水稻转录因子Os09g14040基因CDS序列的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及水稻转录因子Os09g14040基因CDS序列的应用，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻转录因子Os09g14040基因CDS序列融合构建得到组成型转录因子，并转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，如增加水稻籽粒宽度。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。
【专利说明】水稻转录因子0s09g14040基因CDS序列的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子0s09gl4040基因⑶S序 列的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻（OryzasativaL.)是我国和全世界最重要的三大粮食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一个重要的功能基因研究的模式植物。与其相关的遗传学和分子 生物学研究一直倍受研究者的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。当前水 稻增产的研究较依赖于有限的水稻种质资源，传统的杂交育种优势正在逐渐减弱，而水稻 转基因技术有可能发掘水稻进一步增产的潜力。
[0003] 在植物界中，能形成种子的植物约占植物总数的三分之二以上，作为重要的繁殖 器官，种子同时也为人们提供食物来源，水稻就是其中的重要代表，种子来源于受精后的胚 珠。从分子生物学的角度来说，种子的发育和萌发是一个有次序的、选择性的基因表达过 程。而转录因子在基因表达的精确调控中起到了关键性的作用。
[0004] 近些年，有关籽粒大小性状的分子遗传调控机制研究，已取得了一定进展，如：研 究者们利用QTL定位了一些籽粒大小相关基因，其中GS3编码一个膜蛋白，是籽粒大小和 器官大小的负调控因子；张启发等（YiboLi,ChuchuanFan,QIfaZhang,etal. (2011) NaturalvariationinGS5playsanimportantroleinregulatinggrainsizeand yieldinrice.NatureGennetics)研究发现GS5编码一个调节籽粒大小的丝氨酸羧肽酶， 是控制籽粒大小的正调节因子，过表达GS5可使水稻籽粒明显变大；转录因子在调控籽粒 大小方面起着非常重要的作用，0sWRKY78可以调节水稻茎的伸长和种子的发育，0sWRKY78 突变体可以使茎杆变矮化影响籽粒发育；螺旋-环-螺旋蛋白（bHLH)类转录因子能通过调 控外稃和内稃细胞的长度影响谷粒的大小；PGLl碱性螺旋-环-螺旋蛋白（bHLH)异源二 聚体作为结合DNA的bHLH的抑制子过表达后可增加籽粒长度和重量。
[0005] VP64是4个VP16功能域基序融合在一起组成的，是一类增强子。VP16最早在动 物病毒基因中发现，现已被广泛应用到植物中，主要用于植物基因的转录调控的研究中。转 录因子在体内的作用大体上可以分成两种：一种为转录增强子，另一种为转录抑制子。当转 录因子和VP16功能域基序融合之后，它就会增强转录因子的功能，从而在转基因植株中出 现更明显的表型变化。
[0006] 目前FAR家族转录因子0s09gl4040对种子大小形状调控机制的研究及认识很少， 因此该转录因子的研究在理论上为进一步理解植物种子和器官发育调控的分子机理提供 了新的线索；在实践上也将为作物高产育种提供理论基础。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供水稻转录因子0s09gl4040基因⑶S序列的应用。
[0008] 本发明首先提供了一种组成型水稻转录因子，即融合蛋白（VP16) 4-Linker-0s09gl4040。
[0009] 其中，VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白，将4个VP16功能域基序融合在一 起可构成一类增强子，增强转录因子的功能，从而在转基因植株中出现更明显的表型变化。 上述融合蛋白中涉及的（VP16)4，即VP64是由4个VP16蛋白的氨基酸序列以Gly-Ser为间 隔形成的融合蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQIDNo. 10和4所示。
[0010] 上述融合蛋白中涉及的Linker由39个柔性氨基酸串联而成，其序列如SEQID No. 9所示，其核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示
[0011] 上述融合蛋白中涉及的水稻转录因子0s09gl4040⑶S序列的氨基酸序列如SEQID No. 2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸 序列。
[0012] 本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的载体。
[0013] 所述载体的构建方法如下：
[0014] (1)在植物转录因子数据库（http://rice,plantbiology.msu.edu/analyses_ search_locus.shtml)中找到0s09gl4040基因，根据其CDS序列设计PCR扩增引物对，其为 正向引物F:5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGCCAGATGAACTCCCG-3' 和反向引物R:5'-CAAGAAAGCT GGGTCAAAAAAAGTAAGCATGTCATACTTC-3' ；
[0015] (2)以野生日本晴水稻总cDNA为模板，进行PCR获得0s09gl4040全序列；
[0016] (3)将PCR产物克隆到连接pDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全 相同的序列；
[0017] (4)以双元表达载体左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubi promoter-VP64_Gateway表达单兀、35Spromoter-asRED表达单兀和 35Spromoter-hyg表 达单元与之融合构建，得到载体nVP64-hyg-asRED的全序列如SEQIDNo. 5所示；
[0018] (5)通过LR反应将0s09gl4040的CDS序列构建到其目地基因的N端融合了VP64 标签的植物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得获得携带有编码所述组成型水稻转录因子 VP64-Linker-0s09gl4040 基因的表达载体ubi:VP64-0s09gl4040,载体全序列如SEQID No. 6所示。
[0019] 携带有编码所述融合蛋白的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、 直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998， MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第 411-463 页； Geiserson和Corey, 1998,PlantMolecularBiology,2ndEdition)。
[0020] 本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的工程菌。
[0021] 本发明还提供一种转基因水稻植株的构建方法，具体为，采用农杆菌介导的方法， 将前述载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液。进行转化，转化后的 材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
[0022] 本发明还提供编码所述融合蛋白的基因在改良水稻籽粒性状(如增加水稻粒宽） 中的应用。
[0023] 本发明还提供了用于扩增水稻转录因子0s09gl4040基因⑶S序列的引物对，其为 正向引物F:5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGCCAGATGAACTCCCG-3' 和反向引物R:5'-CAAGAAAGCT GGGTCAAAAAAAGTAAGCATGTCATACTTC-3' 。
[0024] 本发明还进一步提供水稻转录因子0s09gl4040基因⑶S序列在调控水稻籽粒性 状中的应用。
[0025] 前述的应用，是将水稻转录因子0s09gl4040基因的CDS序列通过Gateway系统构 建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的性状。
[0026] 本发明首次利用转录因子激活基序VP64 (即4个转录因子激活基序VP16)与水稻 转录因子0s09gl4040基因CDS序列融合构建得到组成型转录因子，并转化到水稻中，从而 改良水稻籽粒性状，如水稻籽粒宽度增加。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理 论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为本发明实施例1中nVP64-hyg_asRED载体图谱。
[0028] 图2为本发明实施例1中ubi:VP64-0s09gl4040载体图谱。
[0029] 图3为本发明PCR检测VP64-0s09gl4040转基因阳性株系，其中WT为野生型水稻 'kitaake'，V1613H-05、V1613H-06 为VP64-0s09gl4040 转基因水稻株系。
[0030] 图4为本发明转基因材料籽粒性状的表型宽度的比较，其中WT为野生型水稻 'kitaake'，V1613H-05、V1613H-06 为转基因水稻株系。
[0031] 图5为本发明转基因材料籽粒性状数据统计分析，其中WT为野生型水稻 'kitaake'，V1613H-05、V1613H-06 为转基因水稻株系。
[0032] 图 6 为载体pCambial301-UbiN图谱。
[0033] 图 7 为GCS-2*FLAG+en35s-asRED-pCambial301-UbiN的构建示意图。
【具体实施方式】
[0034] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0035] 实施例10s09gl4040基因⑶S序列的分离和植物表达载体构建
[0036] 在植物转录因子数据库（h1:tp://rice·plantbiology.msu.edu/analyses_search_ locus,shtml)中找到0s09gl4040基因，根据其CDS序列设计PCR扩增引物，根据其序列设计 PCR扩增引物（F:5'-CMMMGCAGGCTTCATGCCAGATGMCTCCCG-3' 和反向引物R:5'-CMGAM GCTGGGTCMMMAGTMGCATGTCATACTTC-3,）。
[0037] 以野生型日本晴水稻总cDNA为模板，进行PCR获得0s09gl4040基因的CDS全序 列，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[0038] 2、植物表达载体的构建
[0039] 将水稻转录因子0s09gl4040基因的CDS序列通过Gateway系统构建到4个转录 因子激活基序VP16编码基因（SEQIDNo.4)的下游。
[0040] 2. 1将上述PCR产物克隆到pDONER克隆载体上
[0041] 按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮PCR，第 一轮PCR的引物用加部分adaptorattB接头的基因引物（F和R)，而第二轮的模板用第一 轮的PCR产物，并且引物用完整的adaptorattB引物（attB5'adaptor:5'-GTGGGGACAAGTT TGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3'adaptor: 5' -GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'） 。将PCR产物克隆到连接pDONER克隆载体(购自Invitrogen)上，经测序鉴定得到与目的基 因完全相同的序列。
[0042] 2. 2植物表达载体的构建
[0043] 以植物双元表达载体左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将Ubi promoter-VP64_Gateway表达单兀、35Spromoter-asRED表达单兀和 35Spromoter-hyg表 达单元与之融合构建，得到载体nVP64-hyg-asRED的全序列如SEQIDNo. 5所示，载体图谱 见图1。
[0044] 上述植物双元表达载体的构建方法为：以载体pCambial301_UbiN为骨架（图 6) ，SpeI和PstI之间的序列换成了GCS-2*FLAG，将HindIII和BstEII之间的序列换成了 35senhancer+P35s_AsRed，完成GCS-2*FLAG+en35s-AsRed-pCambial301_UbiN的构建（图 7) 。合成5'和3'端均带有KpnI酶切位点的双链DNA序列VP64-2*HA。通过KpnI位点将 片段VP64-2*HA插入到载体（图7)，最终获得表达载体nVP64-hyg-asRED-pCambial1301-Ub i。目的基因通过LR反应构建到植物表达载体上。
[0045] 表达载体均含有Gateway重组系统，pDONR带有目的基因的质粒作为入门载体 (Enteryvector),通过LR反应可完成目的基因表达载体的构建。
[0046] LR反应体系：
[0047] 表:达親体 ΙμΙ ( 30-50ng ) 入门载体（pDONR-gene > ΙμΙ (30-50ng) LR Clonase Enzyme Mix ΙμΙ (MH2O 2μ1 总计5μ1
[0048]25°C反应过夜。反应液转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。
[0049] 通过LR反应将0s09gl4040基因的CDS序列构建到其目的基因的5'端连有VP64 编码基因的植物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得携带有编码所述组成型水稻转录因 子VP64-Linker-0s09gl4040 基因的表达载体ubi:VP64-0s09gl4040,其全序列如SEQID No. 6所示，载体图谱见图2。
[0050] 实施例2转基因水稻植株的获得
[0051] 取水稻'kitaake'成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒 之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体 材料，采用农杆菌介导法将ubi:VP64-0s09gl4040转入水稻愈伤组织中，用含有100μM的 乙酰丁香酮和OD值为0. 7的农杆菌的AAM培养液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤组织置 于共培养基上进行共培养，25°C暗培养3d后置于筛选培养基上培养约30d，每IOd继代一 次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每IOd继代一次。将分化出绿 色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长出发达根系后炼苗，并计算转化所 获转基因苗数。炼苗7d后转移至大田生长。最终获得12株水稻植株，分别命名为V1613H -01/02/03/04/05/06/07/08/09/10/11/12。
[0052] 其中，诱导培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/ L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 调pH至5. 8?5. 9后加入植物凝胶4g/L。
[0053] 共培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰 胺+0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，调pH至5. 2后加入植物 凝胶4g/L。灭菌后，50°C左右加入AS(乙酰丁香酮）100?200μ8/ιΛ。
[0054] 筛选培养基配方为：Ν6大量+Β5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/ L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 调pH至5. 8?5. 9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素(购自上海纽津生物 技术有限公司）。
[0055] 分化培养基配方为：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0. 05mg/ LNAA+2.Omg/LKinetin(激动素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配 制，调pH至5. 8?5. 9后加入植物凝胶4g/L。
[0056] 实施例3转基因阳性株系的鉴定
[0057] 为检测实施例2获得的VP64_0s09gl4040转基因水稻株系在载体ubi: VP64-0s09gl4040基因在T2代转基因水稻中（V1613H-05、V1613H-06)的过表达情况，本实 施例在载体上设计引物（正向引物：5' -GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'和反向 引物：5' -GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）进行PCR检测，得到了明显的特异性条 带。由图3可见，实施例2获得的转基因水稻株系V1613H-05、V1613H-06中含有0s09gl4040 基因。上述引物是在目的基因和载体接头处设计的，图3显示扩增的片段大小与目的基因 (1179bp)基本一致。
[0058] 实施例4转基因水稻表型分析和考种分析
[0059] 将实施例2获得的转基因和野生型水稻种子进行比较，从表型上可以明显的看 出，本发明的转基因材料V1613H-05、V1613H-06的籽粒较野生型水稻'kitaake'明显变宽 (见图4)。考种数据分析表明（图5)，转基因水稻籽粒的宽显著大于野生型水稻籽粒。
[0060] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1. 一种组成型水稻转录因子，其特征在于，其为融合蛋白为（评16)4七111?51-〇8(^14040; 其中，VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白，（VP16)4是由4个VP16蛋白的氨基酸 序列以Gly-Ser为间隔形成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示；Linker由39 个柔性氨基酸串联而成；其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示；0s09gl4040为水稻转录因子 0s09gl4040的⑶S序列，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或该序列经替换、缺失或添加 一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述组成型水稻转录因子的基因。
3. 含有权利要求2所述基因的载体。
4. 含有权利要求2所述基因的工程菌。
5. -种转基因水稻植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将权利要求 3所述的载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的 材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
6. 权利要求2所述的基因在改良水稻籽粒性状中的应用。
7. 用于扩增水稻转录因子0s09gl4040基因⑶S序列的引物对， 其为正向引物 F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGCCAGATGA ACTCCCG-3' 和反向引物 R : 5' -CAAGAAAGCTGGGTCAAAAAAA GTAAGCATGTCATACTTC-3' ；其中，水稻转录因子 0s09gl4040 基因的⑶S序列为：SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
8. 水稻转录因子0s09gl4040基因的在调控水稻籽粒性状中的应用，所述水稻转录因 子0s09gl4040基因的CDS序列核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻转 录因子0s09gl4040的CDS序列融合构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录因 子的基因转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的性状； 其中，所述转录因子激活基序VP64的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。
10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子0s09gl4040基因 的⑶S序列通过Gateway系统构建到转录因子激活基序VP64编码基因的下游，转化水稻， 从而改良转基因水稻籽粒的性状； 其中，所述转录因子激活基序VP64编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
【文档编号】C12N1/21GK104341517SQ201310329896
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月31日 优先权日:2013年7月31日
【发明者】刘斌, 李宏宇, 赵涛, 刘军, 林辰涛 申请人:中国农业科学院作物科学研究所