采用est-ssr标记进行花椰菜品种鉴定的方法
【专利摘要】本发明公开了一种采用EST-SSR标记进行花椰菜品种鉴定的方法。该方法以13份花椰菜杂交种的基因组DNA为模板，通过对花椰菜EST序列的分析，合成了66对核心EST-SSR引物。经过筛选，利用5对引物组成的标记组合可完全鉴别13份花椰菜品种的差异，该技术和标记组合能够高效准确地表达花椰菜品种间的多态性，并对花椰菜品种进行鉴定。本发明的检测方法在4h之内即可完成种子品种鉴定与遗传多样性评价工作，具有高效、准确、低成本、操作简便等优势。同时本发明的检测方法可以有效的对花椰菜种子真伪进行监控，从DNA水平揭示品种的遗传变异与亲缘关系，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为花椰菜品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术参考。
【专利说明】采用EST-SSR标记进行花椰菜品种鉴定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业的蔬菜育种与应用【技术领域】，具体涉及13份花椰菜杂交种品种 鉴定方法，是一种基于EST-SSR标记的高效、简便进行花椰菜品种鉴定的方法。
【背景技术】
[0002] 花椰菜属于甘蓝的变种，为十字花科植物，是一种很受人们欢迎的蔬菜，味道鲜 美，营养丰富，同时具有很高的药用价值，目前我国南北各地均有种植。中国市场花椰菜品 种为常规种与杂交种并存状态，同名异物及同物异名现象比较普遍，而花椰菜品种田间形 态学上的鉴别易受环境和人为因素的影响，再加上生长期长，因此进行花椰菜优良性状早 期鉴定和遗传关系研究十分必要。
[0003] 随着分子生物学技术的发展，遗传多样性不仅是表现在表型性状上的差异，更重 要的是表现在DNA水平上的差异。分子标记的发展为从DNA水平上检测品种及品系间的遗 传多样性提供了有利的工具。EST(Expressed sequence tags)即表达序列标签，是指通过 对cDNA文库随机挑取的克隆进行大规模测序所获得的cDNA的5'或3'端序列，长度一般 为150?500bp。EST计划由美国科学家Venter于1989年首次提出，并首先应用于人类基 因组的研究，之后被广泛用于植物基因组的研究。随着EST计划在不同物种间的不断扩展 和深入研究，数据库中已积累了大量的EST，为SSR标记的开发带来了新的契机，已成为SSR 标记的重要来源。为了区别于传统的gSSR，一般将来源于EST库的SSR标记称为EST-SSR 标记，该标记的显著特点是来自基因组的转录区域，同时信息量较高，开发过程既简单又快 捷，费用低、通用性好，而且效率也高。因此，EST-SSR作为共显性标记与其他分子标记相比 具有诸多优点。
[0004] 目前 EST-SSR 标记已经应用于水稻（Cho et al. ,2000)、葡萄（Scott et al.， 2000)、小麦（Gupta et al.，2003 ;Gao et al.，2004 ;Nicot et al.，2004)、黑麦（Hackauf et al·，2002)、大麦（Thiel et al·，2003)和扁桃（Xu et al·，2004)、玉米（Wang and Bowen, 1998)、甘鹿（Cordeiro et al. ,2001)等植物进行分子连锁图谱构建和遗传多样性 分析。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于公开了一种采用EST-SSR标记进行花椰菜品种鉴定的方法，为 实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
[0006] 用于花椰菜品种鉴定的EST-SSR引物，其特征在于，包括5对EST-SSR引物：
[0007] HYC33 上游引物序列：5' -AGACTTCGTCGATCCACCTG-3'，HYC33 下游引物序列： 5' -GACCTCGTCCTCCTCTTCCT-3' ；BC5 上游引物序列：5' -CAAGAGTCCAAAAGCCGAAC-3'， BC5 下游引物序列：5' -CCTTGCTTGCATCAGTTTCA-3' ；HYC10 上游引物序列： 5' -CATGAAAGGCGAAGAGAAGC-3'，HYClO 下游引物序列：5'-ACACACCCAAGGCTTGTAGG-3' ； BC20 上游引物序列：5'-CCACCATCGCTTCTCAGATT-3'，BC20 下游引物序列： 5' -GTCTCGTCAGGCCTCTTTTG-3' ；BC28 上游引物序列：5'-TAACTTCTCCCCCGTCCTCT-3'，BC28 下游引物序列：5' -GAGATGGCTACAGTGGCTCC-3'。
[0008] 本发明进一步公开了采用EST-SSR标记进行花椰菜品种鉴定的方法，其特征在于 包括如下步骤：
[0009] (1)采用权利要求1所述的EST-SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增， 其中的PCR扩增反应的总体积为10 μ L，扩增反应体系为：2X GoTaq? Master Mixes5 μ L， 上游和下游引物10 μ mol/L各0. 25 μ L，供试品种花椰菜杂交种基因组DNA模板，浓度 lOOng/μ L，1 μ L，双蒸水补足10 μ L ;PCR反应程序为95°C预变性2min，32个扩增循环 (94°C 40sec，56°C 45sec，72°C lmin) ;72°C延伸 7min，4°C保存；
[0010] (2)对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分 为：去离子水 21mL，10 X TBE3mL，40% PAG6mL，TEMED30 μ L，10%过流酰胺 300 μ L ;设定电压 250V，电泳lh，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8?lOmin，迅速水洗，NaOH显色数分 钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
[0011] ⑶通过分析EST-SSR结果，比较13份花椰菜品种间多态性位点的差异，确定引 物的多态率及多态信息量；在相同迁移率位置上进行"1，〇"标注，构建13份花椰菜品种的 SSR分析谱带数据，通过数据分析5对引物是否可对13份花椰菜品种进行完全的区分，同时 构建13份花椰菜品种的指纹图谱；
[0012] 本方法通过对13份供试花椰菜杂交种进行DNA提取、PCR扩增和EST-SSR分析， 确认了这套技术和标记组合可以表达花椰菜品种间的多态性，能够高效准确的对花椰菜品 种进行鉴定。用于对花椰菜品种进行鉴定的5对EST-SSR引物如表1所示。
[0013] 表1引物序列表如下：
[0014]
【权利要求】
1. 用于花挪菜品种鉴定的EST-SSR引物，其特征在于，包括5对EST-SSR引物： HYC33 上游引物序列；5'-AGACTTCGTCGATCCACCTG-3'，HYC33 下游引物序列： 5'-GACCTCGTCCTCCTCTTCCT-3，BC5上游引物序列；5'-CAAGAGTCCAAAAGCCGAAC-3，， BC5 下游引物序列；5' -CCTTGCTTGCATCAGTTTCA-3' ；HYC10 上游引物序列： 5, -CATGAAAGGCGAAGAGAAGC-3，，HYC10 下游引物序列；5'-ACACACCCAAGGCTTGTAGG-3,； BC20 上游引物序列；5'-CCACCATCGCTTCTCAGATT-3'，BC20 下游引物序列： 5'-GTCTCGTCAGGCCTCTTTTG-3, ；BC28 上游引物序列；5'-TAACTTCTCCCCCGTCCTCT-3，，BC28 下游引物序列；5' -GAGATGGCTACAGTGGCTCC-3'。
2. -种采用EST-SSR标记进行花挪菜品种鉴定的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 采用权利要求1所述的EST-SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其 中的PCR扩增反应的总体积为10 y L，扩增反应体系为；2X GoTaq⑥Master Mixe巧y L， 上游和下游引物10 y mol/L各0. 25 y L，供试品种花挪菜杂交种基因组DNA模板，浓度 l(K)ng/ y L，1 y L，双蒸水补足10 y L ;PCR反应程序为95 °C预变性2min ;32个扩增循环， 94°C 40sec，56°C 45sec，72°C Imin ;72°C延伸 7min，4°C保存； (2) 对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙帰醜胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为；去 离子水 21mL，10 X TBE3mL，40 % PAG6mL，TEM邸30 y L，10 % 过流醜胺 300 y L ;设定电压 250V, 电泳比，关闭电源，进行染色；染色过程；银染8?lOmin，迅速水洗，化0H显色数分钟，直至 条带清晰即可，再次水洗； (3) 通过分析EST-SSR结果，比较13份花挪菜品种间多态性位点的差异，确定引物的多 态率及多态信息量；在相同迁移率位置上进行"1，0"标注，构建13份花挪菜品种的SSR分 析谱带数据，通过数据分析5对引物是否可对13份花挪菜品种进行完全的区分，同时构建 13份花挪菜品种的指纹图谱。
【文档编号】C12N15/11GK104419762SQ201310409457
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】赵新, 刘莉莉, 王永, 王超楠, 兰青阔, 李梅, 陈锐, 朱珠, 郭永泽, 景海春 申请人:天津市农业质量标准与检测技术研究所