎病毒感染者，这些感染者最终死于HBV感染相关肝脏疾病的风险可达15%-25%，全球每年超过100万人死于此类疾病(DienstagJL.，同上；和LiawYF等，同上)o[0003]当前针对慢性HBV感染的治疗药物主要可分为干扰素类(Interferon,IFNs)和核苷/核苷酸类似物(nucleosideornucleotide,NAs)(DienstagJL.,同上；KwonH，LokAS.HepatitisBtherapy.NatRevGastroenterolHepatol2011May;8(5):275-284;和LiawYF等，同上)。前者包括普通干扰素(IFN)和聚乙二醇干扰素(Peg-1nterfeixm，Peg-1FN,又称为长效干扰素)，主要通过整体增强患者免疫能力来达到抑制HBV和治疗CHB的效果；后者主要包括拉米夫定(lamivudine，LMV)、阿德福韦酯(adefovirdipivoxil,ADV)、恩替卡韦(Entecavir,ETV)、替比夫定(Telbivudine,LdT)、替诺福韦(Tenofovir)等5种，主要通过直接抑制HBV的聚合酶活性来抑制HBV复制。对于HBV感染者(例如CHB患者)来说，上述药物的单独或联合治疗，已能较为有效地抑制体内病毒复制，大幅降低HBVDNA水平；特别地，52周或延长的此类治疗后，患者体内HBVDNA水平低于检测下限(病毒学应答)的应答率可达40-80%(KwonH等，同上)。然而，上述药物的单独或联合治疗均不能完全清除感染者体内的HBV病毒，其导致的HBsAg阴转或HBsAg血清学转换(感染者体内HBV病毒彻底清除的标志)的应答率通常小于5%(KwonH等，同上)。因此，针对HBV感染者发展创新的、能更为有效地清除HBV病毒、尤其是清除HBsAg的治疗方法和药物是迫切而必要的。[0004]基于免疫学手段发展新的治疗慢性HBV感染的药物是此领域的重要研究方向之一。慢性HBV感染的免疫治疗通常通过被动免疫治疗(其对应药物形式如抗体等)和主动免疫治疗(其对应药物形式如疫苗等)等两种方式来进行。被动免疫治疗(以抗体为例)是指，向HBV感染者被动施用具治疗特性的抗体，并利用抗体介导的病毒中和作用阻断HBV感染新生肝细胞，或利用抗体介导的免疫清除作用清除体内病毒和被感染的肝细胞，从而起到治疗的效果。目前，从预防性乙型肝炎疫苗免疫应答者或HBV感染恢复者血清/血浆中纯化获得的Ant1-HBs多克隆抗体，即高效价的乙肝免疫球蛋白(HBIG)已广泛应用于阻断HBV的母婴垂直传播、预防慢性HBV感染者肝移植后的HBV再感染、以及预防意外暴露于HBV的人群的感染。然而，将HBIG直接用于HBV感染者(例如CHB患者)的治疗无明显疗效，且其存在例如高效价血浆来源较少、价格昂贵、性质不稳定、潜在的安全性问题等诸多局限性。主动免疫治疗则是指，通过施用治疗性疫苗(包括蛋白疫苗、多肽疫苗和核酸疫苗等)，刺激慢性HBV感染者机体主动产生针对HBV的细胞免疫应答(CTL效应等)或/和体液免疫应答(抗体等)，从而达到抑制或清除HBV的目的。目前尚无明确显著有效的、可用于治疗慢性HBV感染的主动免疫治疗药物/疫苗。[0005]因此，针对HBV感染者发展创新的、能更为有效地治疗HBV感染的治疗方法和药物是迫切而必要的。【
发明内容】[0006]尽管HBV病毒的各种蛋白上存在多个B细胞应答(抗体应答)表位，然而并非针对任意表位的抗体都能应用于HBV感染的治疗。因此，发展能有效地治疗HBV感染的免疫治疗药物/方法的关键在于，鉴定能诱发有效清除体内病毒和被病毒感染的细胞的抗体应答的革巴标(表位)，以及获得针对该祀标(表位)的抗体。[0007]本发明鉴定了此类靶标(表位)，并基于此提供了可用于治疗乙型肝炎病毒感染的表位肽(或其变体)，包含此类表位肽(或其变体)和载体蛋白的重组蛋白，以及此类表位肽(或其变体)和重组蛋白的用途。本发明还提供了针对此类表位肽/表位的抗体，产生所述抗体的细胞株，以及它们的用途。本发明还提供了可用于治疗或减轻与乙型肝炎病毒感染相关的一种或多种症状的疫苗或药物组合物，它们分别包含本发明的重组蛋白或抗体。[0008]在本发明中，除非另有说明，`否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。[0009]如本文中所使用的，术语“HBsAg”是指，乙型肝炎病毒(HBV)的表面抗原主蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBIGENBANK数据库登录号:AAF24729.1)。[0010]如本文中所使用的，当提及HBsAg的氨基酸序列时，其使用SEQIDNO:39所示的序列来进行描述。例如，表述“HBsAg的第119-125位氨基酸残基”是指，SEQIDNO:39所示的多肽的第119-125位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HBsAg的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的HBsAg)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“HBsAg”应包括所有此类序列，包括例如SEQIDNO:39所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HBsAg的序列片段时，其不仅包括SEQIDNO:39的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HBsAg的第119-125位氨基酸残基”包括，SEQIDNO:39的第119-125位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。[0011]如本文中所使用的，术语“HBcAg”是指，乙型肝炎病毒(HBV)的核心抗原蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBIGENBANK数据库登录号:AA063517.1)。[0012]如本文中所使用的，当提及HBcAg的氨基酸序列时，其使用SEQIDNO:40所示的序列来进行描述。例如，表述“HBcAg的第79-81位氨基酸残基”是指，SEQIDNO:40所示的多肽的第79-81位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HBcAg的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的HBcAg)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“HBcAg”应包括所有此类序列，包括例如SEQIDNO:40所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HBcAg的序列片段时，其不仅包括SEQIDNO:40的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HBcAg的第79-81位氨基酸残基”包括，SEQIDNO:40的第79-81位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。[0013]如本文中所使用的，术语“WHcAg”是指，土拨鼠肝炎病毒核心蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBIGENBANK数据库登录号:ADE19018.1)。[0014]如本文中所使用的，当提及WHcAg的氨基酸序列时，其使用SEQIDNO:41所示的序列来进行描述。例如，表述“WHcAg的第79-81位氨基酸残基”是指，SEQIDNO:41所示的多肽的第79-81位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在WHcAg的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的WHcAg)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“WHcAg”应包括所有此类序列，包括例如SEQIDNO:41所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述WHcAg的序列片段时，其不仅包括SEQIDNO:41的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“WHcAg的第79-81位氨基酸残基”包括，SEQIDNO:41的第79-81位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。[0015]如本文中所使用的，术语“CRM197(Cross-ReactingMaterialsl97)”是指，白喉毒素(DT)的一种无毒突变体，其与野生型白喉毒素相比，差异在于第52位的氨基酸残基由Gly变为Glu(G.Giannini,R.Rappuoli,G.Rattietal.,NucleicAcidsResearch.1984.12:4063-4070)。白喉毒素是本领域技术人员熟知的(参见例如，ChoeS,BennettM,FujiiG,etal.，Nature.1992.357:216-222)，其氨基酸序列可见于例如GenBank登录号AAV70486.1。[0016]如本文中所使用的，当提及CRM197的氨基酸序列时，其使用SEQIDNO:42所示的序列来进行描述。例如，表述“CRM197的第1-190位氨基酸残基”是指，SEQIDNO:42所示的多肽的第1-190位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在CRM197的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“CRM197”应包括所有此类序列，包括例如SEQIDNO:42所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述CRM197的序列片段时，其不仅包括SEQIDNO:42的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“CRM197的第1-190位氨基酸残基”包括，SEQIDNO:42的第1-190位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。[0017]如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为K和\轻链。重链可分类为i1、S、Y、a或e，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(Vh)和重链恒定区(C0)组成。重链恒定区由3个结构域((^、(^和^^)组成。各轻链由轻链可变区和轻链恒定区(Q)组成。轻链恒定区由一个结构域Q组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。V1^P'区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各Vh和Vl由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个⑶R和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(Vh和V1)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1987andl991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgGl,IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgAl,IgA2，IgD,IgE或IgM抗体。[0018]如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,ff.,ed.,第2版，RavenPress,N.Y.(1989),其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。[0019]如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VdPChI结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的\和Vh结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由Vh结构域组成的抗体片段(Ward等人，Nature341:544-546(1989));术语“Fab片段”意指由\、VH、(^和ChI结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。[0020]在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如，scFv)，其中\和Vh结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构=NH2-Vf接头-Vh-COOH或NH2-Vh-接头-'-C00H。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，ProteinEng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.1mmunol.31:94-106，Hu等人(1996)，CancerRes.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),CancerImmunol.描述。[0021]在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中V1^P\结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，HolligerP.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448(1993),和PoljakR.J.等人，Structure2:1121-1123(1994))。[0022]可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的单克隆抗体E6F6)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。[0023]在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。[0024]如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P4,816，567)。[0025]如本文中所使用的，以编号提及的单克隆抗体与从相同编号的杂交瘤获得的单克隆抗体相同。例如，单克隆抗体HBs-E6F6(简称E6F6)、HBs-E7Gll(简称E7Gll)、HBs-G12F5(简称G12F5)和HBS-E13C5分别是与从杂交瘤细胞株HBs_E6F6(简称E6F6)或其亚克隆或后代细胞、HBS-E7G11(简称E7G11)或其亚克隆或后代细胞、HBS-G12F5(简称G12F5)或其亚克隆或后代细胞，和HBS-E13C5(简称E13C5)或其亚克隆或后代细胞获得的抗体相同的抗体。[0026]如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4，816，567toCabillyetal.;Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,81:68516855(1984))?[0027]如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jonesetal.,Nature,321:522525(1986);Reichmannetal.,Nature,332:323329(1988);Presta,Curr.0p.Struct.Biol.,2:593596(1992);和Clark,Immunol.Today21:397402(2000)。[0028]如本文中所使用的，“中和抗体”是指，能清除或显著降低目标病毒的毒力(例如，感染细胞的能力)的抗体或抗体片段。[0029]如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66卷，G.E.Morris,Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。[0030]如本文中所使用的，术语“表位肽”是指，抗原上能够用作表位的肽段。在一些情况下，单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特异性识别/结合。在另一些情况下，可能需要将表位肽与载体蛋白融合，以便表位肽能够被特异性抗体识别。如本文中所使用的，术语“载体蛋白”是指这样的蛋白，其可以充当表位肽的载体，即，其可以在特定位置处(例如蛋白内部，N端或C端)插入表位肽，以便该表位肽能够呈现出来，从而该表位肽能够被抗体或免疫系统识别。此类载体蛋白是本领域技术人员熟知的，包括例如，HPVLI蛋白(可以将表位肽插入在所述蛋白的第130-131位氨基酸之间或在第426-427位氨基酸之间，参JALSlupetzky,K.等ChimericpapiIlomavirus-1ikeparticlesexpressingaforeignepitopeoncapsidsurfaceloops[J].JGenVirol,2001,82:2799-2804；Varsani,A.等Chimerichumanpapillomavirustype16(HPV-16)LIparticlespresentingthecommonneutralizingepitopefortheL2minorcapsidproteinofHPV-6andHPV-16[J].JVirol,2003,77:8386-8393)，HBV核心抗原(可以用表位肽替换所述蛋白的第79-81位氨基酸，参见Koletzki,D.，etal.HBVcoreparticlesallowtheinsertionandsurfaceexposureoftheentirepotentiallyprotectiveregionofPuumalahantavirusnucleocapsidprotein[J].BiolChem,1999，380:325-333),土拨鼠肝炎病毒核心蛋白(可以用表位肽替换所述蛋白的第79-81位氨基酸,参见SabineKollig,GertrudBeteramsandMichaelNassal,J.Virol.1998，72(6):4997)，CRM197蛋白(可以将表位肽连接至该蛋白或其片段的N末端或C末端)。任选地，可以在表位肽与载体蛋白之间使用连接体(例如柔性或刚性连接体)，以促进二者各自的折叠。[0031]可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原(例如，HBsAg蛋白)的结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本发明的单克隆抗体(例如，单克隆抗体E6F6)竞争结合HBsAg蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合片段(即，抗原结合部分)。[0032]如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。[0033]如本文中所使用的，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于:GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。[0034]如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于:质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或Pl来源的人工染色体(PAC);噬菌体如\噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。[0035]如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。[0036]如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目XlOO的函数。例如,如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48=443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和ff.Miller(Comput.ApplBiosc1.,4:11-17(1988))的算法，使用PAMl20权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性"。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。[0037]如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、^分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见,例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。[0038]如本文中使用的，术语“免疫原性(immunogenicity)”是指,能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的性质，一种抗原能否成功地诱导宿主产生免疫应答取决于三方面的因素:抗原的性质、宿主的反应性和免疫方式。[0039]如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10_5m，例如小于大约10_6M、IO-7M,10_8m、10_9m或KTkiM或更小的亲和力(Kd)结合该抗原。[0040]如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常,抗体(例如,本发明的单克隆抗体E6F6)以小于大约10_5M，例如小于大约10_6M、10_7M、10_8M、10_9M或KTkiM或更小的解离平衡常数(Kd)结合抗原(例如，HBsAg蛋白)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIAC0RE仪中测定的。[0041]如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。[0042]如本文中所使用的，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如，当提及杂交瘤细胞株E6F6时，其还指杂交瘤细胞株E6F6的亚克隆和后代细胞。[0043]如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington’sPharmaceuticalSciences.EditedbyGennaroAR,19thed.Pennsylvania:MackPublishingCompany,1995),并且包括但不限于:pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，PH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80;离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。[0044]如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。[0045]如本文中所使用的，术语“蛋白疫苗”是指，基于多肽的疫苗，其任选地还包含佐剂。疫苗中的多肽可以是通过基因工程技术获得的，也可以是通过化学合成方法获得的。如本文中所使用的，术语“核酸疫苗”是指，基于DNA或RNA(例如质粒，如表达质粒)的疫苗，其任选地还包含佐剂。[0046]如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。[0047]如本文中所使用的，本发明的表位肽的生物学功能包括但不限于选自下列的一种或多种:[0048]I)与抗体E6F6、E7G11、G12F5或E13C5的特异性结合；[0049]2)在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平的能力(任选地，在将所述表位肽与载体蛋白融合后);[0050]3)诱发有效清除体内的HBV和被HBV感染的细胞的抗体应答的能力(任选地，在将所述表位肽与载体蛋白融合后)；和[0051]4)治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的能力(任选地，在将所述表位肽与载体蛋白融合后)。[0052]因此，在一个方面，本发明提供了一种分离的表位肽或其变体，其由HBsAg蛋白的第119-125位氨基酸残基组成，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于I个或几个(例如，I个，2个，3个或4个)氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的第119-125位氨基酸残基如SEQIDN0:1所示。在一个优选的实施方案中，所述变体的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。[0053]在另一个方面，本发明提供了一种分离的表位肽或其变体，其由HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸残基组成，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于I个或几个(例如，I个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或9个)氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸残基如SEQIDNO:6所示。[0054]在另一个方面，本发明提供了一种分离的表位肽或其变体，其由HBsAg蛋白的4-38个连续氨基酸残基组成，且包含HBsAg蛋白的第121-124位氨基酸残基，并且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于I个或几个(例如，I个,2个,3个,4个,5个,6个,7个，8个或9个)氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的第121-124位氨基酸残基如SEQIDNO:10所示。[0055]在一个优选的实施方案中，本发明的表位肽由HBsAg蛋白的不多于38个的连续氨基酸残基组成，例如，其由38个，37个，36个，35个，34个，33个，32个，31个，30个，29个，28个，27个，26个，25个，24个，23个，22个，21个，20个，19个，18个，17个，16个，15个，14个，13个，12个，11个，10个，9个，8个，7个，6个，5个或4个的连续氨基酸残基组成。例如，本发明的表位肽或其变体具有选自SEQIDNO:1-7和10的氨基酸序列。[0056]特别地，可以将本发明的表位肽或其变体与载体蛋白融合，以增强表位肽或其变体的免疫原性，使得表位肽或其变体能够被机体的免疫系统识别，并诱发有效清除体内病毒和被病毒感染的细胞的抗体应答。[0057]因此，在一个方面，本发明还提供了一种重组蛋白，其包含本发明的分离的表位肽或其变体，以及载体蛋白，并且所述重组蛋白不是天然存在的蛋白或其片段。在所述重组蛋白中，所述表位肽或其变体可以连接至载体蛋白的N末端或C末端，插入载体蛋白的内部，或替换载体蛋白的部分氨基酸序列，视所使用的具体载体蛋白而定。此外，任选地，所述表位肽或其变体通过连接体(刚性或柔性连接体，例如(GGGGS)3)与载体蛋白相连接。本发明的重组蛋白不受其产生方式的限定，例如，其可以通过基因工程方法(重组技术)产生，也可以通过化学合成方法产生。[0058]在一个优选的实施方案中，所述载体蛋白选自CRM197蛋白或其片段、HBcAg和WHcAg0[0059]在一个优选的实施方案中，所述载体蛋白是CRM197蛋白或其片段，并且将本发明的表位肽或其变体，任选地通过连接体，连接至CRM197蛋白或其片段的N末端或C末端。在一个优选实施方案中，所述CRM197蛋白的片段包含CRM197的aal_190(aa表示氨基酸，其置于数字n前面时，表示第n位氨基酸(例如，aal-190表示第1-190位氨基酸)；置于数字n之后时，表示多肽长度为n个氨基酸(下同))，例如包含CRM197的aa1-389。在另一个优选实施方案中，所述CRM197蛋白的片段由CRM197的aa1-190或aa1-389组成(其在本发明中分别被命名为CRMA和CRM389)。[0060]在一个优选的实施方案中，所述连接体的氨基酸序列如SEQIDN0:46所示。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白具有选自下列的氨基酸序列:SEQIDN0:74-97。[0061]在一个优选的实施方案中，所述载体蛋白是HBcAg或其片段，并且用本发明的表位肽替换HBcAg的第79-81位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述表位肽与HBcAg或其片段通过连接体连接。在一个优选的实施方案中，所述HBcAg的片段包含HBcAg的aa1-149或由HBcAg的aa1_149组成。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白具有选自下列的氨基酸序列:SEQIDNO:47-53，56，和58-65。[0062]在一个优选的实施方案中，所述载体蛋白是WHcAg或其片段，并且用本发明的表位肽替换WHcAg的第79-81位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述表位肽与WHcAg或其片段通过连接体连接。在一个优选的实施方案中，所述WHcAg的片段包含WHcAg的aal-149或由WHcAg的aa1_149组成。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白具有选自下列的氨基酸序列:SEQIDNO:66-73。[0063]在另一个方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的表位肽或其变体或本发明的重组蛋白的核苷酸序列。在另一个方面，本发明还提供了一种载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。在一个优选实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的表位肽或其变体或本发明的重组蛋白。[0064]在另一个方面，还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于,原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。[0065]在另一个方面，还提供了制备本发明的重组蛋白的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的重组蛋白。[0066]在另一个方面，本发明提供了一种蛋白疫苗，其包含本发明的表位肽(或其变体)或重组蛋白，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)。在一个优选实施方案中，所述蛋白疫苗包含一个或多个本发明的表位肽，且这些表位肽可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的。[0067]在另一个方面，本发明提供了用于治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的表位肽(或其变体)或重组蛋白或蛋白疫苗。[0068]在另一个方面，提供了本发明的表位肽(或其变体)或重组蛋白在制备蛋白疫苗中的用途，所述蛋白疫苗用于治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。[0069]在另一个方面，提供了本发明的表位肽(或其变体)或重组蛋白，其用于治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。[0070]在另一个方面，本发明提供了一种基因疫苗，其包含本发明的分离的核酸分子或载体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)。在一个优选实施方案中，所述基因疫苗包含DNA或RNA。在此类实施方案中，所述DNA或RNA可以是裸露的或可以包裹于具有传递或/和保护功能的外壳内。在一个进一步优选的实施方案中，所述外壳可以是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等的外壳，也可以是采用化学方法合成的能行使相似功能的其他材料。[0071]在另一个方面，本发明提供了用于治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的基因疫苗或分离的核酸分子或载体。[0072]在另一个方面，提供了本发明的分离的核酸分子或载体在制备基因疫苗中的用途，所述基因疫苗用于治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。[0073]在另一个方面，提供了本发明的分离的核酸分子或载体，其用于治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。[0074]在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的表位肽(或其变体)或重组蛋白或分离的核酸分子或载体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)。在一个优选实施方案中，所述药物组合物包含一个或多个本发明的表位肽，且这些表位肽可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的。[0075]在另一个方面，本发明提供了用于在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平的方法，其包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的药物组合物或表位肽(或其变体)或重组蛋白或分离的核酸分子或载体。[0076]在另一个方面，提供了本发明的表位肽(或其变体)或重组蛋白或分离的核酸分子或载体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平。[0077]在另一个方面，提供了本发明的表位肽(或其变体)或重组蛋白或分离的核酸分子或载体，其用于在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平。[0078]在一个方面，本发明提供了一种单克隆抗体及其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体能够特异性结合本发明的表位肽。[0079]在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、小鼠抗体、兔抗体、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体(例如，人鼠嵌合抗体)或双特异或多特异抗体。[0080]在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体以小于大约10_5M，例如小于大约10_6M、10_7M、10_8M、IO-9M或10_1QM或更小的Kd结合本发明的表位肽或HBsAg蛋白。[0081]在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。[0082]在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体能够在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平。[0083]在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体衍生自选自下列的单克隆抗体，或是选自下列的抗体:[0084]I)杂交瘤细胞株HBS-E6F6所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株HBs_E6F6保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201270；[0085]2)杂交瘤细胞株HBS-E7G11所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株HBs_E7Gll保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201271；[0086]3)杂交瘤细胞株HBS-G12F5所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株HBs_G12F5保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201272;和[0087]4)杂交瘤细胞株HBS-E13C5所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株HBs_E13C5保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201273。[0088]在另一个方面，本发明提供了一种单克隆抗体及其抗原结合片段，其能够阻断本发明的表位肽或HBsAg蛋白与由杂交瘤细胞株HBs-E6F6、HBs_E7Gl1、HBs-Gl2F5或HBs-E13C5所产生的抗体的结合至少50%，优选至少60%，优选至少70%，优选至少80%，优选至少90%，优选至少95%或优选至少99%，其中，所述杂交瘤细胞株HBs-E6F6、HBs_E7Gll、HBs-Gl2F5和HBs-E13C5保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且分别具有保藏号CCTCCN0.C201270,CCTCCN0.C201271,CCTCCN0.C201272和CCTCCN0.C201273。[0089]此类单抗所识别的表位与单抗E6F6、E7G11、G12F5或E13C5识别的表位相同，或者在空间上存在重叠，从而此类单抗能够降低单抗E6F6、E7G11、G12F5或E13C5与本发明的表位肽或HBsAg蛋白的结合至少50%，优选至少60%，优选至少70%，优选至少80%，优选至少90%，优选至少95%或优选至少99%。[0090]可以米用常规方法如Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中描述的方法,测定某一待测单抗降低某一已知单抗结合HBsAg蛋白的能力。一个示例性的方法包括:先把抗原预包被在微孔板上，然后把系列稀释的未标记的待测抗体以及特定浓度的经标记的已知单抗共同加入上述预包被后的微孔板中进行孵育，然后在洗涤后测定在不同稀释度的待测抗体下，已知抗体结合到板上的数量。待测抗体竞争已知抗体结合抗原的能力越强，已知抗体结合抗原的能力就越弱，结合到板上的已知抗体就越少。通常，将抗原预包被在96孔微孔板上，并利用放射标记法或酶标记法测定待测单抗阻断经标记的已知单抗的能力。[0091]可以米用Kohler等在Nature256:495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备单抗。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。将免疫原预先偶联到某些已知蛋白(如血清白蛋白)上，可能会有助于增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以利用弗氏佐剂或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内会产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂(如PEG)将其与骨髓瘤细胞融合，从而获得杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103,AcademicPress,1996)。[0092]将上述制备的杂交瘤细胞接种到合适的培养基中进行生长，所述培养基中含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养基中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。[0093]优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养基敏感等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如M0P-21和MC-1l小鼠肿瘤衍生株(THESalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,Calif.USA),以及SP-2/0或X63_Ag8_653细胞株(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,Md.USA)o另外，还可以利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor,J.1mmunol.,133:3001(1984);Brodeuretal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)。[0094]杂交瘤细胞生长的培养基用于检测针对特异抗原的单抗的产生。可以使用下列方法来测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性:免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)中描述的Scatchard分析法可测定单抗的亲和力。[0095]在确定杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103,AcademicPress,1996描述的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养基可以是DMEM或RPM1-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。[0096]利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。[0097]还可以通过基因工程重组技术获得单克隆抗体。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。将所得的DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞(如E.coli细胞、COS细胞、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，并在合适的条件下进行培养，可以获得重组表达的目标抗体。[0098]本发明还提供了分离的核酸分子，其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。此类核酸分子可以从杂交瘤细胞中分离得到，也可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。[0099]在一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含能够编码本发明的单克隆抗体的重链可变区的核酸序列。[0100]在另一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含能够编码本发明的单克隆抗体的轻链可变区的核酸序列。[0101]在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。[0102]在一个优选实施方案中,本发明的载体是例如质粒，粘粒，曬菌体，柯斯质粒等等。[0103]在另一个方面，还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于,原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。[0104]在另一个方面，还提供了制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。[0105]在另一个方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，其选自:[0106]I)杂交瘤细胞株HBS-E6F6，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201270；[0107]2)杂交瘤细胞株HBS-E7G11，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201271；[0108]3)杂交瘤细胞株HBS-G12F5，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201272;和[0109]4)杂交瘤细胞株HBS-E13C5，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201273。[0110]可通过常规方法，从单克隆抗体E6F6、E7G11、G12F5和E13C5中获得各个抗体各自所包含的重链可变区、轻链可变区、重链可变区CDR和轻链可变区CDR的氨基酸序列和/或核苷酸序列。[0111]在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。[0112]在另一个方面，本发明提供了检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。[0113]在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否感染了HBV的方法，其包括:使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段检测HBsAg蛋白在来自所述受试者的样品中的存在。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。[0114]在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了HBV。[0115]在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。[0116]在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者本发明的药物组合物。[0117]在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。[0118]在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，用于预防或治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。[0119]在另一个方面，本发明提供了用于在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平的方法，其包括，给有此需要的受试者施用有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触。在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平。[0120]本发明所提供的疫苗(蛋白疫苗和基因疫苗)、药物和药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与其他药学活性剂(例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素)联合使用。[0121]发明的有益效果[0122]与现有技术相比，本发明的表位肽和含有所述表位肽的重组蛋白具有显著的有利方面。特别地，本发明的表位肽和重组蛋白能够诱发有效清除体内的HBV和被HBV感染的细胞的抗体应答，从而能够在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平，且能够用于治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。[0123]此外，本发明还提供了能够特异性识别/结合本发明的表位肽的单克隆抗体及其抗原结合片段。此类单克隆抗体及其抗原结合片段能够在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平，能够有效清除体内的HBV和被HBV感染的细胞，从而能够用于治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。[0124]本发明的表位肽的优势还在于，针对该表位肽的单克隆抗体及多克隆抗体能够在受试者(例如HBV转基因小鼠)体内显著降低HBsAg水平和HBVDNA水平，且治疗有效的持续时间显著长于针对其它表位的抗体。本发明的表位肽的优势还在于，以其为主要活性成分的疫苗在免疫受试者(例如HBV转基因小鼠)后，可持久降低受试者体内的HBsAg水平和HBVDNA水平。[0125]下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。【专利附图】【附图说明】[0126]图1:不同小鼠单克隆抗体治疗HBV转基因小鼠的疗效评估。[0127]图2:HBs-E6F6、HBs-E7Gll、HBs-G12F5、HBs-E13C5、0.9%NS和恩替卡韦(ETV)治疗HBV转基因小鼠的疗效评估。其中，显示的数值为各实验组4只小鼠的平均值。图2A:小鼠单克隆抗体和恩替卡韦(ETV)治疗HBV转基因小鼠后血清HBsAg的下降幅度；图2B:小鼠单克隆抗体和ETV治疗HBV转基因小鼠后血清HBVDNA的下降幅度；图2C:小鼠单克隆抗体和ETV治疗HBV转基因小鼠后血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平变化。[0128]图3:HBs-E6F6注射后HBVDNA和HBsAg的动力学变化。图3A:HBs-E6F6注射HBV转基因小鼠后血清HBsAg的下降幅度；图38:HBs-E6F6注射HBV转基因小鼠后血清HBVDNA的下降幅度。[0129]图4:嵌合抗体治疗HBV转基因小鼠的疗效评估。[0130]图5:9种重组蛋白的构建、表达、纯化和电镜观察。图5A:pC149-SEQ克隆的构建的示意图；图5B:9种重组蛋白的SDS-PAGE检测与电镜观察的结果。[0131]图6:HBs-E6F6、HBs-E7Gll、HBs-G12F5、HBs-E13C5抗体的表位分析。[0132]图7:HBs-E6F6/HBs-E7Gll对表位肽SEQl的氨基酸突变的敏感性的分析。其中，“Ref.”表示以HBsAg作为体现抗体反应性的参照抗原，表示反应性与HBsAg相同，“++”表示反应性比HBsAg低2个数量级(1glO),“++++”表示反应性比HBsAg低4个数量级(1g10)0[0133]图8:5种包含表位肽的重组蛋白的制备及其免疫原性的评价。图8A:5种重组蛋白的SDS-PAGE检测与电镜观察的结果。图8B:5种重组蛋白免疫BALB/C小鼠后血清抗体滴度的变化。[0134]图9:小鼠血源多克隆抗体的治疗效果的评估。[0135]图10:5种重组蛋白治疗HBV转基因小鼠的效果评估。[0136]图11:3种包含表位肽的重组蛋白的制备及其治疗效果的评估。[0137]图1lA:3种重组蛋白的SDS-PAGE检测与电镜观察的结果。图1lB:3种重组蛋白免疫JffiV转基因小鼠后，小鼠血清HBsAg水平、血清HBVDNA水平、Ant1-HBsAg抗体水平和抗-载体蛋白抗体水平的变化。[0138]图12:CRM197-SEQ6、CRM389-SEQ6、CRMA-SEQ6重组蛋白的示意图。Linker，连接体。[0139]序列信息[0140]本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。[0141]S?名称序列信息I1SEQl"gPCKTCT2SEQ2^GPCRTCT3SEQ3STiTSTGlHVTP4SEQ4TTSTGPCKKt5SEQ5CKTCTTPAQ6SEQ67SEQ7~￥GSSrrST^1P^TCTTPAQGTSM^^CTKPTDGNCT8SlQSS:n.TSTGPC................................................................................................................................................................................................................................................................[...........................9.....................................................SEQ9"STGPCiCrj10SEQlO"CKTC.................................................11.......................................................SEQll...........................................................TCTTPAQG—MFPAQ..............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................12Si"mexiasgllgpllvlj13[S2jLGPLL^rLQAGFFLLTI[0142][0143]【权利要求】1.一种分离的表位肽或其变体，其由HBsAg蛋白的第119-125位氨基酸残基组成，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于I个或几个(例如，I个，2个，3个或4个)氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能，例如，所述HBsAg蛋白的第119-125位氨基酸残基如SEQIDNO:1所示；例如，所述变体的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。2.一种分离的表位肽或其变体，其由HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸残基组成，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于I个或几个(例如，I个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或9个)氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能，例如，所述HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸残基如SEQIDN0:6所示。3.一种分离的表位肽或其变体，其由HBsAg蛋白的4-38个(例如38个，37个，36个，35个，34个，33个，32个，31个，30个，29个，28个，27个，26个，25个，24个，23个，22个，21个，20个，19个，18个，17个，16个，15个，14个，13个，12个，11个，10个，9个，8个，7个，6个，5个或4个)连续氨基酸残基组成，且包含HBsAg蛋白的第121-124位氨基酸残基，并且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于I个或几个氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能，例如，所述HBsAg蛋白的第121—124位氨基酸残基如SEQIDNO:10所示；例如，所述表位肽或其变体具有选自SEQIDNO:1-7和10的氨基酸序列。4.一种重组蛋白，其包含权利要求1-3任一项的分离的表位肽或其变体，以及载体蛋白，并且所述重组蛋白不是天然存在的蛋白或其片段，例如，所述表位肽或其变体任选地通过连接体(刚性或柔性连接体，例如(GGGGS)3)与载体蛋白相连接；例如，所述载体蛋白选自CRM197蛋白或其片段、HBcAg和WHcAg。5.权利要求4的重组蛋白，其中，所述载体蛋白是CRM197蛋白或其片段，并且将所述表位肽或其变体，任选地通过连接体，连接至CRM197蛋白或其片段的N末端或C末端；例如，所述CRM197蛋白的片段包含CRM197的aa1-190，例如包含CRM197的aa1-389；优选地，所述CRM197蛋白的片段由CRM197的aa1-190或aa1-389组成；例如，所述连接体的氨基酸序列如SEQIDN0:46所示；例如，所述重组蛋白具有选自下列的氨基酸序列:SEQIDNO:74-97。6.权利要求4的重组蛋白，其中，所述载体蛋白是HBcAg或其片段，并且用所述表位肽替换HBcAg的第79-81位氨基酸，任选地，所述表位肽与HBcAg或其片段通过连接体连接；例如，所述HBcAg的片段包含HBcAg的aal_149或由HBcAg的aa1-149组成；例如，所述重组蛋白具有选自下列的氨基酸序列:SEQIDNO:47-53，56，和58-65。7.权利要求4的重组蛋白，其中，所述载体蛋白是WHcAg或其片段，并且用所述表位肽替换WHcAg的第79-81位氨基酸，任选地，所述表位肽与WHcAg或其片段通过连接体连接；例如，所述WHcAg的片段包含WHcAg的aa1-149或由WHcAg的aa1-149组成；例如，所述重组蛋白具有选自下列的氨基酸序列:SEQIDNO:66-73。8.—种分离的核酸分子,其包含编码权利要求1-3任一项的表位肽或其变体,或权利要求4-7任一项的重组蛋白的核苷酸序列。9.一种载体,其包含权利要求8的分离的核酸分子。10.一种宿主细胞,其包含权利要求8的分离的核酸分子或权利要求9的载体。11.制备权利要求1-3任一项的表位肽或其变体或者权利要求4-7任一项的重组蛋白的方法，其包括，在合适的条件下培养权利要求10的宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述表位肽或其变体或者重组蛋白。12.—种蛋白疫苗,其包含权利要求1-3任一项的表位肽或其变体或权利要求4-7任一项的重组蛋白，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)；例如，所述蛋白疫苗包含一个或多个所述表位肽，且这些表位肽可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的。13.权利要求1-3任一项的表位肽或其变体或权利要求4-7任一项的重组蛋白在制备蛋白疫苗中的用途，所述蛋白疫苗用于治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。14.一种基因疫苗，其包含权利要求8的分离的核酸分子或权利要求9的载体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂);例如，所述基因疫苗包含DNA或RNA；优选地，所述DNA或RNA可以是裸露的或可以包裹于具有传递或/和保护功能的外壳内；优选地，所述外壳可以是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等的外壳，也可以是采用化学方法合成的能行使相似功能的其他材料。15.权利要求8的分离的核酸分子或权利要求9的载体在制备基因疫苗中的用途，所述基因疫苗用于治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。16.—种药物组合物,其包含权利要求1-3任一项的表位肽或其变体或权利要求4-7任一项的重组蛋白或权利要求8的分离的核酸分子或权利要求9的载体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)；例如，所述药物组合物包含一个或多个所述表位肽，且这些表位肽可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的。17.权利要求1-3任一项的表位肽或其变体或权利要求4-7任一项的重组蛋白或权利要求8的分离的核酸分子或权利要求9的载体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平。18.一种单克隆抗体及其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体能够特异性结合权利要求1-3任一项的表位肽；例如，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、小鼠抗体、兔抗体、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体(例如，人鼠嵌合抗体)或双特异或多特异抗体；例如，所述的单克隆抗体以小于大约io-5m，例如小于大约10_6M、10_7M、10_8M、10_9M或KTwM或更小的Kd结合所述表位肽或HBsAg蛋白；例如，所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体；例如，所述的单克隆抗体能够在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平；例如，所述的单克隆抗体衍生自选自下列的单克隆抗体，或是选自下列的抗体:1)杂交瘤细胞株HBS-E6F6所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株HBS-E6F6保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201270；2)杂交瘤细胞株HBS-E7G11所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株HBS-E7G11保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201271；3)杂交瘤细胞株HBS-G12F5所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株HBs_G12F5保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201272;和4)杂交瘤细胞株HBS-E13C5所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株HBs_E13C5保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201273。19.一种单克隆抗体及其抗原结合片段，其能够阻断权利要求1-3任一项的表位肽或HBsAg蛋白与由杂交瘤细胞株HBs-E6F6、HBs_E7Gll、HBs_G12F5或HBs_E13C5所产生的抗体的结合至少50%，优选至少60%，优选至少70%，优选至少80%，优选至少90%，优选至少95%或优选至少99%，其中，所述杂交瘤细胞株HBs-E6F6、HBs_E7Gll、HBs_G12F5和HBs_E13C5保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且分别具有保藏号CCTCCN0.C201270,CCTCCN0.C201271,CCTCCN0.C201272和CCTCCN0.C201273。20.一种杂交瘤细胞株，其选自:1)杂交瘤细胞株HBS-E6F6，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201270；2)杂交瘤细胞株HBS-E7G11，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201271；3)杂交瘤细胞株HBS-G12F5，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201272;和4)杂交瘤细胞株HBS-E13C5，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCN0.C201273。21.—种试剂盒，其包括权利要求18或19的单克隆抗体或其抗原结合片段；例如，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶；例如，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶。22.检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求18或19的单克隆抗体或其抗原结合片段；例如，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶；例如，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶。23.权利要求18或19的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了HBV。24.一种药物组合物，其包含权利要求18或19的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。25.权利要求18或19的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。26.权利要求18或19的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平。【文档编号】C12P21/02GK103483421SQ201310222728【公开日】2014年1月1日申请日期:2013年6月6日优先权日:2012年6月11日【发明者】袁权,张天英,罗文新,陈毅歆,张军,夏宁邵申请人:厦门大学,厦门万泰沧海生物技术有限公司