一种白念珠菌wip1基因的用途及缺失wip1基因的白念珠菌减毒株的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种白念珠菌 WIP1 基因的用途及缺失 WIP1 基因的白念珠菌减毒株。本发明公开了白念珠菌 WIP1 基因的用途，为用于制备 wip1/wip1 缺失株，或者用于制备、筛选白念珠菌治疗药物。本发明还公开了一种白念珠菌减毒株，所述减毒株中 WIP1 基因不表达。本发明通过对白念珠菌中 WIP1 基因的敲除，研究了其在白念珠菌形态转换和毒性表现中的功能，最后通过小鼠系统感染实验确立了 WIP1 在白念珠菌毒性表现中的重要功能。
【专利说明】-种白念珠菌wIP1基因的用途及缺失WIP1基因的白念珠 菌减毒株
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种白念珠菌白灰形态转换调控因子Wipi 的用途及缺失WIP1基因的白念珠菌减毒株。
【背景技术】
[0002] 白念珠菌（Candidaalbicans)是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真 菌，特别在免疫下调的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起广泛的浅 部和深部系统感染，感染部位包括口腔，女性阴道等，引起鹅口疮，阴道炎等，也可以侵 入表皮和内皮细胞进入血液而到达内脏器官，如肾脏，脑部等，导致败血症，严重可以导 致死亡（Odds,F.C. 1994.J.Am.Acad,Dermatol. 31:S2-S5.)。白念珠菌在不同的生长条 件下，有不同的生长形态，这些不同形态之间可以在一定条件下进行转换。包括酵母态 (yeastform)，和菌丝态（hyphae)，以及白菌（whitephase)和灰菌（opaquephase)之 间的转换。这种形态转化能力直接影响白念珠菌的致病能力（Odds,F.C. 1985.CritRev Microbiol. 12:45-93 ;Brown,A.J.P.etal. 1999.TrendsMicrobiol. 7:334-338.),形态转 换能力缺陷的菌株其系统感染能力大大下降或消失（Lo,H.J.etal，Cell90:939-949.)。 白-灰转换首先在临床上分离的W0-1菌株中发现。这两种形态的菌也具有不同的致病性， 白囷在系统感染中具有较强的致病能力，而灰囷在表皮感染中具有较强的致病能力。因而 白灰转换是念珠菌为了适应不同的微环境而产生的两种形态，这两种形态对于念珠菌的致 病能力有重要作用。同时，白灰转换对于白色念珠菌实现其交配也是必要的。与酿酒酵母 类似，白色念珠菌为了实现同源重组，需要经过一个交配的过程，有研究表明白念珠菌灰菌 形态交配效率大约是白菌形态的1〇 6倍，因此，白色念珠菌要实现交配，首先要进行白灰转 换，由白菌转换为灰菌形态，才可以实现交配。
[0003] 现有技术已通过功能互补的方法找到了调控白色念珠菌白灰转换的关键性因子， Worl(White-OpaqueRegulatorl)，Worl在念珠菌白灰形态转换中起着关键性的调控作.。 Northern杂交显示，Worl的表达呈现"全或无"的形式，根据这一结果，我们提出了Worl以 自激活的方式调控白灰转换的正反馈模型。
[0004] 同时，有研究表明，Worl蛋白可以结合在一系列灰菌特异性表达的基因的启动子 区域，从而调控灰菌特异性基因的转录，此外，Worl还可以结合在其自身的启动子区域，这 点也支持了我们上面提到的正反馈调控模型。
[0005] 在证实了Worl调控白灰转换的功能以后，我们想对其调控的具体机制做出研究， 例如上述"全或无"的正反馈途径是如何实现的。为此，我们利用酵母双杂交系统在白色 念珠菌的基因组文库中筛选了与Worl有相互作用的蛋白。筛库结果是得出一系列与Worl 有相互作用的蛋白，其中就包含具有特征性的SP-RING结构的Wipl，Wipl的基因全长为 1524bp，之前有报导其转座突变影响白念珠菌的丝状生长，推断含有MIZ锌指结构域，在酿 酒酵母尚未发现同源基因。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于研究白念珠菌白灰转换关键性调控因子Worl的相互作用蛋白 Wipl在白灰转换及毒性表现中的功能及作用。
[0007] 本发明首先公开了白念珠菌WIP1基因的用途，为用于制备WIP1基因不表达的白 念珠菌wipl/wipl缺失株，或者用于制备、筛选白念珠菌治疗药物。
[0008] 本发明的WIP1基因含有如SEQIDN0 :31所示的核苷酸序列，其在白念珠菌中表 达SUMOE3连接酶。
[0009] WIP1所表达的SUMOE3连接酶的氨基酸序列如SEQIDN0 :32所示。
[0010] 较优的，本发明所述wipl/wipl缺失株为白念珠菌的减毒株。在所述白念珠菌wipl/wipl缺失株中WIP1基因不表达。
[0011] 本发明所述白念珠菌治疗药物为以WIP1基因为治疗靶基因，使WIP1基因不表达 或过表达的药物、或者以WIP1基因表达的蛋白为拮抗对象的药物；或者以WIP1基因和其他 基因共同作为靶基因加以沉默的药物。以WIP1基因为靶点，筛选或制备使该基因不表达或 过表达的药物，用于使白念珠菌毒性减弱，从而治疗白念珠菌感染。例如，该白念珠菌治疗 药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使WIP1基因不表达；或者通过制备Wipl蛋白 拮抗剂，使WIP1基因表达的SUM0不发挥作用；或者通过外源导入WIP1基因，使WIP1基因 过表达。
[0012] 本发明第二方面公开了一种白念珠菌减毒株，为白念珠菌wipl/wipl缺失株，所 述减毒株中WIP1基因不表达。
[0013] 进一步的，本发明的白念珠菌减毒株属于SUMOE3连接酶基因缺失株。
[0014] 较优的，本发明所述白念珠菌WIP1/WIP1缺失株中，WIP1基因通过同源重组的方 法敲除。
[0015] 本发明第三方面公开了前述白念珠菌减毒株的构建方法，为通过同源重组的方法 对白念珠菌中WIP1基因的两个拷贝进行了敲除，具体步骤如下：
[0016] 1)敲除质粒的构建：分别用SEQIDN0 :1-2所示引物和SEQIDN0 :3-4所示引物 从白念珠菌基因组DNA中扩增WIP1上游和下游序列片段，分别反向和顺向连接入pMD18-T 的TA克隆位点得到质粒pT-FU和pT-FD;用BamHI-Kpnl将包含W0R1下游序列的片段从 pT-FD上切下插入pT-FU的相应位点得到质粒pT-FUD;将来源于pCUB6的带有BamHI-Bglll 黏性末端的HisG-URA3-HisG片段反向插入pT-FUD的相应位点得到白念珠菌WIP1基因敲 除质粒PT-WIP1K0 ;
[0017] 2)将前述敲除质粒PT-WIP1K0经Hindlll酶切后转化白念珠菌，经细胞内同源重 组得到第一拷贝WIP1敲除的单敲除菌株；
[0018] 3)用线性化的前述敲除质粒PT-WIP1K0再次转入步骤2)中第一拷贝WIP1敲除的 单敲除菌株，经细胞内同源重组得到第二拷贝WIP1敲除的wipl/wipl双缺失株。
[0019] 优选的，所述wipl/wipl双缺失株为MTLa型菌株。
[0020] 本发明第四方面公开了前述白念珠菌减毒株在研究白念珠菌白灰形态转换及毒 性功能中的应用，或者在制备或筛选白念珠菌治疗药物中的应用。
[0021] 本发明第五方面公开了含有SEQIDN0 :33所示序列的基因片段在白念珠菌形态 转换中的调控作用。
[0022] 所述白念珠菌形态转换为白灰形态转换。
[0023] 优选的，所述含有SEQIDN0 :31所示序列的基因片段为WIP1基因，其基因序列如 SEQIDN0 :31 所示。
[0024] 优选的，SEQIDN0:33所示序列编码SUMOE3连接酶的SP-RING结构域。所述 SUMOE3连接酶的SP-RING结构域的氨基酸序列如SEQIDN0 :34所示。
[0025] 含有SP-RING结构域的SUMOE3连接酶通过催化对关键性调控因子Worl的SUM0 化修饰，从而调控其功能。进一步的，Worl的第385位赖氨酸是发生SUMO化修饰的位点。
[0026] 本发明最后还公开了一种制备白念珠菌治疗药物的方法，为以白念珠菌中的WIP1 基因为靶标，沉默WIP1基因的表达；或者，使WIP1基因过表达。
[0027] 有益效果：本发明研究了白念珠菌基因WIP1对白念珠菌形态转换的调控和菌株 毒性的影响，并成功构建了一种白念珠菌减毒株，在本发明的减毒株中WIP1基因不表达。 本发明的白念珠菌菌丝生长和毒性相关因子基因WIP1和白念珠菌减毒株均可用于制备或 筛选白念珠菌治疗药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1 :WIP1基因的敲除策略
[0029] 图2 :WIP1基因敲除的SouthernBlot鉴定结果。
[0030] 图3 :Wipl表达的缺失对于白灰转换的影响
[0031] 图4 :Wipl表达的缺失对白灰转换的影响A)显示了WIP1基因过表达能够在空气 培养条件下提高白念珠菌的白灰转换效率；B)显示了WIP1基因过表达促进白灰转换的效 率，以及SP-RING结构对于这一功能的重要性
[0032] 图5 :Wip与Worl的相互作用
[0033] 图6 :Wipl介导了Worl的SUM0化修饰，该修饰发生在Worl的第385位赖氨酸
[0034] 图7 :Worl第385位赖氨酸的SUM0化修饰对于其功能的重要性
[0035] 图8 :WIP1基因的过表达和WIP1基因的缺失都减弱白念珠菌的毒性（A.低注射浓 度；B.高注射浓度）
【具体实施方式】
[0036] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
[0037] 白念珠菌（Candidaalbicans)是一种人体机会性致病真菌，可以引起广泛的感 染，但是其真正的致病因子和致病机理还没有完全研究清楚。已有研究表明，白念珠菌存在 与其致病性密切相关的两种形态转换方式：酵母-菌丝发育以及白灰形态转换。我们在研 究白灰转换时，发现了一个与白灰转换关键性调控因子Worl相互作用的蛋白，并且证明该 蛋白通过对Worl的SUM0化修饰来参与对白灰转换的调控。鉴于其与Worl的相互作用，我 们把编码该蛋白的基因命名为WIPl(WorlInteractingProteinl)。外源表达WIP1在空气 培养条件下能够促进白灰转换，而wipl/wipl缺失株则在外源W0R1诱导的白灰转换方面有 明显的滞后。功能实验证明Wipl是白念珠菌白灰形态转换的一个新的调控因子。后续的 生化研究表明，Wipl是一个SUMOE3连接酶，负责催化对关键性调控因子Worl的SUMO化 修饰，从而调控其功能。毒理实验表明Wipl参与白念珠菌致病过程和毒性表现。
[0038] 通过酵母双杂交筛选，我们得到一个编码产物能与Worl相互作用的基因，我们把 它命名为Wipl。搜索白念珠菌基因文库发现，该基因编码一个全长507aa的蛋白，其N端 有一个特征性的SP-RING结构域，该基因在酿酒酵母中未发现通源基因。先前的研究表明， SP-RING结构域是SUMOE3连接酶中的一类，Wipl的RING结构域与酵母中已鉴定的SUM0 E3连接酶中的相应结构域同源性较高。
[0039] 基本实验方法：
[0040] 方法1 :白念珠菌基因组DNA抽提
[0041] 白念珠菌培养过夜用ddH20洗1次，悬浮在500yl溶液A中（1M山梨醇，100mM EDTApH8. 0)，加入5iil20mg/ml的Zymolase，37°C放置1小时后，高速离心去上清，细胞 用 500iilofTEbuffer(20mMTris.HClpH7.5，lmMEDTA)洗一次，悬浮在 350iil ofTEbuffer中，并加入 90iilof溶液B(250mMEDTApH8.0,400mMTris.HCl pH8. 0, 2%SDS)，65°C放置30分钟，加入80illof5MKAc，冰上放置1小时，高速离心5分钟， 吸取上清并加入lml的无水乙醇，-20°C放置20分钟，高速离心5分钟，沉淀用70%乙醇洗 一次，离心后烘干。
[0042] 方法2 :白念珠菌的转化
[0043] 准备PEG / LiAc溶液（pH7. 5)10ml;在1. 5ml Eppendof管中依次加入质粒5 y g， lOii 110mg/ml鱼精DNA,混勻；加入0. lml感受态细胞和0. 6mlPEG / LiAc，votex混勻； 30°C 200rpm培养30min ;加入70 ill DMS0,轻轻混匀；42°C热冲击15min，期间不时轻轻摇 匀；冰浴2min :高速离心15s，吸掉上清，用0. 2mlTE重悬细胞；涂布于适当的营养筛选SD 平板上。
[0044] 方法3 :小鼠系统感染
[0045] 以体重在16_18gICR雄性小鼠为实验对象，通过尾静脉注射100ill白念珠菌各 种菌株，并培养观测25天。各个菌株分高低两个浓度注射，注射浓度分别为5x107细胞/ 毫升和5xl06细胞/毫升。
[0046] 实施例4 :免疫共沉淀与Western杂交
[0047] 白念珠菌表达菌株在YH)培养基中于30°C培养至饱和，按A6QQ0. 05转接于YH)培 养基中于25°C培养6h，至A6QQ为0. 6-1. 0或在YPD+10%Serum培养基中于37°C培养3. 5h， 50ml培养物离心收集，10ml无菌水洗一次。以下步骤均在4°C进行。细胞重悬于0.5ml酵 母细胞裂解液（200mMTris-HClpH8.0,400mM(NH4)2S04，10mMMgCl2，lmMEDTA，10%Glycer ol, 7mM^ -mercaptoethanol, 2mMbenzamidine,ImMPMSF, 2ug/mlpepstatinA, 2ug/ml leupeptin，4iig/mlantipain)，加入 0.4g酸洗玻璃珠（425_600iim，Sigma)。在振荡器 FP120上振3次，每次30s，间隔冰浴5min。裂解液12,OOOrpm离心5min，上清再离心5min, 收集上清并测定蛋白浓度，_70°C保存。
[0048] 取500 ii 1细胞抽提物，与等体积的IP Buffer混合，加入10 ii 1床体积的protein G agarose beads,在4°C旋转混合1小时后低速离心，吸取上清加入5 ii g的FLAG单抗，在 4°C旋转混合1小时，然后加入30 ill床体积的protein G agarose beads,继续混合2小 时。用IPBuffer洗免疫共沉淀物五次，然后重悬在2X蛋白质电泳上样缓冲液中，进行SDS-PAGE电泳。用湿法将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液 封闭膜2-3小时，一抗4°C结合过夜。用TBS-T室温洗膜1次，5分钟。用相应的二抗于室 温结合1小时，再用TBS-T洗膜四次，每次5分钟，用ECL试剂显色。
[0049] 实施例1wipl/wipl双敲除菌株的构建
[0050] 1?第一条染色体WIP1基因的敲除
[0051] 分别用引物WIP1-UF(SEQIDNO:1)、WIP1-UR(SEQIDN0 :2)和引物WIP1-DF(SEQ IDNO:3)、WIP1-DR(SEQIDNO:4)从野生型菌株SC5314基因组DNA中扩增WIP1上游和 下游序列片段，分别反向和顺向连接入PMD18-T的TA克隆位点得到质粒pT-FU和pT-FD。 用BamHI-Kpnl将包含W0R1下游序列的片段从pT-FD上切下插入pT-FU的相应位点得到质 粒pT-FUD。来源于pCUB6的带有BamHI-Bglll黏性末端的HisG-URA3-HisG片段反向插入 pT-FUD的相应位点得到白念珠菌WIP1基因敲除质粒pT-WIPIKO。
[0052] 引物序列如下：
【权利要求】
1. 白念珠菌WIP1基因的用途，为用于制备WIP1基因不表达的白念珠菌wipl/wipl缺 失株，或者用于制备、筛选白念珠菌治疗药物。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，WIP1基因含有如SEQ ID N0:31所示的核苷 酸序列。
3. -种白念珠菌减毒株，为白念珠菌wipl/wipl缺失株，所述减毒株中WIP1基因不表 达。
4. 如权利要求3所述的白念珠菌减毒株，其特征在于，所述白念珠菌减毒株为SUMO E3 连接酶基因缺失株。
5. 如权利要求4所述的白念珠菌减毒株，其特征在于，所述SUMO E3连接酶的氨基酸序 列如SEQ ID NO :32所示。
6. 权利要求3-5任一权利要求所述白念珠菌减毒株的构建方法，为通过同源重组的方 法对白念珠菌中WIP1基因的两个拷贝进行了敲除，具体步骤如下： 1) 敲除质粒的构建：分别用SEQ ID N0:l-2所示引物和SEQ ID N0:3-4所示引物从白 念珠菌基因组DNA中扩增WIP1上游和下游序列片段，分别反向和顺向连接入pMD18-T的TA 克隆位点得到质粒PT-FU和pT-FD ;用BamHI-Kpnl将包含W0R1下游序列的片段从pT-FD上 切下插入PT-FU的相应位点得到质粒pT-FUD ;将来源于pCUB6的带有BamHI-Bglll黏性末 端的HisG-URA3-HisG片段反向插入pT-FUD的相应位点得到白念珠菌WIP1基因敲除质粒 pT-ffIPIKO ； 2) 将前述敲除质粒pT-WIPIKO经Hindlll酶切后转化白念珠菌，经细胞内同源重组得 到第一拷贝WIP1敲除的单敲除菌株； 3) 用线性化的前述敲除质粒pT-WIPIKO再次转入步骤2)中第一拷贝WIP1敲除的单敲 除菌株，经细胞内同源重组得到第二拷贝WIP1敲除的wipl/wipl双缺失株。
7. 权利要求3-5任一权利要求所述白念珠菌减毒株在研究白念珠菌白灰形态转换及 毒性功能中的应用，或者在制备或筛选白念珠菌治疗药物中的应用。
8. 含有SEQ ID NO :33所示序列的基因片段在白念珠菌白灰形态转换中的调控作用。
9. 如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述含有SEQ ID NO :31所示序列的基因片 段为WIP1基因。
10. -种制备白念珠菌治疗药物的方法，为以白念珠菌中的WIP1基因为靶标，沉默 WIP1基因的表达；或者，使WIP1基因过表达。
【文档编号】C12Q1/02GK104342376SQ201310330428
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月31日 优先权日:2013年7月31日
【发明者】陈江野, 鄢明辉, 聂鑫怡, 王华峰, 高宁 申请人:中国科学院上海生命科学研究院