水稻转录因子Os03g05590.1基因CDS序列的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及水稻转录因子Os03g05590.1基因CDS序列的应用，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻转录因子Os03g05590.1基因CDS序列融合构建得到组成型转录因子，并转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，如增加水稻籽粒长度。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。
【专利说明】水稻转录因子0s03g05590. 1基因CDS序列的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子0s03g05590. 1基因⑶S 序列的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻（OryzasativaL.)是我国和全世界最重要的三大粮食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一个重要的功能基因研究的模式植物。与其相关的遗传学和分子 生物学研究一直倍受研究者的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。当前水 稻增产的研究较依赖于有限的水稻种质资源，传统的杂交育种优势正在逐渐减弱，而水稻 转基因技术有可能发掘水稻进一步增产的潜力。
[0003] 在植物界中，能形成种子的植物约占植物总数的三分之二以上，作为重要的繁殖 器官，种子同时也为人们提供食物来源，水稻就是其中的重要代表，种子来源于受精后的胚 珠。从分子生物学的角度来说，种子的发育和萌发是一个有次序的、选择性的基因表达过 程。而转录因子在基因表达的精确调控中起到了关键性的作用。
[0004] 近些年，有关籽粒大小性状的分子遗传调控机制研究，已取得了一定进展，如：研 究者们利用QTL定位了一些籽粒大小相关基因，其中GS3编码一个膜蛋白，是籽粒大小和 器官大小的负调控因子；张启发等（YiboLi,ChuchuanFan,QIfaZhang,etal. (2011) NaturalvariationinGS5playsanimportantroleinregulatinggrainsizeand yieldinrice.NatureGennetics)研究发现GS5编码一个调节籽粒大小的丝氨酸羧肽酶， 是控制籽粒大小的正调节因子，过表达GS5可使水稻籽粒明显变大；转录因子在调控籽粒 大小方面起着非常重要的作用，0sWRKY78可以调节水稻茎的伸长和种子的发育，0sWRKY78 突变体可以使茎杆变矮化影响籽粒发育；螺旋-环-螺旋蛋白（bHLH)类转录因子能通过调 控外稃和内稃细胞的长度影响谷粒的大小；PGLl碱性螺旋-环-螺旋蛋白（bHLH)异源二 聚体作为结合DNA的bHLH的抑制子过表达后可增加籽粒长度和重量。
[0005] VP64是4个VP16功能域基序融合在一起组成的，是一类增强子。VP16最早在动 物病毒基因中发现，现已被广泛应用到植物中，主要用于植物基因的转录调控的研究中。转 录因子在体内的作用大体上可以分成两种：一种为转录增强子，另一种为转录抑制子。当转 录因子和VP16功能域基序融合之后，它就会增强转录因子的功能，从而在转基因植株中出 现更明显的表型变化。
[0006] AP2/EREBP转录因子在花发育和逆境胁迫应答过程中起重要作用。根据该家族基 因所含的AP2/EREBP结构域的数目不同可将其分为两类，AP2和EREBP亚家族。AP2亚家族 含有两个正向重复的AP2结构域，EREBP亚家族含有单个AP2结构域。AP2亚类基因在花器 官中表达，参花分生特性建立、花器官特性特化、花同源异型基因活性时空调节等花发育 过程。EREBP亚类基因成员参与调节植物对生物和非生物因素的胁迫应答过程。许多外界 条件，如乙烯、盐、伤害、低温、干旱等条件能诱导EREBP亚类家族基因的产生，使植物抗性， 耐性提高。目前水稻中该家族基因只有属于EREBP亚类的OsEBP-89的报道。除了OsEBP-89 之外，水稻中还存在相当数量的该家族基因。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供水稻转录因子0s03g05590. 1基因⑶S序列的应用。
[0008] 为了实现本发明的目的，本发明首先提供了一种组成型水稻转录因子，即融合蛋 白（VP16)4-Linker-0s03g05590.1。
[0009] 其中，VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白，将4个VP16功能域基序融合在一 起可构成一类增强子，增强转录因子的功能，从而在转基因植株中出现更明显的表型变化。 上述融合蛋白中涉及的（VP16)4，即VP64是由4个VP16蛋白的氨基酸序列以Gly-Ser为间 隔形成的融合蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQIDNo. 10和4所示。
[0010] 上述融合蛋白中涉及的Linker由39个柔性氨基酸串联而成，其序列如SEQID No. 9所示，其核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示
[0011] 上述融合蛋白中涉及的水稻转录因子0s03g05590. 1基因⑶S序列的氨基酸序列 如SEQIDNo. 2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列。
[0012] 本发明还提供编码所述融合蛋白的基因，以及在严格条件下，可与该基因的核苷 酸序列杂交的核苷酸序列
[0013] 本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的载体、工程菌及细胞系。
[0014] 所述载体的构建方法如下：
[0015] (1)在植物转录因子数据库中（http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_ search_locus.shtml)找到0s03g05590. 1基因，根据其序列设计PCR扩增引物对，其为正向 引物F: 5, -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGACGACAAGAGTAAG-3,和反向引物R: 5,-CAAGAAAGC TGGGTCGTAGTTCTTATCACGATAGTTGGTC-3;；
[0016] (2)以野生日本晴水稻总cDNA为模板，进行PCR获得0s03g05590. 1全序列；
[0017] (3)将PCR产物克隆到连接pDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全 相同的序列；
[0018] (4)以植物双元表达载体pCambial301_UbiN(图6)左右边界包含的序列为骨架 序列，通过体外重组，将ubipromoter-VP64-Gateway表达单兀、35Spromoter-asRED表达 单元和35Spromoter-hyg表达单元与之融合构建，得到载体nVP64-hyg-asRED的全序列如 SEQIDNo. 5 所示。
[0019] (5)通过LR反应将0s03g05590. 1基因的CDS序列构建到其目的基因的5'端连有 VP64编码基因的植物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得携带有编码所述组成型水稻转录 因子VP64-Linker-0s03g05590. 1 基因的表达载体ubi:VP64-0s03g05590. 1，载体全序列如 SEQIDNo. 6 所示。
[0020] 上述表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿 孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998,MethodforPlantMolecular BiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第 411-463 页；Geiserson和Corey，1998,Plant MolecularBiology,2ndEdition)。
[0021] 本发明还提供一种转基因水稻植株的构建方法，具体为，采用农杆菌介导的方法， 将前述载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的 材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
[0022] 本发明还提供编码所述融合蛋白的基因在改良水稻籽粒性状(如增加水稻粒长） 中的应用。
[0023] 本发明还提供了用于扩增水稻转录因子0s03g05590. 1基因⑶S序列的引物对，其 为正向引物F: 5 ' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGACGACAAGAGTAAG-3 ' 和反向引物R: 5 '-CAA GAAAGCTGGGTCGTAGTTCTTATCACGATAGTTGGTC-3 ^。
[0024] 本发明还进一步提供水稻转录因子0s03g05590. 1基因⑶S序列在调控水稻籽粒 性状中的应用。
[0025] 前述的应用，是将水稻转录因子0s03g05590. 1基因的CDS序列通过Gateway系统 构建到转录因子激活基序VP64编码基因（SEQIDNo. 4)的下游，转化水稻，从而改良转基 因水稻籽粒的性状。
[0026] 本发明首次利用转录因子激活基序VP64 (即4个转录因子激活基序VP16)与水稻 转录因子0s03g05590. 1基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到水稻中，从而改良水 稻籽粒性状，如水稻籽粒长度增加。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值， 并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为本发明实施例1中nVP64-hyg_asRED载体图谱。
[0028] 图2为本发明实施例1中ubi:VP64-0s03g05590. 1载体图谱。
[0029] 图3为本发明PCR检测VP64-0s03g05590. 1转基因阳性株系，其中WT为野生型水 稻 'kitaake'，V1734H-01、V1734H-02 为VP64-0s03g05590. 1 转基因水稻株系。
[0030] 图4为本发明转基因材料籽粒性状的表型长度的比较，其中WT为野生型水稻 'kitaake'，V1734H-01、V1734H-02 为VP64-0s03g05590. 1 转基因水稻株系。
[0031] 图5为本发明转基因材料籽粒性状数据统计分析，其中WT为野生型水稻 'kitaake'，V1734H-01、V1734H-02 为VP64-0s03g05590. 1 转基因水稻株系。
[0032] 图6为本发明实施例1中植物双元表达载体pCambial301_UbiN的图谱。
【具体实施方式】
[0033] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0034] 实施例I0s03g05590. 1基因⑶S序列的分离和植物表达载体构建
[0035] I、0s03g05590. 1 基因CDS序列的获得
[0036] 在植物转录因子数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_ search_locus.shtml)中找到0s03g05590. 1基因，根据其⑶S序列设计PCR扩增引物，根 据其序列设计PCR扩增引物（F:5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGACGACAAGAGTAAG-3^(SEQ IDNo. 7)和反向引物R:5'-CAAGAAAGCTGGGTCGTAGTTCTTATCACGATAGTTGGTCHV(SEQID No. 8)。
[0037] 以野生型日本晴水稻总cDNA为模板，进行PCR获得0s03g05590. 1基因的CDS全 序列，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[0038] 2、植物表达载体的构建
[0039] 将水稻转录因子0s03g05590. 1基因的CDS序列通过Gateway系统构建到4个转 录因子激活基序VP16编码基因（SEQIDN0.4)的下游。
[0040] 2. 1将上述PCR产物克隆到pDONER克隆载体上
[0041] 按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮PCR，第 一轮PCR的引物用加部分adaptorattB接头的基因引物（F和R)，而第二轮的模板用第一 轮的PCR产物，并且引物用完整的adaptorattB引物（attB5'adaptor:5'-GTGGGGACAAG TTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3; ,BttBSiadaptor-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAMGCTGGGT CHV)。将PCR产物克隆到连接pDONER克隆载体(购自Invitrogen)上，经测序鉴定得到与 目的基因完全相同的序列。
[0042] 2. 2植物表达载体的构建
[0043] 以植物双元表达载体pCambial301_UbiN(图6)左右边界包含的序列为骨架序列， 通过体外重组，将ubipromoter-VP64-Gateway表达单兀、35Spromoter-asRED表达单兀和 35Spromoter-hyg表达单元与之融合构建，得到载体nVP64_hyg_asRED的全序列如SEQID No. 5所示，载体图谱见图1。
[0044] 表达载体nVP64-hyg_asRED含有Gateway重组系统，pDONR带有目的基因的质粒 作为入门载体（Enteryvector),通过LR反应可完成目的基因表达载体的构建。
[0045] 通过LR反应将0s03g05590. 1基因的CDS序列构建到其目的基因的5'端连有VP64 编码基因的植物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得携带有编码所述组成型水稻转录因子 VP64-Linker-0s03g05590. 1 基因的表达载体ubi:VP64-0s03g05590. 1，其全序列如SEQID No. 6所示，载体图谱见图2。
[0046] LR反应体系如下：
[0047] 表达载体Ιμ? (30-50ng) 入门载体（pDONR-gene) 】μ? ( 30-50ng') LRClonaseEnzymeMixΙμ? CldH2O 2μΙ 总体积5μ1
[0048]于25°C反应过夜。用反应体系转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆。
[0049] 实施例2转基因水稻植株的获得
[0050] 取水稻'kitaake'成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒 之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体 材料，采用农杆菌介导法将ubi:VP64-0s03g05590. 1转入水稻愈伤组织中，用含有ΙΟΟμΜ 的乙酰丁香酮和0.D.值为0. 7的农杆菌的AAM是培养液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤 组织置于共培养基上进行共培养，25°C暗培养3d后置于筛选培养基上培养约30d，每IOd继 代一次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每IOd继代一次。将分化 出绿色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长出发达根系后炼苗，并计算转 化所获转基因苗数10株。炼苗7d后转移至大田生长。
[0051] 本实施例中涉及的培养基配方如下：
[0052] 诱导培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/L 2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调 pH至5. 8?5. 9后加入植物凝胶4g/L。
[0053] 共培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨 酰胺+〇. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，调pH至5. 2后加入植 物凝胶4g/L。灭菌后，50°C左右加入AS(乙酰丁香酮）100?200μg/mL。
[0054] 筛选培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/L 2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调 pH至5. 8?5. 9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素(购自上海纽津生物技 术有限公司）。
[0055] 分化培养基配方为：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0. 05mg/ LNAA+2.0mg/LKinetin(激动素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配 制，调pH至5. 8?5. 9后加入植物凝胶4g/L。
[0056] 实施例3转基因阳性株系的鉴定
[0057] 为检测实施例2获得的VP64_0s03g05590. 1转基因水稻株系中ubi: VP64-0s03g05590. 1基因在T2代转基因水稻（V1734H-01、V1734H-02)中的过表达情况，本 实施例在载体上设计引物（正向引物：5 ' -GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3 '和 反向引物：5 ^ -GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3 ^ )进行PCR检测，得到了 明显的 特异性条带。由图3可见，实施例2获得的转基因水稻株系V1734H-01、V1734H-02中含有 VP64-0s03g05590. 1融合基因。上述引物是在目的基因和载体接头处设计的，图3显示扩增 片段大小与目的基因（426bp)基本一致。
[0058] 实施例4转基因水稻表型分析和考种分析
[0059] 将实施例2获得的转基因水稻株系V1734H-0UV1734H-02和野生型水稻种子进行 比较，从表型上可以明显的看出，发现转基因材料的籽粒明显变长（图4)。考种数据分析表 明（图5)，本发明获得的VP64-0s03g05590. 1转基因水稻籽粒的长显著大于野生型水稻籽 粒。
[0060] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1. 一种组成型水稻转录因子，其特征在于，其为融合蛋白为（VP16)4~Linker-0s03g05590. 1 ； 其中，VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白，（VP16)4是由4个VP16蛋白的氨基酸 序列以Gly-Ser为间隔形成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示；Linker由39 个柔性氨基酸串联而成；其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示；0s03g05590. 1为水稻转录因 子0s03g05590. 1基因⑶S序列，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或该序列经替换、缺失 或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述组成型水稻转录因子的基因。
3. 含有权利要求2所述基因的载体。
4. 含有权利要求2所述基因的工程菌。
5. -种转基因水稻植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将权利要求 3所述的载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的 材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
6. 权利要求2所述的基因在改良水稻籽粒性状中的应用。
7. 用于扩增水稻转录因子0s03g05590. 1基因⑶S序列的引物对，其为正向引物F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGACGACAAGAGTAAG-3,和反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGGTC GTAGITCTTATCACGATAGITGGTC-3';其中，水稻转录因子 0s03g05590. 1 基因的 CDS 序列为： SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
8. 水稻转录因子0s03g05590. 1基因CDS序列在调控水稻籽粒性状中的应用，所述水稻 转录因子0s03g05590. 1基因CDS序列的核苷酸序列为：SEQ ID No. 1所示。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻转 录因子0s03g05590. 1的⑶S序列融合构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录 因子的基因转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的性状； 其中，所述转录因子激活基序VP64的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。
10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子0s03g05590. 1基因 的⑶S序列通过Gateway系统构建到转录因子激活基序VP64编码基因的下游，转化水稻， 从而改良转基因水稻籽粒的性状； 其中，所述转录因子激活基序VP64编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
【文档编号】C12N1/21GK104341514SQ201310329864
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月31日 优先权日:2013年7月31日
【发明者】刘军, 赵涛, 刘斌, 张春雨, 李宏宇, 林辰涛 申请人:中国农业科学院作物科学研究所