一种发酵谷物的乳酸菌及其用途
【专利摘要】本发明一种发酵谷物的乳酸菌及其用途，涉及食品生物【技术领域】。乳酸菌Dy-1，建议的分类名称为植物乳杆菌，即Lactobacillusplantarum；该菌株于2012年4月18日送交位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.6016。利用上述乳酸菌冻干粉发酵麦胚或大麦，其发酵液经离心所得上清液再经冷冻干燥所获得的发酵提取物，对HT-29结肠癌、SGC-7901胃癌细胞具有显著的促进凋亡和抑制增殖作用；对HT-29结肠癌诱发的荷瘤裸鼠模型具有显著的抑制肿瘤生长和提高其免疫力的功能。
【专利说明】一种发酵谷物的乳酸菌及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品生物【技术领域】，特指用于发酵小麦胚芽、大麦等谷物的乳酸菌，通过乳酸菌发酵实现谷物中营养物质的生物转化，制备具有抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的发酵提取物。
【背景技术】 [0002]目前，中国因恶性肿瘤导致死亡的人数占全球的1/4，且数量仍在不断攀升。而对于癌症的治疗主要有手术、化疗、放疗及祀向疗法(免疫疗法、基因疗法、血管生成抑制剂及定向疗法)等方式，其中药物治疗是目前的主要形式。但目前大量使用的抗肿瘤药物具有较高的毒性和副作用，开发天然安全、无毒副作用的抗肿瘤活性物质及其功能制品是癌症患者的渴求。
[0003]天然谷物中的活性成分已经被证实具有较好的抗肿瘤活性。日本专利(200510069392.8)公开了一种抗肿瘤制剂的制备方法。该方法是将麦胚芽、大豆胚芽、米胚芽等以一定的比例混合，将混合物用110°C热蒸汽加热，并将蒸汽加热产物在30°C下用曲类(小麦曲霉)等发酵48h，所得的发酵提取物具有抗肿瘤效果，其抑制率在5%~15%，该专利未对发酵提取物中的抗肿瘤成分进行分析。日本崇城大学Kouta Funamoto, et al.在2008年研究得出大麦烧酒蒸馏后的残留物具有抗肿瘤和免疫活性，在体外能显著抑制人肺癌细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡，在体内诱导能正常老鼠血清干扰素(IFN) - Y的产生，增加自然杀伤细胞(NK)的数量，通过尾静脉注射，无急性毒性。
[0004]以谷物为原料结合微生物发酵技术提取抗肿瘤活性也日益引起人们的关注。美国专利(2010/135580A2)采用面包酵母对新鲜麦胚进行发酵，将其上清液冷冻干燥成粉，干燥粉用乙醇提取并通过分子筛和电泳等方法获得多肽，相对分子质量在5~100KD之间。采用该范围的多肽进行肿瘤细胞和荷瘤动物试验，具有减少肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖作用。但总体来看，目前上述专利和文献报道关于发酵产物的抗肿瘤研究，主要是采用酵母菌发酵，且其对肿瘤的抑制效果尚未达到令人满意的效果。
[0005]利用乳酸菌发酵麦胚的产物主要可以抑制真菌的生长而采用乳酸菌发酵谷物获得抗肿瘤提取物尚未见专利或其他文献报道。乳酸菌(lactic acid bacterium,LAB)安全无毒，无致病性，无致癌性，已在世界范围内被公认为“GRAS”等级的食品微生物，与机体的健康息息相关。目前的报道已证实乳酸菌具有预防与治疗肿瘤的功能，但其功效尚有待进一步提高。筛选能发酵谷物并获得具有高抑制肿瘤活力产物的乳酸菌，并验证其抗肿瘤活性，是一个全新的研究领域，具有广阔的发展前景。
【发明内容】
[0006]本发明提供的是一种以自然发酵泡菜为原料，通过筛选、分离、富集以及常规的理化分析，从中获得一株发酵谷物取物具有抗肿瘤作用的乳酸菌。
[0007]采用该乳酸菌发酵麦胚和大麦，控制发酵条件，获取发酵提取物，采用MTT、细胞凋亡和细胞周期法研究其组分的体外抗肿瘤功能；采用荷瘤裸鼠模型(人源肿瘤细胞)研究该提取物体内抗肿瘤功能。
[0008]本发明通过以下步骤实现:
[0009]将采集到的泡菜样品进行适当的梯度稀释，涂布于MRS双层平板上，恒温箱中于30°C培养36h，待菌落长出来后进行观察，观察平板的生长情况，选择平板中菌落合适(30~300个)和溶钙圈明显的便于挑取菌落的平板，记录菌落特征，选择菌落，挑取菌落。[0010]本发明乳酸菌Dy-1,其建议的分类名称为植物乳杆菌，Lactobacillusplantarum ;该菌株于2012年4月18日送交位于中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为 CGMCC N0.6016。
[0011]乳酸菌利用MRS液体培养基活化、扩大培养后，添加保护剂(20%脱脂乳、10%海藻糖、14%谷氨酸钠、6%山梨醇和6%Vc)后利用真空冷冻干燥制备冻干粉，分装于无菌真空包装袋中密封保藏。
[0012]分别称取筛分除杂后的新鲜麦胚和大麦，粉碎过30~140目筛，置于锥形瓶中，按照重量比1:6~1:15的比例加入蒸馏水，再加入乳酸菌到麦胚和水中，其中乳酸菌冻干粉占新鲜麦胚粉的质量为2~8%，混合均匀；将锥形瓶用纱布封口，置于恒温培养箱中，在20~40°C下发酵12~72h，其中优选发酵温度30~35°C，发酵24~48h后，发酵物在室温下8000~15000rpm/min离心10~40min ;收集上清液,并将其进行热风干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，优选冷冻干燥，从而获得到发酵麦胚提取物和发酵大麦提取物。
[0013]本发明的优点:
[0014](I)本发明利用自主分离的乳酸菌，制备具有抗肿瘤功能的发酵提取物，具有自主知识产权。
[0015](2)本发明生产成本低，采用直投式发酵，方便快捷，安全稳定，便于质控。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1PCR产物电泳图，
[0017]图2LFWGE对结肠癌HT-29细胞的生长抑制率，
[0018]图3细胞凋亡图谱，
[0019]图4LFWGE浓度对结肠癌细胞周期的影响，
[0020]图5LFWGE对荷瘤裸鼠瘤体积的影响，
[0021]图6LFWGE对荷瘤裸鼠肿瘤的抑制率，
[0022]图7FBE对结肠癌HT-29细胞的生长抑制率，
[0023]图8FBE对荷瘤裸鼠瘤体积的影响，
[0024]图9FBE对荷瘤裸鼠肿瘤的抑制率。
【具体实施方式】
[0025]1.乳酸菌的筛选过程
[0026]( I)初筛
[0027]将采集到的泡菜样品进行适当的梯度稀释，涂布于MRS双层平板法，恒温箱中于30°C培养36h，待菌落长出来后进行观察，观察平板的生长情况，选择平板中菌落合适(30~300个)和溶钙圈明显的便于挑取菌落的平板，记录菌落特征，选择菌落，挑取菌落。
[0028](2)菌株初筛
[0029]将分离得到的菌株进行多次划线或涂布分离，以获得纯菌株。从穿刺保存中挑取少量菌，进行革兰氏染色，通过显微观察，对染色结果进行记录，检查分得菌株是否是纯菌株，同时通过对菌株的形状进行观察，测定细菌大小，进行初步鉴定。对不纯的菌再次富集和分离，方法同上。
[0030](3)菌株复筛
[0031]通过产酸产气试验对分得的菌株的产酸能力进行比较，以获得产酸量高的菌株；同时通过观察同时产酸和产气的菌株，以获得潜在的兼性厌氧乳酸菌。
[0032]从记录的菌落的情况，选择纯的杆状或链状的革兰氏阳性菌，在糖发酵产酸培养基进行产酸产气试验，接种后恒温箱内25°C恒温培养48h，然后用pH计测定pH值。
[0033]2.菌种鉴定
[0034]( I)形态学观察
[0035]从泡菜中分离出三株产酸量最大的菌株在固体培养基上菌落凸起、圆形、边缘整齐、表面光滑呈白色。在液体培养基中生长后混浊，兼性厌氧。革兰氏染色观察(见表1)，均为革兰氏阳性，细菌为杆状，单个或成对排列为多，少数成短链；菌体圆端直杆状，宽0.8~
1.2 μ m，长I~2μπι单个或成对排列，不形成内生芽孢。下面结合实例对本发明做进一步阐述。
[0036](2)生理生化试 验结果
[0037]从自然发酵甘蓝中分离出产酸最高三株菌株，对其进行生理生化鉴定(见表2)，结果表明，它们的精氨酸产氨试验、产硫化氢试验、过氧化氢酶试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验和吲哚试验均为阴性。乳酸定性试验显示，均产生乳酸。在糖发酵试验中(见表3)，不发酵鼠李糖，部分弱发酵阿拉伯糖和松三糖，其余的糖醇均能发酵，均不产气，经鉴定该三株菌都是植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)。选择发酵性能较好的Dy-1进行16srDNA扩增。
[0038](3) 16s rDNA PCR扩增产物的电泳图
[0039]挑取Dy-1菌适量，加入MRS培养基中，37°C培养过夜，取ImL均液，5000X g离心5min，弃去上清液后加入300 μ L细胞裂解液和50 μ L蛋白酶K，90°C水浴裂解IOmin后，12000Xg离心IOmin取上清液，以v3通用引物进行PCR反应。PCR产物电泳图如图1所示。
[0040]PCR产物纯化后交由上海生工测序，序列如下:
[0041 ] CTTGCAGTTCGAACGAACTTCTTGGTATCTGATCTGGTGCTTTGCATCATGATTTACATCC TGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATA ACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGA AAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGT AACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGG ACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGA CGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTC TGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTC CGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTT CGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAG TGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAG GCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAaCGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGa AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAA GCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCG
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[0042]通过在Genbank中Blast分析结果可知，Dy-1的16S rRNA基因序列与Lactobacillus plantarum strain L3的16S rRNA基因序列只有3个喊基的差异且相似性为 99% 以上，应属于同一种即:Lactobacillus plantarum。
[0043]3.用途
[0044](I)发酵谷物提取物的体外抗肿瘤作用:将本发明的乳酸菌发酵小麦胚芽或大麦，其提取物以0.125~4mg/mL的浓度加入到人的HT-29结肠癌、SGC-7901胃癌细胞中，培养一段时间(如48h)，观察评价其抗肿瘤效果。其方法如下:
[0045]①细胞增殖试验:采用MTT法。
[0046]②细胞凋亡与细胞周期试验:采用流式细胞仪进行分析。
[0047]与未加本发明发酵麦胚提取物的情况相比较，肿瘤活细胞数可降至50%或以下，最优的可使活细胞数降至10%或以下；其肿瘤凋亡率可达50%或以上，最高可达90%或以上。
[0048](2)发酵谷物提取物的体内抗肿瘤作用:将4~6周龄的BALB/c裸鼠的腹部皮下接种人结肠癌HT-29细胞(接种量:I X IO6~2 X IO7细胞/裸鼠)，2~15天后肉眼可见裸鼠接种部位有肿瘤长出后开始灌胃乳酸菌发酵麦胚或大麦的提取物；将荷瘤裸鼠随机分成
5组，即阴性对照组、5-FU阳性对照组、高剂量组、低剂量组和高剂量组+5-FU组，每组10~12只裸鼠，连续灌胃14~50天；每日测定瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，根据肿瘤重量计算抑瘤率。
[0049]与阴性对照组相比较，灌胃组的抑瘤率可达30%~60%。
[0050]实施例1
[0051]称取粉碎的新鲜麦胚粉20.0g于500mL锥形瓶中，向其中加入IOOml的蒸懼水,再加入0.4g的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum Dy-1),混合均匀；将锥形瓶用纱布封口，置于恒温培养箱中在30°C下发酵24h后，将其在12000rpm/min下离心20min收集上清液进行冷冻干燥，得到发酵麦胚提取物(LFWGE)
[0052]称取0.5g的LFWGE溶于50ml的去离子水中，过0.22um的滤膜，将滤液按照0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、l.0mg/mL、2.0mg/ml>4.0mg/ml 分别加入到 HT-29 结肠癌细胞中，培养细胞24h、48h、72h，并分别通过MTT法测定LFWGE对结肠癌HT-29细胞的抑制率(图2)。结果表明，提取物浓度与肿瘤细胞增殖抑制率呈正相关，最大抑制率达到94.2%ο
[0053]将1.0mg/mL的LFWGE加入到结肠癌细胞中，培养细胞48h后，收集细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡(图3)。结果表明，早期凋亡是66.5% (图2，右下角)，晚期凋亡是27.6%(图2，右上角)。将0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的LFWGE加入到结肠癌HT-29细胞中，培养细胞48h后，收集细胞，流式细胞仪检测细胞周期(图4)。结果表明，随着浓度的增加，G1期也随之延长，而S期则随之缩短，说明LFWGE能有效阻滞细胞的G1期。
[0054]实施例2 [0055]将上述制备的LFWGE溶解于生理盐水中，制备成浓度为0.2g/ml和0.lg/ml水溶液，并且通过无菌膜处理备用。人HT-29结肠癌细胞接种到4-6周龄的BALB/c裸鼠腹部皮下，2 天后采用 2g/kg/d、lg/kg/d、2g/kg/d+5-FU (25mg/kg/d, 1.p, 7 天)剂量的 LFWGE 给荷瘤裸鼠灌胃，连续灌胃30天，同时与灌胃相同剂量的生理盐水组和腹腔注射(25mg/kg/d, 1.p，7天)的5-FU组进行比较，通过测定瘤体积的变化和最后的抑瘤率来确定LFWGE的抗肿瘤效果(图5，6)。结果表明，2g/kg/d、lg/kg/d、2g/kg/d+5-FU LFWGE剂量组的抑瘤率分别达到 49.37%、40.7%, 47.8%。
[0056]实施例3
[0057]称取粉碎过60目筛的大麦粉20.0g于500mL锥形瓶中，向其中加入1:6比例的水混合均匀，先用0.015%的β -葡聚糖酶40°C水解30min，再用4%的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum Dy-1)在30 °C下发酵48h,发酵完成后将FBE在室温下6000rpm/min离心20min，收集上清液，并将其进行冷冻干燥24h，从而获得到发酵大麦提取物(FBE)。
[0058]称取0.5g的FBE溶于50ml的去离子水中，过0.22um的滤膜,将滤液按照0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、l.0mg/mL、2.0mg/ml>4.0mg/ml 分别加入到 HT-29 肿瘤细胞中，培养细胞24h、48h、72h，并分别通过MTT法测定FBE对结肠癌HT-29细胞的抑制率。结果表明，提取物浓度与肿瘤细胞增殖抑制率呈正相关，最大抑制率达到95.6%(图7)。
[0059]实施例4
[0060]将上述制备的FBE溶解于生理盐水中，制备成浓度为0.2g/ml和0.lg/ml，并且通过无菌膜处理备用。将人的HT-29结肠癌细胞接种到4-6周龄的BALB/c裸鼠腹部皮下，2天后采用 2g/kg/d、lg/kg/d、2g/kg/d+5-FU (25mg/kg/d, 1.p,7 天)剂量的 FBE 给荷瘤裸鼠灌胃，连续灌胃30天，同时与灌胃相同剂量的生理盐水组和腹腔注射(25mg/kg/d，7天)的5-FU组做比较，通过用游标卡尺测量的移植瘤体积和最后的抑瘤率来确证FBE的抗肿瘤作用(图8，9)。结果表明，2g/kg/d+5-FU混合剂量组的抑瘤率可达到53.36%。
[0061]表1分离得到产酸量最高的菌株的形态学特征
[0062]
【权利要求】
1.乳酸菌Dy-1,其建议的分类名称为植物乳杆菌，;保藏编号为 CGMCC N0.6016。
2.乳酸菌的应用，用于发酵小麦胚芽或大麦谷物。
【文档编号】C12R1/25GK103468600SQ201310261606
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】董英, 程新, 崔恒林, 肖香, 伍静 申请人:江苏大学