一种白念珠菌smt3基因的用途及缺失smt3基因的白念珠菌减毒株的制作方法
【专利摘要】发明涉及基因工程领域，具体涉及一种白念珠菌 SMT3 基因的用途及缺失 SMT3 基因的白念珠菌减毒株。本发明公开了白念珠菌 SMT3 基因的用途，为用于制备 smt3/smt3 缺失株，或者用于制备、筛选白念珠菌治疗药物。本发明还公开了一种白念珠菌减毒株，所述减毒株中 SMT3 基因不表达。本发明通过对白念珠菌中 SMT3 基因的敲除，研究了其在细胞周期以及形态发生及转换过程中的功能，最后通过小鼠系统感染实验确立了 SMT3 在白念珠菌毒性表现中的重要功能。
【专利说明】-种白念珠菌SMT3基因的用途及缺失SMT3基因的白念珠 菌减毒株
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种白念珠菌SUM0的SMT3基因的用途及缺 失SMT3基因的白念珠菌减毒株。
【背景技术】
[0002] 白念珠菌（Candidaalbicans)是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真 菌，特别在免疫下调的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起广泛的浅 部和深部系统感染，感染部位包括口腔，女性阴道等，引起鹅口疮，阴道炎等，也可以侵 入表皮和内皮细胞进入血液而到达内脏器官，如肾脏，脑部等，导致败血症，严重可以导 致死亡（Odds,F.C. 1994.J.Am.Acad,Dermatol. 31:S2-S5.)。白念珠菌在不同的生长条 件下，有不同的生长形态，这些不同形态之间可以在一定条件下进行转换。包括酵母态 (yeastform)，和菌丝态（hyphae)，以及白菌（whitephase)和灰菌（opaquephase)之 间的转换。这种形态转化能力直接影响白念珠菌的致病能力（Odds,F.C. 1985.CritRev Microbiol. 12:45-93;Brown,A.J.P.etal. 1999.TrendsMicrobiol. 7:334-338.),形态转 换能力缺陷的菌株其系统感染能力大大下降或消失（Lo,H.J.etal，Cell90:939-949.)。 白-灰转换首先在临床上分离的W0-1菌株中发现。这两种形态的菌也具有不同的致病性， 白囷在系统感染中具有较强的致病能力，而灰囷在表皮感染中具有较强的致病能力。因而 白灰转换是念珠菌为了适应不同的微环境而产生的两种形态，这两种形态对于念珠菌的致 病能力有重要作用。同时，白灰转换对于白色念珠菌实现其交配也是必要的。与酿酒酵母 类似，白色念珠菌为了实现同源重组，需要经过一个交配的过程，有研究表明白念珠菌灰菌 形态交配效率大约是白菌形态的1〇 6倍，因此，白色念珠菌要实现交配，首先要进行白灰转 换，由白菌转换为灰菌形态，才可以实现交配。
[0003] 现有技术已通过功能互补的方法找到了调控白色念珠菌白灰转换的关键性因子， Worl(White-OpaqueRegulatorl)，Worl在念珠菌白灰形态转换中起着关键性的调控作 用。在随后的Worl调控网络研究中，我们通过酵母双杂交筛选并且鉴定了一些与之相互作 用的蛋白，其中包括两个含有特征性的SP-RING结构的SUMOE3连接酶。
[0004] SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier,小泛素相关修饰物）是二十多年前 发现的一种可逆的蛋白翻译后修饰，在此之后，许多参与SUM0化修饰以及去SUM0化过程的 酶被发现和鉴定。与此同时，对于SUM0化底物的寻找也得出一系列可以发生SUM0化修饰 的蛋白，这些蛋白参与到细胞功能的各个环节。
[0005] SUM0化修饰是一个高度动态化的过程，其结果因具体蛋白而异，包括改变蛋白的 定位，调控蛋白的活性，以及在某些情况下影响蛋白的稳定性。乍一看这些结果似乎没有什 么共同性；但其实这些结果都源自SUM0化修饰对于蛋白质的相互作用特性的改变。
[0006] SUM0在酿酒酵母中的研究已经很成熟，但在白念珠菌中的已有研究还比较鲜见。
[0007] StephenW.Martin等人对白念珠菌细胞周期中Septin的行为进行了研究。他 们的研究表明，虽然白念珠菌中Septin不发生SUMO化修饰，但SUMO却特异性地定位于Septin;进一步的研究表明，Septin的一个组分Cdcll能够与一个SUMO化的蛋白结合，从 而使其定位于Septin。
[0008] MichelleD.Leach等人在白念珠菌中发现了大约30个SUMO化修饰的革巴蛋白，其 中大多数是具有典型的SUM0化修饰模式W-K-X-E，这些蛋白主要涉及到对外界各种刺激 的应答过程。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于通过基因敲除的方法，研究SMT3基因在细胞周期、形态发生及 转换过程中的功能，并且提供一种缺失SMT3基因的白念珠菌减毒株。
[0010] 本发明首先公开了白念珠菌SMT3基因的用途，为用于制备SMT3基因不表达的白 念珠菌smt3/smt3缺失株，或者用于制备、筛选白念珠菌治疗药物。
[0011] 本发明的SMT3基因含有如SEQIDN0:18所示的核苷酸序列，其在白念珠菌中编 码SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier泛素相关小修饰蛋白）。
[0012] 较优的，所述SUM0蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0 :19所示。
[0013] 较优的，本发明所述smt3/smt3缺失株为白念珠菌的减毒株。在所述白念珠菌 smt3/smt3缺失株中SMT3基因不表达。
[0014] 本发明所述白念珠菌治疗药物为以SMT3基因为治疗靶基因，使SMT3基因不表达 的药物、或者以SMT3基因表达的蛋白（SUM0)为拮抗对象的药物；或者以SMT3基因和其他 基因共同作为靶基因加以沉默的药物。通过以SMT3基因为靶点，筛选或制备使该基因不表 达的药物，用于使白念珠菌的毒性减弱，从而治疗白念珠菌感染。例如，该白念珠菌治疗药 物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使SMT3基因不表达；或者通过制备SMT3蛋白拮 抗剂，使SMT3基因表达的SUM0不发挥作用。
[0015] 本发明第二方面公开了一种白念珠菌减毒株，为白念珠菌smt3/smt3缺失株，所 述减毒株中SMT3基因不表达。
[0016] 进一步的，本发明的白念珠菌减毒株属于泛素相关小修饰蛋白基因缺失株。
[0017] 较优的，本发明所述白念珠菌smt3/smt3缺失株中，SMT3基因通过同源重组的方 法敲除。与野生型白念珠菌相比，本发明的减毒株在生长方面出现严重缺陷，即便是在丰富 培养基中也只能缓慢生长，并且伴随菌落及细胞形态方面的异常。同时，在白灰转换实验 中，smt3/smt3对促进白灰转换的刺激条件不敏感，白灰转换效率比同样处理的野生型显著 降低，而且形成的灰菌菌落不稳定，在低温条件下也能转换到白菌状态或者丝状生长状态。
[0018] 本发明第三方面公开了前述白念珠菌减毒株的构建方法，为通过同源重组的方法 对白念珠菌中SMT3基因的两个拷贝进行了敲除，具体步骤如下：
[0019] 1) SMT3基因第一个拷贝的敲除：采用SEQ ID N0 :1-2所示序列的引物从白念珠 菌野生型菌株基因组DNA中扩增SMT3的上游序列片段，利用Xhol+PstI酶切连接到载体 PCUB6中，得到质粒pK0-SMT3Up ;然后以SEQ ID N0:3-4所示序列的引物从白念珠菌野生型 菌株基因组中扩增得到SMT3的下游序列I，以BamHI+Notl酶切连接到前述pK0-SMT3Up 中，得到敲除质粒PSMT3K0 I ;将所述敲除质粒pSMT3K0 I酶切后转化白念珠菌，经细胞内 同源重组得到第一拷贝SMT3敲除的单敲除菌株；
[0020] 2)SMT3基因第二个拷贝的敲除：采用SEQIDNO:1-2所示序列的引物从白念珠 菌野生型菌株基因组DNA中扩增SMT3的上游序列片段，利用Xhol+PstI酶切连接到载体 PCUB6中，得到质粒pK0-SMT3Up;然后以SEQIDN0:3、5所示序列的引物从白念珠菌野生型 菌株基因组中扩增得到SMT3的下游序列II，以BamHI+Notl酶切连接到前述pK0-SMT3Up 中，得到敲除质粒PSMT3K0II;将所述敲除质粒pSMT3K0II酶切后转化白念珠菌，经细胞内 同源重组得到第二拷贝SMT3敲除的smt3/smt3双敲除菌株。
[0021] 本发明第四方面公开了前述白念珠菌减毒株在研究白念珠菌生长及毒性功能中 的应用，或者在制备或筛选白念珠菌治疗药物中的应用。
[0022] 本发明最后还公开了一种制备白念珠菌治疗药物的方法，为以白念珠菌中的SMT3 基因为靶标，沉默SMT3基因的表达。
[0023] 进一步的，为以白念珠菌中的SMT3基因作为RNA干扰的靶标或者基因重组的靶 标，沉默SMT3基因的表达。
[0024] 本发明利用URA-BLAST策略对SUM0蛋白的基因SMT3进行了基因敲除。敲除后 的smt3/smt3出现严重的生长缺陷，包括生长速度缓慢，形态异常以及不均一性；同时，在 形态转换方面，smt3/smt3因为细胞分裂障碍而在非丝状生长条件下出现假菌丝生长，而在 促进白灰转换的刺激条件下，则出现明显的响应滞后，相比野生型，其白灰转换效率显著降 低。因此可以得出结论：SUM0基因在白念珠菌细胞周期、形态转换以及毒性中充当了重要 的角色。
[0025] 有益效果：本发明研究了白念珠菌基因SMT3对菌丝生长和菌株毒性的影响，并成 功构建了一种白念珠菌减毒株，在本发明的减毒株中SMT3基因不表达。本发明的白念珠菌 菌丝生长和毒性相关因子基因SMT3和白念珠菌减毒株均可用于制备或筛选白念珠菌治疗 药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1 :基因缺失菌株的鉴定
[0027] 图2 :SUM0缺失株在生长方面迟缓的实验结果
[0028] 图3 :SUM0缺失株的菌落及细胞形态的实验结果
[0029] 图4 :验证SUM0参与了Worl的翻译后修饰的实验结果
[0030] 图5 :SUM0在白念珠菌毒性方面作用的实验结果
【具体实施方式】
[0031] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
[0032] 白念珠菌（Candidaalbicans)是一种人体机会性致病真菌，可以引起广泛的感 染，但是其真正的致病因子和致病机理还没有完全研究清楚。已有研究表明，白念珠菌存在 与其致病性密切相关的两种形态转换方式：酵母-菌丝发育以及白灰形态转换。本发明利 用URA-BLAST策略对白念珠菌中唯一的SUM0基因SMT3进行了基因敲除。敲除后的smt3/ smt3在生长方面出现严重缺陷，即便是在丰富培养基中也只能缓慢生长，并且伴随菌落及 细胞形态方面的异常；同时，在白灰转换实验中，smt3/smt3对促进白灰转换的刺激条件不 敏感，白灰转换效率比同样处理的野生型显著降低，而且形成的灰菌菌落不稳定，在低温条 件下也能转换到白菌状态或者丝状生长状态。小鼠毒理实验结果表明，smt3/smt3在系统 感染中的毒力显著下降。
[0033] 本发明的白念珠菌SMT3基因可用CaSMT3表示，在不会与酿酒酵母SMT3基因混淆 的情况下也用SMT3表示，白念珠菌SMT3基因缺失株用smt3/smt3表示。
[0034] 基本实验方法：
[0035] 方法1 :白念珠菌基因组DNA抽提
[0036] 白念珠菌培养过夜用ddH20洗1次，悬浮在500yl溶液A中（1M山梨醇，100mM EDTApH8. 0)，加入5ill20mg/ml的Zymolase，37°C放置1小时后，高速离心去上清，细胞 用 500ii1ofTEbuffer(20mMTris?HC1pH7. 5，ImMEDTA)洗一次，悬浮在 350ii1of 丁已131^€61'中，并加入90111(^溶液8(2501111 ￡01六？118.0，4001111 1'1^8.11(：1?118.0，2% SDS)，65°C放置30分钟，加入80illof5MKAc，冰上放置1小时，高速离心5分钟，吸取 上清并加入lml的无水乙醇，-20°C放置20分钟，高速离心5分钟，沉淀用70%乙醇洗一次， 离心后烘干。
[0037] 方法2 :白念珠菌的转化
[0038] 准备PEG/LiAc溶液（pH7. 5)10ml;在 1. 5mlEppendof管中依次加入质粒 5yg， 10lill0mg/ml鱼精DNA，混勻；加入0.lml感受态细胞和0. 6mlPEG/LiAc，votex混勻； 30°C200rpm培养30min;加入70iUDMS0,轻轻混匀；42°C热冲击15min，期间不时轻轻摇 匀；冰浴2min:高速离心15s，吸掉上清，用0. 2mlTE重悬细胞；涂布于适当的营养筛选SD 平板上。
[0039] 方法3:小鼠系统感染
[0040] 以体重在16-18g ICR雄性小鼠为实验对象，通过尾静脉注射100 ill白念珠菌各 种菌株，并培养观测25天。各个菌株分高低两个浓度注射，注射浓度分别为5X 107细胞/ 毫升和5X106细胞/毫升。
[0041] 方法4:免疫共沉淀与Western杂交
[0042] 白念珠菌表达菌株在YH)培养基中于30°C培养至饱和，按A6QQ 0.05转接于YPD 培养基中于25°C培养6h，至A6QQ为0? 6-1. 0或在YPD+10% Serum培养基中于37°C培养 3. 5h，50ml培养物离心收集，10ml无菌水洗一次。以下步骤均在4°C进行。细胞重悬于 0? 5ml酵母细胞裂解液（200mM Tris-HCl pH8. 0, 400mM(NH4)2S04, 10mM MgCl2, ImM EDTA, 10% Glycerol, 7mM ^-mercaptoethanol, 2mM benzamidine, ImM PMSF, 2 u g/ml pepstatin A，2iig/ml leupeptin,4iig/ml antipain)，加入0.4g酸洗玻璃珠（425_600iim，Sigma)。 在振荡器FP120上振3次，每次30s，间隔冰浴5min。裂解液12, OOOrpm离心5min，上清再 离心5min，收集上清并测定蛋白浓度，-70°C保存。
[0043] 取500 ii 1细胞抽提物，与等体积的IP Buffer混合，加入10 ii 1床体积的protein G agarose beads,在4°C旋转混合1小时后低速离心，吸取上清加入5 ii g的FLAG单抗，在 4°C旋转混合1小时，然后加入30 ill床体积的protein G agarose beads,继续混合2小 时。用IP Buffer洗免疫共沉淀物五次，然后重悬在2X蛋白质电泳上样缓冲液中，进行 SDS-PAGE电泳。用湿法将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液 封闭膜2-3小时，一抗4°C结合过夜。用TBS-T室温洗膜1次，5分钟。用相应的二抗于室 温结合1小时，再用TBS-T洗膜四次，每次5分钟，用ECL试剂显色。
[0044] 实施例1 smt3/smt3双敲除白念珠菌株的构建
[0045] 通过同源重组的方法对白念珠菌中表达SUM0的SMT3基因的两个拷贝进行了敲 除。敲除株通过PCR进行了基因型鉴定，具体方法如下：
[0046] 1?第一条染色体SMT3基因的敲除
[0047] 用引物SMT3-UP-F (SEQ ID N0 :1)和引物SMT3-UP-R (SEQ ID N0 :2)从野生型 菌株SC5314基因组DNA中扩增SMT3的上游序列片段约300bp，利用Xhol + PstI酶切连 接到载体PCUB6中，得到质粒pK0-SMT3Up。再以引物SMT3-D0WN-F (SEQ ID N0:3)和引物 SMT3-D0WN-R (SEQ ID N0:4)从野生型菌株SC5314基因组中扩增得到SMT3的下游序列约 300bp，以BamHI + Notl酶切连接到pK0-SMT3Up中，得到敲除质粒pSMT3K0 I。所得质粒 经扩增后以Xhol和SstI酶切后转化入野生型菌（JYC5,来自SC5314的MTLa/a型菌)。
[0048] 2. SMT3基因第二个拷贝的敲除
[0049] 第二拷贝敲除质粒的构建与第一拷贝类似，只是为了避免第二轮转化时重组替换 掉第一轮正确敲除的基因座，用于敲除重组的SMT3下游片段扩增了400bp，具体方法如下。
[0050] 敲除质粒pSMT3K0II的构建：用引物SMT3-UP-F(SEQIDN0 :1)和SMT3-UP-R (SEQIDN0 :2)从野生型菌株SC5314基因组DNA中扩增SMT3的上游序列片段约300bp，利 用Xhol+PstI酶切连接到载体pCUB6中，得到质粒pK0-SMT3Up。再以引物SMT3-D0WN-F (SEQIDN0 :3)和引物SMT3-D0WN400-R(SEQIDN0 :5)从基因组中扩增得到SMT3的下游 序列约400bp，以BamHI+Notl酶切连接到pK0-SMT3Up中，得到敲除质粒pSMT3K0II。所 得敲除质粒经酶切后转化入步骤1所得的第一拷贝敲除的菌株，经细胞内同源重组后得到 第二拷贝SMT3敲除的smt3/smt3双敲除白念珠菌株。
[0051] 3.双拷贝缺失菌株的鉴定
[0052] 通过PCR的方法对敲除子进行鉴定：分别以SMT3基因座上游引物（SEQ IDN0:6 和SEQ IDN0A:11)、开放阅读框内引物（SEQ IDN0A:8和SEQ IDN0A:10, SEQ IDN0A:9 和SEQ IDN0A:11)以及敲除质粒引物（SEQ IDN0A:8和SEQ IDN0A:7)进行PCR鉴定，具 体鉴定结果见附图1。
[0053] 表1 SMT3敲除及鉴定所用引物
[0054]
【权利要求】
1. 白念珠菌SMT3基因的用途，为用于制备SMT3基因不表达的白念珠菌smt3/smt3缺 失株，或者用于制备、筛选白念珠菌治疗药物。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，SMT3基因含有如SEQ ID NO: 18所示的核苷 酸序列。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，SMT3基因在白念珠菌中编码泛素相关小修 饰蛋白。
4. 一种白念珠菌减毒株，为白念珠菌smt3/smt3缺失株，所述减毒株中SMT3基因不表 达。
5. 如权利要求4所述的白念珠菌减毒株，其特征在于，所述白念珠菌减毒株为泛素相 关小修饰蛋白基因缺失株。
6. 如权利要求5所述的白念珠菌减毒株，其特征在于，所述泛素相关小修饰蛋白含有 SEQ ID NO : 19所示的氨基酸序列。
7. 如权利要求4所述的白念珠菌减毒株，其特征在于，所述白念珠菌smt3/smt3缺失株 中，SMT3基因通过同源重组的方法敲除。
8. 权利要求4-7任一权利要求所述白念珠菌减毒株的构建方法，为通过同源重组的方 法对白念珠菌中SMT3基因的两个拷贝进行了敲除，具体步骤如下： 1. SMT3基因第一个拷贝的敲除：采用SEQ ID N0:l-2所示序列的引物从白念珠菌野生 型菌株基因组DNA中扩增SMT3的上游序列片段，利用Xhol + PstI酶切连接到载体pCUB6 中，得到质粒pK0-SMT3Up;然后以SEQ ID N0:3-4所示序列的引物从白念珠菌野生型菌株 基因组中扩增得到SMT3的下游序列I，以BamHI + Notl酶切连接到前述pK0-SMT3Up中， 得到敲除质粒PSMT3K0 I ;将所述敲除质粒pSMT3K0 I酶切后转化白念珠菌，经细胞内同源 重组得到第一拷贝SMT3敲除的单敲除菌株； 2. SMT3基因第二个拷贝的敲除：采用SEQ ID N0:l-2所示序列的引物从白念珠菌野生 型菌株基因组DNA中扩增SMT3的上游序列片段，利用Xhol + PstI酶切连接到载体pCUB6 中，得到质粒pK0-SMT3Up;然后以SEQ ID N0:3、5所示序列的引物从白念珠菌野生型菌株 基因组中扩增得到SMT3的下游序列II，以BamHI + Notl酶切连接到前述pK0-SMT3Up中， 得到敲除质粒PSMT3K0 II ;将所述敲除质粒pSMT3K0 II酶切后转化白念珠菌，经细胞内同源 重组得到第二拷贝SMT3敲除的smt3/smt3双敲除菌株。
9. 权利要求4-7任一权利要求所述白念珠菌减毒株在研究白念珠菌生长及毒性功能 中的应用，或者在制备或筛选白念珠菌治疗药物中的应用。
10. -种制备白念珠菌治疗药物的方法，为以白念珠菌中的SMT3基因为靶标，沉默 SMT3基因的表达。
【文档编号】C12R1/725GK104342375SQ201310330386
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月31日 优先权日:2013年7月31日
【发明者】陈江野, 鄢明辉 申请人:中国科学院上海生命科学研究院