湿法球磨联合酶法提取菜籽多肽的方法
【专利摘要】本发明公开了湿法球磨联合酶法提取菜籽多肽的方法，包括以下步骤：取脱脂脱壳干燥菜籽粕，粉碎过40目筛后，加入物料重量5倍的水，加入纤维素酶5-10u/g，采用球磨机在转速为250-400rpm条件下对黑豆豆粕粉进行湿法粉碎1-3h得到超细粉体悬浊液；（2）于超细粉体悬浊液中补充水量至干物浓度为50-100g/l，调整pH至7.0，加入蛋白酶40u/g，维持温度55℃、pH7.0、水解1-2h；（3）酶解液在10000rpm条件下离心15min，残渣继续加入残渣重量5-10倍的水，加入20u/g的蛋白酶，在温度55℃、pH7.0、水解1-2h，离心，合并2次上清液，即得到粗制多肽溶液。本发明纤维素溶解使得蛋白质等大分子物质更加容易水解，还可提高蛋白质的水解速率，另外，使多肽转化率大幅度提高。
【专利说明】湿法球磨联合酶法提取菜籽多肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品加工【技术领域】，涉及湿法球磨联合酶法提取菜籽多肽的方法。
【背景技术】
[0002]油菜是重要的油料作物之一，我国油菜产量居世界第一位。一般情况下，油菜籽经加工可得约3506菜籽油和65%左右菜籽柏。菜籽柏中富含粗蛋白质，粗脂肪，卵磷脂，多种维生素，氨基酸等，其蛋白质中可消化蛋白质含量可达27.8%。此外，菜籽柏中还含有较高胆碱，生物素，叶酸，烟酸及硫氨素，核黄素等B族维生素和Ca，P，Fe, Se, Cu，Zn，Mn等多种微量元素。菜籽柏的粗蛋白质含量一般在35% — 45%，为优质的全价植物蛋白，对其进行开发利用具有重要的经济意义与社会意义。但是，目前我国对菜籽柏的利用相当有限，仅用作肥料或按少量比例添加到反刍动物和淡水鱼类的养殖饲料中，这造成了一定的资源浪费。
[0003]近年来，越来越多的研究表明肽比蛋白质具有更优秀的性质。现代生物代谢研究发现:由多个氨基酸结合而成的低聚肽比游离氨基酸更容易被消化吸收，其中尤以二肽，三肽吸收为最快最好。相比于原料蛋白及相同组成的氨基酸，酶解产物多肽能表现出良好的持水力，凝胶性，表面活性等物理功能特性及抗氧化，降血脂，调节免疫力等多种生理功能，而这些是原料蛋白质和组成游离氨基酸所不具备的。因此，将菜籽柏用来加工高附加值产品，具有显著的社会意义和经济意义。
[0004]蛋白质的水解方法一般包括酸碱降解法和酶解法。酸碱法水解动物蛋白是利用蛋白质在不同PH下溶解度不同，先在极端条件下使绝大部分蛋白质溶解，去掉不溶解物，再调PH至蛋白质的等电点沉淀回收。化学降解法以其操作简单，成本低，蛋白质收率高等特点成为早期蛋白质水解的主要手段，但化学法水解蛋白质存在许多缺陷，如:(I)环境污染大；(2)水解产物成分复杂，盐分过高，使用范围受到很大限制，不适合应用于食品，保健品，化妆品等原料；(3)酸碱法难以控制反应进程，不能实现目标产物的定位水解。综合考虑，近几年已经很少采用化 学法水解蛋白质，取而代之的是酶法水解蛋白质。
[0005]蛋白酶能在温和的条件下水解食物类蛋白，不会造成大的环境污染，实现定位水解，易于实现水解进程的控制，从而使肽类的应用性和功能性变广，满足市场的需求。但是酶解蛋白质并不是一个简单的工艺过程，它涉及到很多步骤。第一步就是筛选合适的酶，因为酶不仅影响反应的速率，产物的得率，而且直接影响到产品的风味，理化特性和生理活性；第二步菜籽中蛋白的溶出，菜籽中结构是复杂的结晶结构，蛋白不易溶出，无法与酶结合水解。目前酶解过程中，主要是直接将菜籽饼粉碎水解，此过程菜籽蛋白大部分不溶于水，酶解效率低。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种条件温和，无污染，效率高，菜籽多肽制备方法，从而进一步实现提高菜籽的附加值。
[0007]为了实现上述目的，本发明提出如下技术方案:湿法球磨联合酶法提取菜籽多肽的方法，包括以下步骤:
(I)湿法微粉碎:取脱脂脱壳干燥菜籽柏，粉碎过40目筛后，以脱脂脱壳干燥菜籽柏的重量计，加入物料重量5倍的水，加入纤维素酶5-10u/g，采用球磨机在转速为250-400rpm条件下对黑豆豆柏粉进行湿法粉碎l_3h得到超细粉体悬浊液。
[0008](2)酶水解:于超细粉体悬浊液中补充水量至干物浓度为50_100g/l，调整pH至7.0,以脱脂脱壳干燥菜籽柏的重量计，加入蛋白酶40u/g，维持温度55°C、pH7.0、水解l-2h ;所述干物指脱脂脱壳干燥菜籽柏的重量。
[0009](3)酶解液在IOOOOrpm条件下离心15min,取下层残洛,继续加入残洛重量5_10倍的水，以脱脂脱壳干燥菜籽柏重量计，加入20u/g的蛋白酶，在温度55°C、pH7.0、水解l_2h，离心，合并2次上清液，即得到粗制多肽溶液。
[0010]优选的，所述步骤(I)中球磨机为行星式球磨机。
[0011]优选的，所述步骤(2)中利用质量分数为2%的氢氧化钠和质量分数为1%的盐酸调整pH。
[0012]优选的,所述步骤(2)或(3)中所述蛋白酶为Flavourzyme蛋白酶。
[0013]本发明将湿法球磨微粉碎对菜籽饼进行预处理，至中位径可至5um左右；结合蛋白酶进行水解，发现预处理多肽得率大幅度提高。通过大量试验研究，最终获得了最佳步骤。
[0014]材料:脱脂脱壳干燥菜籽柏、碱性蛋白酶。
[0015]本发明的技术方案，将球磨超微粉碎、水、纤维素酶三者联合，对脱脂菜籽柏进行超微粉碎，颗粒细化，纤维素溶解使得蛋白质等大分子物质更加容易水解，还可提闻蛋白质的水解速率，另外，使多肽转化率大幅度提高。采用双缩脲法检测溶液中多肽的含量，计算脱脂菜籽柏多肽的转化率最高可达75%。
[0016]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【具体实施方式】
[0017]下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但不能理解为对本发明的限制。
[0018]实施例1
取脱脂脱壳干燥菜籽柏(500g)，粉碎过40目筛后，置于至于玛瑙罐中，加入物料重量5倍(2500ml)的水，加入纤维素酶5u/g (共2500u)，采用行星式球磨机(XQM-20L，南京科析试验仪器研究所)在转速为400rpm条件下对黑豆豆柏粉进行湿法粉碎Ih得到超细粉体悬浊液；超细粉体悬浊液中补充水量(2500ml)至干物浓度为100g/l，利用质量分数为2%的氢氧化钠和质量分数为1%的盐酸，调整PH至7.0，以脱脂脱壳干燥菜籽柏重量计，加入Flavourzyme 蛋白酶 40u/g(共 20000u),维持温度 55°C、pH7.0、水解 2h。酶解液在 IOOOOrpm条件下离心15min，以脱脂脱壳干燥菜籽柏重量计，残渣继续加入10倍的水(共5000ml)，加入20u/g的Flavourzyme蛋白酶(共IOOOOu),在温度55°C、pH7.0、水解Ih,离心,合并2次上清液，即得到粗制多肽溶液。
[0019]粗制多肽溶液超滤分离， 截留分子量为IOKDa以下的多肽，纳滤液在一 45°C真空冷冻干燥得得菜籽多肽。将多肽溶液经过凝胶层析、离子交换层析和RT-HPLC后收集的活性组分进行醋酸纤维素薄膜电泳，电泳为一条单一条带，说明收集的活性多肽纯度较高，质谱测定其分子量为1251.2Da。
[0020]采用双缩脲法检测溶液中多肽的含量，计算脱脂菜籽柏多肽的转化率为72.11%。
[0021]检测方法:游离氨基酸采用甲醛滴定法；蛋白质采用凯氏定氮法。多肽采用双缩脲法检测。
[0022]多肽转化率计算公式:转化率=(Τ2-Τ1)/(Ρ1_Ρ2)
式中:Τ2为酶解后多肽含量；T1为酶解前多肽含量；P1为酶解前总蛋白含量；P2为酶解前酸溶性蛋白含量。
[0023]实施例2
取脱脂脱壳干燥菜籽柏(500g)，粉碎过40目筛后，置于至于玛瑙罐中，加入物料重量5倍(2500ml)的水，加入纤维素酶10u/g (共2500u)，采用行星式球磨机(XQM-20L，南京科析试验仪器研究所)在转速为400rpm条件下对黑豆豆柏粉进行湿法粉碎3h得到超细粉体悬浊液；超细粉体悬浊液中补充水量(2500ml)至干物浓度为100g/l，利用质量分数为2%的氢氧化钠和质量分数为1%的盐酸，调整PH至7.0，以脱脂脱壳干燥菜籽柏重量计，加入Flavourzyme 蛋白酶 40u/g(共 20000u),维持温度 55°C、pH7.0、水解 2h。酶解液在 IOOOOrpm条件下离心15min，以脱脂脱壳干燥菜籽柏重量计，残渣继续加入10倍(共5000ml)的水，力口入20u/g的Flavourzyme蛋白酶(共IOOOOu),在温度55°C、pH7.0、水解2h,离心,合并2次上清液，即得到粗制 多肽溶液。采用双缩脲法检测溶液中多肽的含量，计算脱脂菜籽柏多肽的转化率为75.64%ο
[0024]检测方法:游离氨基酸采用甲醛滴定法；蛋白质采用凯氏定氮法。多肽采用双缩脲法检测。
[0025]多肽转化率计算公式:转化率=(Τ2_Τ1)/ (P1-P2)
式中:Τ2为酶解后多肽含量；T1为酶解前多肽含量；P1为酶解前总蛋白含量；P2为酶解前酸溶性蛋白含量。
[0026]对比例I
采用中国专利CN102533918A中实施例1的方法制备，步骤(3)后得精制多肽溶液。采用双缩脲法检测溶液中多肽的含量，计算脱脂菜籽柏多肽的转化率为61.93%。
[0027]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【权利要求】
1.湿法球磨联合酶法提取菜籽多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)湿法微粉碎:取脱脂脱壳干燥菜籽柏，粉碎过40目筛后，以脱脂脱壳干燥菜籽柏的重量计，加入物料重量5倍的水，加入纤维素酶5-10u/g，采用球磨机在转速为250-400rpm条件下对黑豆豆柏粉进行湿法粉碎l_3h得到超细粉体悬浊液； (2)酶水解:于超细粉体悬浊液中补充水量至干物浓度为50-100g/l，调整pH至7.0，以脱脂脱壳干燥菜籽柏的重量计，加入蛋白酶40u/g，维持温度55°C、pH7.0、水解l_2h ； (3)酶解液在IOOOOrpm条件下离心15min,取下层残洛,继续加入残洛重量5_10倍的7jC,以脱脂脱壳干燥菜籽柏的重量计，加入20u/g的蛋白酶，在温度55°C、pH7.0、水解l_2h，离心，合并2次上清液，即得到粗制多肽溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中球磨机为行星式球磨机。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中利用质量分数为2%的氢氧化钠和质量分数为1%的盐酸调整pH。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)或(3)中所述蛋白酶为Flavourzyme 蛋 白酶。
【文档编号】C12P21/06GK103436581SQ201310401899
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】庄义庆, 吴琴燕, 杨敬辉 申请人:江苏丘陵地区镇江农业科学研究所