一种检测产乳酸菌株的发酵液中乳酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测产乳酸菌株的发酵液中乳酸的方法。所述方法包括步骤：（i）将产乳酸菌株的发酵液和溴甲酚绿溶液混合，得到混合溶液；和（ii）将混合溶液经分光光度法检测，得到吸光值（OD值）。
【专利说明】一种检测产乳酸菌株的发酵液中乳酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物发酵领域，尤其涉及一种检测发酵液中乳酸含量的方法。
【背景技术】
[0002] 乳酸的生产方法以微生物发酵为主，故而优良的高产菌种成为发酵工艺的重中之 重，但传统的菌种的筛选方法耗时周期长，成本较高，已经越来越难以满足大规模发酵生 产的需要，所以高效快速便捷的筛选方法成为菌种选育的最热门课题。高通量筛选（High throughput screening, HTS)是近年来菌种选育的研究方向之一，它不但增加了实验通量， 且降低了实验体积，在同样的试验周期内可以完成成千上万个筛选工作。
[0003] 目前，乳酸含量的检测方法主要包括EDTA络合滴定法、酶法、酶电极法、荧光法、 比色法(对羟基联苯法)、纸层析法、气相色谱法和液相色谱法等。这些传统检测方法各有自 身适应的范围和精确度，也都受到成本和检测速度的影响。可惜的是它们都难以用于高通 量筛选方法，既不能一次性快速检测大量的样品，也不能直观的肉眼识别。
[0004] 因此，本领域迫切需要提供一种高通量快速筛选高产乳酸菌株的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种高通量快速筛选高产乳酸菌株的方法。
[0006] 在本发明的第一方面，提供了一种检测乳酸的方法，所述乳酸来自产乳酸菌株的 发酵培养，所述方法包括步骤：
[0007] (i)将产乳酸菌株的发酵液和溴甲酚绿溶液混合，得到混合溶液；和
[0008] (ii)将混合溶液经分光光度法检测，得到吸光值（0D值)。
[0009] 在另一优选例中，所述混合溶液中还含有缓冲液，所述缓冲液为醋酸钠-醋酸缓 冲液。
[0010] 在另一优选例中，混合溶液中，溴甲酚绿的浓度为20-100μΜ，缓冲液浓度为 5_20mM〇 toon] 在另一优选例中，所述混合溶液在酶标板或深孔板中。
[0012] 在另一优选例中，所述酶标板或深孔板为24孔、48孔或96孔。
[0013] 在另一优选例中，所述吸光值在UV400-630nm;较佳地为430-620nm;更佳地为 443nm 和 616nm。
[0014] 在另一优选例中，所述方法在步骤（ii)后还包括步骤（iii):将得到的吸光值与标 准溶液经分光光度法检测所得到的吸光值进行比较，从而得到产乳酸菌株的发酵液中乳酸 的量；
[0015] 所述标准溶液通过下述方法得到：将乳酸溶液，溴甲酚绿溶液和醋酸缓冲液混合， 得到标准溶液；较佳地，所述标准溶液中乳酸的浓度及其吸光值在线性范围内。
[0016] 在本发明的第二方面，提供了一种筛选高产乳酸菌株的方法，所述方法包括步 骤：
[0017] (1)将来自不同产乳酸菌株的发酵液分别和溴甲酚绿溶液混合，得到相应的混合 溶液；
[0018] (2)将各混合溶液经分光光度法检测，得到相应的吸光值（0D值）；和
[0019] ( 3)将不同产乳酸菌株所得到的吸光值进行比较，吸光值越小的乳酸产量越高，从 而获得高产乳酸菌株。
[0020] 在另一优选例中，所述混合溶液中，来自不同孔板的发酵液浓度相同，溴甲酚绿浓 度相问。
[0021] 在另一优选例中，所述混合溶液中还含有缓冲液，所述缓冲液含有醋酸钠-醋酸 缓冲液。
[0022] 在另一优选例中，混合溶液中，溴甲酚绿的浓度为20-100μΜ，缓冲液浓度为 5_20mM。
[0023] 在另一优选例中，所述混合溶液在酶标板或深孔板中；所述酶标板为24孔、48孔 或96孔。
[0024] 在另一优选例中，所述吸光值在UV400-630nm;较佳地为430-620nm;更佳地为 443nm 和 616nm。
[0025] 据此，本发明提供了一种高通量快速筛选高产乳酸菌株的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1是溴甲酚绿质子化和去质子化的光波扫描曲线，可见溴甲酚绿存在吸收峰。
[0027] 图2显示了不同浓度溴甲酚绿水溶液中乳酸与其对应的在不同浓度醋酸钠-醋 酸缓冲液下〇D 616的线性关系及在酶标板或深孔板中相应的颜色变化，其中A1和A2是关于 20 μ Μ溴甲酚绿水溶液；B1和B2是关于40 μ Μ溴甲酚绿水溶液；C1和C2是关于60 μ Μ溴 甲酚绿水溶液；D1和D2是关于80 μ Μ溴甲酚绿水溶液；El和Ε2是关于100 μ Μ溴甲酚绿水 溶液；F1和F2是关于10mM醋酸缓冲液中乳酸与其对应的在不同浓度溴甲酚绿下0D616的线 性关系及在酶标板或深孔板中相应的颜色变化。
[0028] 图3为实施例2中用于筛选的96孔板，孔内为Lactobacillus paracasei (保藏 号：ATCC25598)培养液，即采用含有60 μ Μ溴甲酚绿的筛选培养基，将出发菌株和诱变后菌 株置于该96孔板中培养12h，观察培养液的颜色变化，对比选出颜色变化最剧烈的孔，以筛 选突变株。
【具体实施方式】
[0029] 发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现可基于乳酸释放出的氢离子致使添加 了溴甲酚绿的发酵液的吸光值发生变化的现象，并考察了乳酸的含量和吸光值之间的线性 关系，从而建立了一种高通量检测酶标板中产乳酸菌株发酵液的乳酸含量的方法，解决了 快速检测乳酸的问题。在此基础上，完成了本发明。
[0030] 如本文所用，"乳酸溶液"是指用乳酸标准品配制的纯乳酸溶液，使用的溶剂优选 水。
[0031] 如本文所用，"溴甲酚绿溶液"可以将溴甲酚绿溶解在乙醇等溶剂中获得。"溴甲酚 绿"又称"3,3'，5,5'-四溴间甲酚磺酰酞"（Bromocresol green或γ-Sultone)，分子 式C21H14Br405S，结构式如下式表示：
[0032]
【权利要求】
1. 一种检测乳酸的方法，所述乳酸来自产乳酸菌株的发酵培养，其特征在于，所述方法 包括步骤： (i)将产乳酸菌株的发酵液和溴甲酚绿溶液混合，得到混合溶液； (ii )将混合溶液经分光光度法检测，得到吸光值（0D值)。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合溶液中还含有缓冲液，所述缓冲液 为醋酸钠-醋酸缓冲液。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，混合溶液中，溴甲酚绿的浓度为20-100 μ M， 缓冲液浓度为5-20mM。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合溶液在酶标板或深孔板中。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶标板或深孔板为24孔、48孔或96孔。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吸光值在UV400-630nm ;较佳地为 430-620nm ;更佳地为 443nm 和 616nm。
7. 如权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤（ii)后还包括步骤 (iii):将得到的吸光值与标准溶液经分光光度法检测所得到的吸光值进行比较，从而得到 产乳酸菌株的发酵液中乳酸的量； 所述标准溶液通过下述方法得到：将乳酸溶液，溴甲酚绿溶液和醋酸缓冲液混合，得到 标准溶液。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述标准溶液中乳酸的浓度及其吸光值在 线性范围内。
9. 一种筛选高产乳酸菌株的方法，其特征在于，所述方法包括步骤： (1) 将来自不同产乳酸菌株的发酵液分别和溴甲酚绿溶液混合，得到相应的混合溶 液； (2) 将各混合溶液经分光光度法检测，得到相应的吸光值（OD值）； (3 )将不同产乳酸菌株所得到的吸光值进行比较，吸光值越小的乳酸产量越高，从而获 得高产乳酸菌株。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述混合溶液中，来自不同孔板的发酵液 浓度相同，溴甲酚绿浓度相同。
【文档编号】C12Q1/04GK104251825SQ201310261218
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】王永红, 储炬, 王光耀, 刘慧兰, 田锡炜, 李晓雪 申请人:华东理工大学