杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体的制备方法
【专利摘要】本发明涉及杆状病毒HearNPVLEF-9蛋白多克隆抗体的制备。通过设计引物克隆lef-9基因；原核表达构建重组质粒pET-28a-lef-9；将构建的重组质粒pET-28a-lef-9转化大肠杆菌BL21，构建表达LEF-9蛋白的重组菌株；对LEF-9蛋白进行诱导表达及纯化，以制备的杆状病毒HearNPVLEF-9蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清，纯化抗血清，得到多克隆抗体。通过本发明的方法，实现了原核表达杆状病毒HearNPVLEF-9蛋白，可以用于后期制备其多克隆抗体，为进一步研究LEF-9蛋白的功能特性奠定了基础。为人们对杆状病毒RNA聚合酶有一个更全面和深入的了解，为进一步利用其构建高效的体外转录系统奠定了基础。
【专利说明】杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体的制备
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗体的制备方法，特别涉及杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002]杆状病毒是昆虫的特异性病原体，是已知昆虫病毒中最大的类群，也是发现最早、研究最多且具有非常重要实用价值的昆虫病毒，杆状病毒作为高效的真核基因表达载体系统、有效的病毒杀虫剂和潜在的基因治疗载体系统受到学术界的广泛关注。
[0003]杆状病毒基因组编码多种基因，根据基因表达的时序性，杆状病毒的基因分为早期基因和晚期基因两大类。因为目前大多数证据表明，病毒基因的时序表达是通过时序之前的一组病毒基因的表达产物，直接或间接地反式激活其时序之后的一组病毒基因的转录，因而调节主要发生在转录水平上。因此作为转录病毒晚期基因的病毒RNA聚合酶就成为调节病毒早晚期基因转录表达的关键因素。
[0004]杆状病毒RNA聚合酶由病毒诱导及编码，当病毒基因组开始复制后，早期基因停止转录，病毒RNA聚合酶特异性识别含有保守序列TAAG的晚期基因启动子并开始晚期基因的转录。研究表明病毒RNA聚合酶仅由病毒编码的4个保守基因lef-4、lef_8、lef-9和P47组成，这四种蛋白构成的复合体可以在体外转录病毒晚期基因。虽然早在上世纪80年代科学家便发现了该酶的存在，但迄今为止我们对它的了解还非常有限。现已知在其四个基本组成成分中P47定位在细胞核内，是晚期基因转录的必需基因，LEF-4起mRNA加帽及锚定启动子的作用，LEF-8与聚合酶特异性识别晚期启动子有关，且推测与LEF-9共同构成了 RNA聚合酶的催化位点。
[0005]LEF-9是病毒RNA聚合酶中第二大蛋白，如果能够解析HearNPV LEF-9亚基在病毒RNA聚合酶中的功能，将使人们对杆状病毒RNA聚合酶有一个更全面和深入的了解，为进一步利用其构建闻效的真核基因表达载体系统、制备有效的病毒杀虫剂和开发基因治疗载体系统奠定基础。为了研究该蛋白，制备其多克隆抗体是一个必须的前期基础。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种制备杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体的方法，以便对LEF-9蛋白的功能特性进行研究，使人们对杆状病毒RNA聚合酶有一个更全面和深入的了解，为进一步利用其构建高效的体外转`录系统奠定基础。
[0007]本发明采用的技术方案是:杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体的制备，步骤如下:
I)lef-9 基因的克隆:设计引物 28a55F:5’ -gcgggatccatgtcgaaaacacgtggctcg—3，和 28a55R:5，-gcgaagctttcatattaaaaacatgtctagcaaatg-3>,以 HearNPV 基因组 DNA 为模版扩增lef-9完整阅读框，PCR反应条件为:94°C预变性5min ；94°C 30s, 59°C 30s, 68°C30s为一个循环，进行30个循环；最后68°C延伸7min，得到lef-9基因PCR产物；2)原核表达载体的构建:用凝胶回收试剂盒回收基因PCR产物，用"i/7dIII和Bamm双酶切，同时用相同两酶双酶切原核表达载体pET-28a，将酶切片段和载体通过T4DNA连接酶连接，构建重组质粒pET-28a-lef-9 ；
3)重组表达菌株的构建:将构建的重组质粒pET-28a-lef-9转化大肠杆菌BL21，构建表达LEF-9蛋白的重组菌株；
4)LEF-9蛋白的诱导表达及纯化:将pET-28a-lef-9阳性单菌落接种于5mLKana抗性LB培养基中，37°C振荡培养过夜，取过夜培养物按1%体积接种于2管250mL新鲜LB培养基中，37°C振荡培养3h至OD6tltlnm为0.6后，加IPTG至终浓度为0.4mmol/L,培养5h，离心收集菌体；
5)LEF-9蛋白的纯化:将步骤4中收集的菌体重悬于5ml裂解缓冲液中，_70°C反复冻融3次，超声波破碎，条件为功率200-300 W，超声3s停5s，总计20min，至菌悬液变澄清后12000 r/min离心15 min，重复3次，去除不溶性细胞碎片，获得含有LEF-9蛋白的上清液，将该上清液通过Ni2+亲和柱，再用5倍柱体积的250 mM咪唑浓度洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱下来的蛋白并测A280，当有蛋白峰时开始收集样品，直至A280又恢复至基准线，得到纯化的LEF-9蛋白；
6)多克隆抗体制备:以步骤5)得到的LEF-9蛋白为免疫原，按质量比1:1与弗氏完全佐剂混合均匀，按照常规多克隆抗体的制备方法，共免疫4次`家兔，收集血清，分离，纯化后，得到杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体。
[0008]上述获得的杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体可以用于LEF-9蛋白的检测。
[0009]本发明的有益效果是:通过本发明的方法，制备了 LEF-9蛋白的多克隆抗体，为进一步研究LEF-9蛋白的功能特性奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是重组质粒pET-28a-lef-9的构建图。
[0011]图2A是lef-9基因扩增结果的SDS-PAGE电泳图。
[0012]其中，M:分子标准；1 'lef-9基因扩增片段。
[0013]图2B 是 pET-28a-lef_9 鉴定的 SDS-PAGE 电泳图。
[0014]其中，M:分子标准；1:pET-28a-lef-9酶切结果。
[0015]图3是纯化LEF-9蛋白检测图。图中，M:分子标准；I:纯化的LEF-9蛋白。
[0016]图4是LEF-9蛋白的western blot检测图。其中,M:marker ;1:病毒LEF-9蛋白。
【具体实施方式】
[0017]实施例1 杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体的制备 具体操作方法如下:
1.lef-9基因的克隆
设计引物 28a55F:5’ -gcgggatccatgtcgaaaacacgtggctcg—3，(下划线表示位点)和 28a55R: 5，-gcgaagctttcatattaaaaacatgtctagcaaatg-3，(下划线表不/ZifldIII 位点)，以HearNPV基因组DNA为模版扩增lef-9完整阅读框，PCR反应条件为:94°C预变性5min ；94°C 30s, 59°C 30s, 68°C 30s为一个循环，进行30个循环；最后68°C延伸7min，得lef-9基因PCR产物。反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示获得1578bp片段(图2A)。
[0018]2.原核表达表达载体的构建
用凝胶回收试剂盒回收纯化lef-9基因PCR产物，用#i/7dIII和双酶切，同时用相同两酶双酶切原核表达载体pET-28a，将酶切片段和载体通过T4 DNA连接酶连接构建重组质粒pET-28a-lef_9 (图1 )，转化大肠杆菌DH5 α，卡那霉素抗性筛选阳性菌株，提取质粒，酶切鉴定阳性克隆子(图2Β)，经上海生工测序，基因序列结果为序列表SEQ ID N0.1所示，测序鉴定克隆子无突变。
[0019]3.重组表达菌株的构建
将构建成功的重组质粒pET-28a-lef-9转化大肠杆菌BL21，构建表达LEF-9蛋白的重组菌株。
[0020]4.LEF-9蛋白的诱导表达
将pET-28a-lef-9阳性单菌落接种于5mL LB培养基(Kana 50ug/mL)中，37°C振荡培养过夜。取过夜培养物按1%体积接种于2管250mL新鲜LB培养基(Kana 50ug/mL)中，37°C振荡培养3h至OD6tltlnm为0.6后，加IPTG至终浓度为0.4mmol/L,培养5h，离心收集菌体。
[0021]5.LEF-9蛋白的纯化:
将步骤4中收集的菌体重悬于5ml裂解缓冲液中，_70°C反复冻融3次，超声波破碎，条件为功率200-300 W，超声3s`停5s，总计20min，至菌悬液变澄清后12000 r/min离心15min,重复3次，去除不溶性细胞碎片，获得含有LEF-9蛋白的上清液，将该上清液通过Ni2+亲和柱，再用5倍柱体积的250 mM咪唑浓度洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱下来的蛋白并测A280,当有蛋白峰时开始收集样品，直至A280又恢复至基准线。收集的蛋白通过SDS-PAGE进行检测。得到纯化的LEF-9蛋白。
[0022]6.杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体的制备
以步骤5中得到的纯化的LEF-9蛋白为免疫原，对家兔进行免疫:将400mg的LEF-9蛋白按质量比1:1与弗氏完全佐剂混合均匀，在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射并在后大腿进行肌肉注射，每个区域大约用1/4的免疫原。两周后采用背部多点注射法，即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射免疫原，共计400mg LEF-9蛋白；再间隔2周和4周后分别于上述部位选不同点注射进行三次免疫和四次免疫；最后一次注射2周后取血，收集血清，分离，纯化后，得到杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体。
[0023]7.杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体的检测
用杆状病毒HearNPV G4株感染sf_9细胞，72小时后收集感染细胞，用制备的杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体通过western blot检测该样品，结果如图4所示,结果证明制备的杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体可以检测到病毒的LEF-9蛋白。
【权利要求】
1.杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体的制备，其特征在于步骤如下: 1)lef-9 基因的克隆:设计引物 28a55F:5’ -gcgggatccatgtcgaaaacacgtggctcg—3，和 28a55R:5，-gcgaagctttcatattaaaaacatgtctagcaaatg-3>,以 HearNPV 基因组 DNA 为模版扩增lef-9完整阅读框，PCR反应条件为:94°C预变性5min ；94°C 30s, 59°C 30s, 68°C30s为一个循环，进行30个循环；最后68°C延伸7min，得到lef-9基因PCR产物； 2)原核表达载体的构建:用凝胶回收试剂盒回收基因PCR产物，用"i/7dIII和Bamm双酶切，同时用相同两酶双酶切原核表达载体pET-28a，将酶切片段和载体通过T4DNA连接酶连接，构建重组质粒pET-28a-lef-9 ； 3)重组表达菌株的构建:将构建的重组质粒pET-28a-lef-9转化大肠杆菌BL21，构建表达LEF-9蛋白的重组菌株； 4)LEF-9蛋白的诱导表达:将pET-28a-lef-9阳性单菌落接种于5mL Kana抗性LB培养基中，37°C振荡培养过夜，取过夜培养物按1%体积接种于2管250mL新鲜LB培养基中，37°C振荡培养3h至OD6tltol为0.6后，加IPTG至终浓度为0.4mmol/L，培养5h，离心收集菌体； 5)LEF-9蛋白的纯化:将步骤4)中收集的菌体重悬于5ml裂解缓冲液中，_70°C反复冻融3次，超声波破碎，条件为功率200-300 W，超声3s停5s，总计20min，至菌悬液变澄清后12000 r/min离心15 min，重复3次，去除不溶性细胞碎片，获得含有LEF-9蛋白的上清液，将该上清液通过Ni2+亲和柱，再用5倍柱体积的250 mM咪唑浓度洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱下来的蛋白并测A280，当有蛋白峰时开始收集样品，直至A280又恢复至基准线，得到纯化的LEF-9蛋白； 6)多克隆抗体制备:以步骤5)得到的LEF-9蛋白为免疫原，按质量比1:1与弗氏完全佐剂混合均匀，按照常规多克隆抗体的制备方法，共免疫4次家兔，收集血清，分离，纯化后，得到杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体。
【文档编号】C12N15/70GK103497249SQ201310401615
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】朱春玉, 郑方亮, 于亮 申请人:辽宁大学