一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种鼠伤寒沙门氏菌核酸检测方法。所述方法为：根据鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因设计特异性的引物序列，提取待测样品的DNA为模板，进行LAMP反应；对LAMP结果进行分析，若LAMP扩增结果为阳性，则待测样品含有鼠伤寒沙门氏菌。本发明提供的针对鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，具有简便、快速、特异、灵敏和经济的优点，结果判断方法简便，适合于临床或者基层实验室使用，具有广阔的应用前景。
【专利说明】—种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生化【技术领域】，涉及一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法，具体地说是一种基于环介导等温扩增技术的鼠伤寒沙门氏菌的检测方法。
【背景技术】
[0002]鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)是常见的沙门氏菌致病的血清型之一，以婴幼儿感染最常见，临床症状主要为发热、恶心、呕吐和腹泻。该菌为革兰氏阴性杆菌，属沙门氏菌B群，不形成芽孢，无荚膜，有鞭毛。该菌在自然界分布广泛，在外界环境中抵抗力较强，常温下可迅速繁殖，耐低温、干燥，不耐热，对酸、紫外线和各种化学消毒剂均敏感。该菌可分608个噬菌体型，20个不同的生化型，在自然界进化过程中，形成了哥本哈根变种、宾斯变种及O型变种三个变种。
[0003]传统鉴定鼠伤寒沙门氏菌方法主要是通过细菌分离、血清型鉴定、生化鉴定等经典方法，但经典方法有操作繁琐、耗时长、检出率低等缺陷，对该病的准确检测和及时治疗十分不利。针对鼠伤寒沙门氏菌的酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked ImmunosorbentAssay, ELISA)、免疫组化及免疫荧光等检测技术也有报道，但也不同程度地存在某些缺点。至上世纪80年代末聚合酶链反应技术诞生，极大的推动了分子生物学技术的发展，并促进了病原微生物核酸水平检测技术的发展，成为最重要的检测手段之一。但PCR技术需要复杂的温度变化、长时间的温度循环、繁琐的电泳检测，而荧光定量PCR技术需要昂贵的仪器以及繁琐的操作过程，使得该技术在基层实验室以及检疫机构推广使用受到了局限。
[0004]21世纪初，Notomi T等几位日本学者开发了一种新型的恒温扩增技术，即环介导恒温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。其原理为米用能够特异生识别靶序列上8个区域设·计的6个特异引物，利用一种具有链置换性Bst-DNA聚合酶在恒温条件(60°C -65°C )下作用几十分钟，即可完成核酸扩增反应。其扩增效率可达到IO9-1Oltl个拷贝数的数量级，并且可以通过扩增副产物焦凝酸镁沉淀产生的浊度或者显色反应进行判断反应发生与否。
[0005]LAMP技术与PCR技术相比具有相同甚至更高的灵敏度，且具有操作简便、花费低等优点。该技术使得整个检测过程在恒温水浴锅中即可完成，大幅降低了仪器成本，并且适用于大量样本同时检测。
[0006]经对现有技术的文献检索发现，尚未发明与本发明的鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测方法、核酸及引物有关的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法，该方法是一种鼠伤寒沙门氏菌的快速检测试剂盒的制备和检测方法，为食品及公共卫生安全提供科学的依据和指导作用。
[0008]本发明的主要原理为:选取鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因序列如SEQ ID NO:1所示，特异性强保守性高的区域，利用PrimerExplorer V软件进行分析,设计可以特异性识别靶基因6个不同序列的引物:两个内引物(上游内引物和下游内引物)、两个外引物(上游外引物和下游外引物)和两个环游引物(上游环引物和下游环引物)，而且内引物包含靶DNA的正义链和反义链。通过LAMP反应，在等温条件下，在45分钟内，在内外引物的作用下，可使靶DNA累积到IO11拷贝，可通过荧光染料等方法来观察扩增结果。
[0009]I鼠伤寒沙门氏菌基因的环介导等温扩增引物情况
[0010]表1:针对编码鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因的LAMP反应引物序列组成
[0011]
【权利要求】
1.一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法，其特征在于，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域，其具体步骤为: (1).根据鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因设计的环介导等温扩增引物； (2).提取待检测样品DNA及阳性对照鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因组DNA或其它鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA、或含检测靶序列的重组质粒DNA ； (3).鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测的反应体系组成如下: 2xU-LAMP 反应混合液 10 μ 1，其组成为:40mM Tris-HCl、ρΗ8.8、20mM KCl,20mM(NH4)2SO4UOmM MgS04、0.2% Triton X_100、2.4mM dNTPsU.6M 甜菜碱；10x 引物混合液 1μ I,其组成为:F3 为 2μΜ, Β3 为 2μΜ, BIP 为 12 μ M, FIP 为 12 μ Μ, LF 为 3 μ Μ, LB 为3 μ Μ,;模板DNAl μ UBst聚合酶0.75 μ 1、补水至20 μ 1，同时设置阴阳性对照扩增体系，阴阳性对照扩增体系除模板外，其余成分同上述检测反应体系； (4).特定的程序为:64.0°C 45min — 80°C 5min — -20°C保存； (5).LAMP反应结束LAMP反应结果进行的分析及判定的方法包括: ①肉眼直接观察反应浊度 ②琼脂糖凝胶电泳分析 ③肉眼观察反应液颜色的变化.所述述3种方法中可选一种或多种作为判断标准，其中: ①肉眼直接观察反应管内溶液的浊度变化:在核酸的合成过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与Mg2+结合，产生焦磷酸镁沉淀，且随反应的进行沉淀量加大，在反应结束后，可直接通过肉眼判读，反应液出现浑浊沉淀，则说明该管扩增反应为阳性；反之，则为阴性； ②琼脂糖凝胶电泳分析:取LAMP扩增产物5μ 1，在2%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下出现典型的梯状条带，则说明该管扩增反应为阳性；反之，则为阴性； ③加入1/1000的SybrgreenI染料观察反应液颜色变化或者紫外照射下检测荧光:如果含有扩增产物，反应混合液为绿色，否则保持Sybrgreen I的橙色不变；在紫外照射的条件下，能够检测到荧光则为阳性；反之，则为阴性。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，利用环介导等温扩增技术扩增鼠伤寒沙门氏菌的特定靶核酸序列区域。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的阴阳性对照扩增体系中，阳性对照模板为含有鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因组DNA或其它鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA或含检测靶序列的重组质粒DNA，阴性对照的模板为灭菌超纯水，并使用电泳分析或Sybrgreen I荧光染料紫外灯下显色同时检测阴阳对照扩增产物。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，针对鼠伤寒沙门氏菌中的Genbank登录号为NC_003197.1的STM4493基因设计环介导等温扩增特异性引物。
【文档编号】C12Q1/68GK103571943SQ201310376175
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】程安春, 黄静玮, 汪铭书, 陈孝跃 申请人:四川农业大学