水稻胚中的特异性启动子及其应用的制作方法

水稻胚中的特异性启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种水稻胚中的特异性启动子及其应用。该启动子特别适合驱动外源基因在水稻胚中特异性表达，而在水稻的其它组织中不表达。所述启动子的表达特异性和专一性很高。本发明还提供了具有所述启动子的构建物、表达盒和载体等。含本发明启动子的转基因水稻可以特异性地改善水稻的农艺性状，有效避免外源基因导入对水稻其它组织的影响，还能在胚中特异性表达外源基因，从而获得各种相关产物。
【专利说明】水稻胚中的特异性启动子及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】。具体地说，本发明涉及一种水稻胚中的特异性启动子 及其应用。

【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界有一半人口以大米为主食，我国稻 谷年消耗量和产量占世界总量的三分之一。我国是人口大国，提高粮食产量一直是重大的 社会问题。可耕地面积的减少和人口的增加，加剧了对水稻产量和品质的要求，高产、优质 日益成为水稻研究的重点问题。水稻的基因组相对较小，是禾本科作物功能基因组研究的 模式植物。
[0003] 胚是被子植物有性生殖过程中形成的，在植物发育中具有重要生物学意义。胚的 发育始于合子，经过原胚和胚的分化发育阶段，最后达到成熟。融合形成的二倍体合子，既 保持了物种遗传的相对稳定性，又为后代中可能出现新的遗传性状、新变异提供了基础，为 研究植物遗传和育种学的提供重要理论依据。
[0004] 基因通过表达来体现其功能，维持生物体的有序生长发育和各项活动。基因的表 达调控一直是分子生物学研究的热点和中心课题之一，分为转录水平的调控，转录后水平 的调控（mRNA的加工、成熟等），翻译水平的调控等不同层面。启动子是精确启动基因表达 的"开关"，在转录水平的调控过程中扮演着重要的角色，是基因在转录水平的调控过程中， 影响基因表达水平的最直接和最有力的顺式调控原件。借助基因工程的方法，利用组织特 异性的启动子，对特定基因进行的表达研究进行调控，或者对作物进行针对性的育种改造， 都具有十分重要的应用价值。因此，研究组织特异性启动子的功能序列，对于基因的表达调 控机制的研究，具有重要意义。但是，有些基因，例如非结构基因会发生基因的移转，从而很 难找到在特定组织中特异性表达的相应启动子，再例如，有一些miRNA在组织中特异性存 在，但与结构基因相比，由于miRNA太短、匹配区域太多，真正据此找到的具备组织特异性 的miRNA启动子寥寥无几。
[0005] 综上所述，本领域急需对水稻中的组织特异性启动子进行研究，以便阐明水稻的 形态发育、代谢以及抗病抗逆等途径，进而准确有效地改变水稻的各种性状，改良水稻的品 系，更好地调控其生长发育以及产量。


【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种水稻的胚特异性启动子及其应用。
[0007] 在第一方面，本发明提供一种启动子元件，所述启动子元件选自下组：
[0008] (a)核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所不的多核苷酸；
[0009] (b)核苷酸序列与SEQ ID NO: 1所示序列的同源性彡95%(较佳地彡98%)，且具有 水稻胚中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸；
[0010] (C)如SEQ ID NO: 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60个（较佳地1-30， 更佳地1-6个）核苷酸，且具有水稻胚中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸。
[0011] 在优选的实施方式中，所述的水稻胚中特异启动功能表示所述启动子在水稻的胚 以外的组织中不具有启动功能。
[0012] 在另一优选的实施方式中，所述启动子元件的序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0013] 在第二方面，本发明提供一种构建物，所述构建物含有外源基因以及与外源基因 可操作连接的本发明第一方面所述的启动子元件。
[0014] 在优选的实施方式中，所述的外源基因在天然状态下并不存在。
[0015] 在另一优选的实施方式中，所述外源基因包括：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋 白基因、RNAi基因、microRNA基因、生物制剂基因、或植物品质相关基因。
[0016] 在另一优选的实施方式中，所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基 因、耐寒基因、耐高温基因、抗旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。
[0017] 在另一优选的实施方式中，所述的筛选标记基因选自下组：gus(i3-葡萄糖苷酸 酶）基因、hyg(潮霉素）基因 、neo (新霉素）基因、或gfp (绿色荧光蛋白）基因。
[0018] 在另一优选的实施方式中，所述的抗原蛋白基因选自下组：细菌类抗原蛋白（如 霍乱毒素 B，破伤风毒素等）、病毒类抗原蛋白（如犬细小病毒）、原生动物类抗原蛋白（如 阿米巴病原LecA)、或自身抗原蛋白（如I型糖尿病的CTB - pins抗原蛋白）。
[0019] 在另一优选的实施方式中，所述的生物制剂基因选自下组：a 2b干扰素基因、或 胰岛素样生长因子基因。
[0020] 在另一优选的实施方式中，所述的植物品质相关基因选自下组：氣基酸改良相关 基因、脂肪改良相关基因、淀粉改良相关基因、或雄性不育相关基因。
[0021] 在第三方面，本发明提供一种表达盒，所述表达盒从5'至3'依次具有下述元件： 本发明第一方面所述的启动子元件、基因 ORF序列和终止子。
[0022] 在优选的实施方式中，所述的表达盒还包括选自下组的一种或多种元件：poly (A) 元件、增强子、转运元件、或基因靶向元件。
[0023] 在第四方面，本发明提供一种载体，所述载体含有本发明第一方面所述的启动子 元件、或本发明第三方面所述的表达盒。
[0024] 在优选的实施方式中，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或植物细胞病 毒载体、穿梭载体。
[0025] 在第五方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述 的载体、或其染色体上整合有外源的本发明第一方面所述的启动子元件、或其染色体整合 有本发明第三方面所述的表达盒。
[0026] 在优选的实施方式中，所述宿主细胞的染色体具有一个或多个（如1-50个，较佳 地2-6个）拷贝的本发明第一方面所述的启动子元件、或本发明第三方面所述的表达盒。
[0027] 在另一优选的实施方式中，所述的宿主细胞选自下组：原核细胞（如大肠杆菌、链 霉菌属、或农杆菌）、低等真核细胞（如酵母细胞）、或高等真核细胞（如植物细胞）。
[0028] 在另一优选的实施方式中，所述的宿主细胞为植物细胞，更佳地为农作物、蔬菜、 或花卉的植物细胞。
[0029] 在第六方面，本发明提供本发明第一方面所述的启动子元件，本发明第二方面所 述的构建物，本发明第三方面所述的表达盒的用途，用于特异性调控外源基因在水稻胚中 的表达。
[0030] 在第六方面，本发明提供一种在水稻胚中特异性表达外源基因的方法，所述方法 包括以下步骤：
[0031] (a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作连接的本 发明第一方面所述的启动子元件；
[0032] (b)将步骤（a)得到的构建物导入水稻细胞，获得转化的水稻细胞；
[0033] (C)将步骤（b)中转化的水稻细胞再生成水稻植株，从而使所述外源基因在水稻 胚中特异性表达。
[0034] 在优选的实施方式中，所述外源基因在水稻除胚以外的其它组织中不表达或基本 不表达。
[0035] 在第八方面，本发明提供一种制备转基因水稻的方法，所述方法包括以下步骤：
[0036] (a)提供下述水稻细胞，所述水稻细胞含有本发明第四方面所述的载体、或其染 色体整合有本发明第一方面所述的启动子、或其染色体整合有本发明第三方面所述的表达 盒；
[0037] (b)将（a)的水稻细胞再生为水稻植株，从而获得转基因水稻。
[0038] 在第九方面，本发明提供一种水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎，所述水稻愈伤组 织或水稻体细胞胚胎包下述水稻细胞或由下述水稻细胞构成：所述水稻细胞含有本发明第 四方面所述的载体、或其染色体整合有本发明第一方面所述的启动子元件、或其染色体整 合有本发明第三方面所述的表达盒。
[0039] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【专利附图】

【附图说明】
[0040] 图 1 显示 了⑶S 表达载体（pBIlOL 1-P1-GUS、pBIlOL I-P2-GUS 和 pBIlOl. 1-P3-GUS)转化的转基因植株的⑶S染色结果。

【具体实施方式】
[0041] 发明人经过广泛而深入的研究，从大量的水稻基因中出乎意料地发现了一个在水 稻胚中特异性表达的启动子，从而在植物基因工程中使外源目的基因能在特定组织中高效 表达，以便实现对外源基因表达的定时、定点、定量三维精确调控，对水稻的分子生物学研 究也具有启不意义。在此基础上完成了本发明。
[0042] 发明人在水稻基因组中克隆了 3个启动子序列，将它们构建到启动GUS基因的表 达载体中，并转化野生型水稻中花11 (ZH11，参见CN101928726B或CN101880671B)。通过 ⑶S染色，成功获得水稻中胚特异性启动子-Pl (SEQ ID NO: 1):
[0043] gcggctcttggcattcctccgacgtgggtggtggtgaagaagagcttggcgccgccgccgccgccgccg ccgtagaagccgtcattgtcgaggacgccgacgcctggaagctttcgcgtgggggaggacatggggccgagggctgg agaggagggcaacgtcgaaggagtcttcctcggcagtccgctcctcccacgcccgcgtcgaggaaggcggcgagccg cagcagagcggcgggcagccatgccgggattggtttttcttttcttttttttttctgtgcgacggtggattgacgag cagtctcgttcgtttttgtccctccgcagttgctcgtaaatgggctgaatgggccatccttgccacgctcgtgcgat gcagaacgaaagaagcagcagcgccgtgaaatgccaatcggacgatggatcgacgcccgacgtcctatgacgttagc tgcccaacgtcagacgatctgcttccctaggtttttagctagggaacttttttttttcatctgatatgctttaagaa ctttaaacaaaaatcaaactctaccgatgaaagcgaccgcaaagtgcgaaggaggaagaagggcaagaaggggagga acccaataaggtgcgatatcaccatctctgccatctatgaagagctcgaggagatagaggtacagagggtgaggtgg agaaagcaggacccactgaccactatttttatcttcttgtttgattgacatgcggggcccacatatttttttttata tttttagttttcaattttgatgcttttatatattttttttgggggattgtactgtcacgtaggcatcatgtcaatgc catgtgggacgaatacctagtcataaggagtcacgtagacgcccatgagataaaaccggagataatacttccgaggg accttgtttacactattttttaagctaggaagggttgtatcatcatgtttttggttcaaggattaaaatcagactag gtgacaaaggggacctaaagtgaacttactgcgtatatttttccccttcattgaatctgctacttttgggggcccat tgaccagcctggcatttcgctcacttgggtcgtgtgtttcttctctgccggacaacttggtcacaaacattcatcaa aatattgtggctattatatttctcctcttttgagatacaaccataaaaagaaactaaacaattaaaattatttatga ctatcattaaactatcataaaaagaactccgaaattaacttaaaataggtttcaaattttatttttttttcctacag ccgataaaccactaagcagacggtaaaaaaactagtacttctacttaaggagagaataataagtaggactaacaacc acaaactggtaaaccggtagctacttcagactctctgccttttttagcattttaagatcccatccagactgcatcga atttacaatattctcttaaaatagctcaaaattccgtagaaattcgtctcgatgagatgtacgacatgtcctgttgc tgccgtacgtactactagtactaatctaagcggctgagcagcgccggtcgaagaaggaagagtgtttcagetcggcg agcatttgctgctgggtgtgtgcagtacgcatgttggagagggagttgtactaccaaaccttgggacaggtcagcat cgtgtactccagctttgctctccccttgtactgatggatgggcaaattggcaggctatgagatgtggtactagctag tactactgtactagcagtggaatggttcaaggcaaagacattgcgttgcgtgtgtatatatacatctcccatgtttc ttgaatcttgacgatgatggcgttggcctaaccggatttgcagtgcatcaggtaagggaaaaaggatggttagatag agagaaggggagttctgtgattggagaggagaggagacagggatgaggcagagcatgggatggggcta〇
[0044] 本文所用的术语"本发明启动子"、"水稻胚中特异表达的启动子"、"启动子PI"或 "P1"可互换使用，均表示源于水稻的启动子元件，其序列如SEQ ID NO. :1所示。
[0045] 本发明的启动子能够高效、专一地在水稻胚中特异性表达，而在其它组织中不表 达。因此，本发明的启动子可以用于特异性改善水稻的性状，避免外源基因对水稻的其它组 织产生影响。
[0046] 本文所用的术语"启动子"或"启动子区（域）"是指一种准确有效起始基因转录 功能的核酸序列，引导基因核酸序列转录为mRNA，其通常存在于目的基因编码序列的上游 (5'端），一般地，启动子或启动子区域提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子 的识别位点。
[0047] 在本文中，所述启动子或启动子区（域）包括启动子的变体,启动子变体可以通过 插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
[0048] 鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员应理解，尽管本发明的实施 例中提供的启动子Pl的序列如SEQ ID NO: 1所示，但本发明还应包括与本发明的启动子序 列（SEQ ID NO: 1)具有50%或以上（优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上， 更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的核酸，只要所述核酸也具有在水稻胚中 特异性表达的功能。"同源性"是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水 平（即序列相似性或同一性）。
[0049] 本文所用的术语"特异性表达"是指目的基因在植物中特定的时间和/或特定的 组织的表达。具体地说，本文所述的"水稻胚中特异性的表达"是指在本发明的启动子调控 下，目的基因高度特异性和专一性地在水稻胚中表达。
[0050] 本文所用的"外源的"或"异源的"是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列 之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于 该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说也是"外源的"。
[0051] 本文所用的"顺式调控元件"是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保 守性碱基序列。
[0052] 本发明的启动子可以可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子可以是 外源（异源）的。本文所述的外源基因（或目的基因）没有特别限制，可以是RNAi基因或 编码具有特定功能蛋白的基因，例如某些在农业或植物或水稻改良上有重要特性或功能的 蛋白。
[0053] 所述外源基因的代表性例子包括（但不限于）：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋 白基因及生物制剂基因、或植物品质相关基因。
[0054] 所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基因、耐寒基因、耐高温基因、抗 旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。所述的筛选标记基因选自下组：gus ( β -葡萄糖苷酸酶）基 因、hyg(潮霉素）基因 、neo (新霉素）基因、或gfp (绿色荧光蛋白）基因。所述的抗原蛋 白基因及生物制剂基因选自下组：细菌类抗原蛋白（如霍乱毒素 B，破伤风毒素等）、病毒类 抗原蛋白（如犬细小病毒）、原生动物类抗原蛋白（阿米巴病原LecA)、自身抗原蛋白（如I 型糖尿病的CTB-pins)、或生物制剂（如a 2b干扰素，胰岛素样生长因子等）。所述的植 物品质相关基因选自下组：氣基酸改良相关基因、脂肪改良相关基因、淀粉改良相关基因或 雄性不育相关基因。
[0055] 本发明还提供了一种基因表达盒，所述表达盒从5' -3'依次具有下列元件：本发 明的启动子、基因 ORF序列和终止子。优选地，所述启动子序列如SEQ ID NO. :1所示或与 SEQ ID NO. :1所示序列的同源性彡95%，较佳地彡98%，更佳地彡99%。
[0056] 本发明还提供了一种重组载体，其包含本发明的启动子和/或基因表达盒。在优 选的实施方式中，所述重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。需要 表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点，从而可操作地连接目 的基因与启动子。在另一优选的实施方式中，所述重组载体在5'到3'方向上包括：启动 子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：3'多聚核苷酸化信 号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记（二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、 潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等）；增强子；或操作子。
[0057] 用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌 质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够 在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被米用的。
[0058] 本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基 因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
[0059] 本发明的启动子、表达盒或载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋 白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵 母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体 和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主 为原核生物（如大肠杆菌）时，可以用CaCl 2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核 生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法（如显微注射、电穿孔、 脂质体包装等）。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转 化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而 获得转基因的植物。
[0060] 在优选的实施方式中，制备转基因植物的方法是：将携带可操作连接的启动子和 目的基因的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染 色体上。在本发明的实例中，所述的重组载体是带有⑶S报告基因的pBIlOl. 1双元载体， 将本发明的启动子构建到该载体中GUS基因的上游，转化植株，启动子将激活GUS基囚的表 达，所述启动受到启动子区顺式作用元件的调控，可以有效模拟基因在体内被激活转录的 状况。
[0061] β -葡萄糖苷酸酶（⑶S)能催化裂解一系列的β -葡萄糖苷，产生具有发色团或荧 光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学等方法对GUS活性进行定量和空间定位分 析。在本领域中，GUS基因已被广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，特别是其 可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。
[0062] 在本发明的具体实施例中，在本发明启动子的启动下，GUS基因可以特异地在水稻 胚中表达，而在其它组织中不表达。因此该启动子可以用于在胚中特异性改善水稻的性状， 而不使得外源基因对其它组织造成影响。
[0063] 本发明的启动子、构建物、或表达盒等可用于在水稻胚中特异表达外源基因，从而 改善水稻的农艺性状（如水稻的产量、品质），或增强水稻对不利环境（如冷冻、高温、干旱、 病毒、病菌、虫害或人工除草剂）的抵抗能力。本发明也可用于在水稻胚中特异性地生产蛋 白产物（如抗原蛋白及生物制剂），或用于研究外源基因在胚中的特定功能。
[0064] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室指南（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。
[0065] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0066] 实施例
[0067] 实施例1.水稻中胚特异性启动子的克隆
[0068] 以常规方法抽提的水稻基因组DNA为模板，利用以下引物对（SEQ ID NO. : 2和3)， 通过常规PCR方法扩增出启动子Pl :
[0069] 正向引物：GGCTGCAGCGGCTGCTGTTCTTATGGC(SEQ ID N0:2)
[0070] 反向引物：GGGATCCTGCACTGCAAATCCGGTTAG(SEQ ID N0:3)。
[0071] 发明人还通过相同的方法，利用以下不同的反向引物扩增出另外两个启动子：P2 和P3 :
[0072] 反向引物：GGGATCCGCACTGCAAATCCGGTTAG(SEQ ID N0:4)
[0073] 反向引物：GGGATCCACTGCAAATCCGGTTAG(SEQ ID N0:5)。
[0074] 实施例2.构建⑶S表达载体
[0075] 将实施例1获得的启动子序列分别与市售载体PMD19-T载体（Takara公司）连接， 并进行测序验证。然后用HindIII和BamHI双酶切pMD19-T载体，回收约2kb的启动子片 段，将该片段和含有GUS报告基因的二元载体pBI 101. I (Clontech公司，美国）分别用限制 性内切酶HindIII和BamHI进行双酶切，酶切产物通过凝胶回收后用T4-DNA连接酶进行连 接，并转化到大肠杆菌DH5a菌株中加以保存。
[0076] 获得的最终载体命名为 pBIlOL 1-P1-GUS、pBIlOL 1-P2-GUS 和 pBIlOL 1-P3-GUS。用热激转化法将重组载体 pBIlOL 1-P1-GUS、pBIlOL 1-P2-GUS 和 pBIlOL 1-P3-GUS分别转化到农杆菌GV3101菌株中，并用PCR扩增验证。
[0077] 实施例3.转基因植株的获得
[0078] 将构建好的载体pBIlOL l-Pl-GUS、pBI10L 1-P2-GUS 和 pBIlOL 1-P3-GUS 分别转 化至市售的农杆菌GV3101菌株，然后通过花浸法对野生型水稻中花11进行转化。
[0079] 实施例4.⑶S组织化学染色
[0080] 对构建的转基因植株进行GUS染色，结果如图1所示，其中，A显示了转基因植株 的根；B显示了转基因植株的茎和生长点（SAM) ;C显示了转基因植株的叶；D显示了转基因 植株的小花结构；E、F显示了转基因植株未成熟种子的幼胚；G显示了转基因植株未成熟种 子的横切面；H显示了转基因植株未成熟种子的胚乳；I显示了转基因植株未成熟种子幼胚 的横切面。
[0081] 从本实施例的结果可以明显发现，通过⑶S染色，pBIlOL 1-P2-GUS和 pBIlOL 1-P3-GUS没有明显的⑶S显色反应，而pBIlOL I-Pl-GUSl能够观察到显色部位，且 显色部位集中在幼胚中，尤其是胚的盾片面。说明Pl序列是胚特异性地正确启动GUS基因 表达的启动子。
[0082] 由此，本发明得到了在胚以及盾片中特异性表达的启动子。
[0083] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【权利要求】
1. 一种启动子元件，所述启动子元件选自下组： (a) 核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多核苷酸； (b) 核苷酸序列与SEQ ID NO: 1所示序列的同源性彡95%(较佳地彡98%)，且具有水稻 胚中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸； (c) 如SEQ ID NO: 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60个（较佳地1-30,更 佳地1-6个）核苷酸，且具有水稻胚中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸。
2. -种构建物，所述构建物含有外源基因以及与外源基因可操作连接的权利要求1所 述的启动子元件。
3. -种表达盒，所述表达盒从5'至3'依次具有下述元件：权利要求1所述的启动子 元件、基因0RF序列和终止子。
4. 一种载体，所述载体含有权利要求1所述的启动子元件、或权利要求3所述的表达 盒。
5. -种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体、或其染色体上整合有外 源的权利要求1所述的启动子元件、或其染色体整合有权利要求3所述的表达盒。
6. 权利要求1所述的启动子元件，权利要求2所述的构建物，权利要求3所述的表达盒 的用途，用于特异性调控外源基因在水稻胚中的表达。
7. -种在水稻胚中特异性表达外源基因的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作连接的权利要 求1所述的启动子元件； (b) 将步骤（a)得到的构建物导入水稻细胞，获得转化的水稻细胞； (c) 将步骤（b)中转化的水稻细胞再生成水稻植株，从而使所述外源基因在水稻胚中 特异性表达。
8. -种制备转基因水稻的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 提供下述水稻细胞，所述水稻细胞含有权利要求4所述载体、或其染色体整合有权 利要求1所述启动子、或其染色体整合有权利要求3所述表达盒； (b) 将（a)的水稻细胞再生为水稻植株，从而获得转基因水稻。
9. 一种水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎，所述水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎包下述 水稻细胞或由下述水稻细胞构成：所述水稻细胞含有权利要求4所述的载体、或其染色体 整合有权利要求1所述的启动子元件、或其染色体整合有权利要求3所述的表达盒。
【文档编号】C12N15/82GK104419707SQ201310401718
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】时振英, 戴争妍 申请人:中国科学院上海生命科学研究院