一种温和高效破碎大肠杆菌细胞的方法

一种温和高效破碎大肠杆菌细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种温和高效破碎大肠杆菌细胞的方法，步骤如下：大肠杆菌细胞悬浮于重悬缓冲液中，并且用10～50mMEDTA溶液于4℃处理过夜，离心收集菌体沉淀，再利用高渗缓冲液与低渗缓冲液重复处理三次，可以使大肠杆菌细胞总体破碎率达到99.2%以上。本发明细胞破碎工艺操作简便，设备要求低，易于放大生产，对大肠杆菌破碎率高，并且同时得到细胞内可溶性及不溶性成分。
【专利说明】一种温和高效破碎大肠杆菌细胞的方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及生物、医药及食品工业【技术领域】，更具体涉及一种温和高效破碎大肠杆菌细胞的方法。
【背景技术】
[0003]大肠杆菌是基因工程中最常用的一种原核微生物，已经广泛用于表达生产重组胰岛素、干扰素、白介素等多种极具医药价值的活性蛋白质产品。由于很多重组蛋白质产物都存在于大肠杆菌细胞内部，必须对大肠杆菌细胞破壁后才能使这些产物被释放出来，从而进行后续的分离纯化。因此，如何简便高效的破碎大肠杆菌细胞成为提取重组蛋白质产物的关键性步骤。
[0004]大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，其细胞壁的最外层是厚约8-lOnm的由类脂A、核心多糖和0-特异侧链所组成的脂多糖层，内层是一层肽聚糖层，这样的结构使其变得难以破碎。目前常用的破碎方法主要有机械法和非机械法两大类。机械法包括珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法和X-press法，这些方法需要珠磨破碎机和高压匀浆机等专用设备，同时伴有高能、高温、高噪音、高剪切力的四高危害，而且易使产品变性失活。非机械法中的酶法反应条件温和，有利于保持产品的活性，但是因为溶菌酶价格较高，同时溶菌酶自身也影响后续重组蛋白质的分离，限制了该法的应用；化学渗透法、渗透压法和冻融法对大肠杆菌细胞的破碎效率较低，只适用于分离一些小分子量的产物；此外，盐酸胍等化学试剂破碎细胞还容易引起重组蛋白质失活破坏，并影响随后的分离纯化步骤，因此，目前工业生产中均较少使用非机械法破碎大肠杆 菌细胞。
[0005]
【发明内容】

[0006]本发明的目的是提供一种温和高效破碎大肠杆菌细胞的方法。该方法所用工艺简单快捷，条件温和，无需复杂设备，可以使大肠杆菌细胞的破碎率达到99.5%，收集上清与沉淀可以分别得到大肠杆菌中的可溶性成分与不溶性成分。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施:
(1)配制足量重悬缓冲液(50mMTrisCl, IOOmM NaCl，pH 8.0)、高渗缓冲液(20mMTrisCl，2.5mM EDTA, pH 8.0，并加入蔗糖至其质量体积浓度为200g/L)及低渗缓冲液(20mMTrisCl,2.5mM EDTA,pH 8.0)；
(2)室温下收集大肠杆菌菌液，离心收集大肠杆菌菌体，按照每克湿重的大肠杆菌菌体用125ml重悬缓冲液的比例加入重悬缓冲液，并且使菌体悬浮均匀；
(3)向所得重悬菌液中按照菌液与EDTA溶液体积比为9:1~49:1的比例加入pH 8.0的0.5M EDTA溶液，至EDTA最终浓度达到10~50mM，混匀后于4°C静置过夜，8000rpm离心IOmin,分别收集上清液与菌体沉淀；
(4)向所得菌体沉淀中按照每克沉淀用100ml高渗缓冲液的比例加入高渗缓冲液，并使菌体悬浮均匀；放置20分钟，混匀后于6000rpm离心，收集高渗缓冲液处理后所得菌体沉淀；
(5)向高渗缓冲液处理所得菌体沉淀中按照每克沉淀用100ml低渗缓冲液的比例加入低渗缓冲液，并使菌体悬浮均匀；放置20分钟，混匀后于6000rpm离心，分别收集低渗缓冲液处理后所得上清液与菌体沉淀；
(6)继续按照步骤4、步骤5所述用高渗缓冲液与低渗缓冲液的操作流程重复处理步骤4所得菌体沉淀2次，分别收集所得上清液与菌体沉淀。
[0008]按照上述步骤处理大肠杆菌细胞，可以使其破碎率达到99.2%。合并上述各步骤所得上清液，即得大肠杆菌细胞内的可溶性成分，沉淀中为大肠杆菌细胞内的不溶性成分。
[0009]本发明具有以下优点:
I本发明所用工艺操作简单易行，破碎效果好，无需使用任何昂贵破菌仪器和设备，成本低廉，易于放大生产规模，有较好的应用潜力和实际应用价值；
2本发明所用工艺未使用任何有毒有害化学物质，确保产品质量的安全性；
3本发明所用分离步骤中无相变发生，有利于保护所需分离蛋白质产物的生物学活性。
【具体实施方式】
[0013]以下通过实施例对本发明做进一步的描述:
实施例1
室温下离心大肠杆菌菌液，收取大肠杆菌细胞菌体50毫克，按照每毫克湿重的大肠杆菌菌体用1.25ml重悬缓冲液(50mM TrisCl, IOOmM NaCl,pH 8.0)的比例加入重悬缓冲液，并且使菌体悬浮均匀；向所得重悬菌液中加入PH 8.0的0.5M EDTA溶液，至EDTA最终浓度达到IOmM,混匀后于4°C静置过夜，8000rpm离心IOmin,分别收集上清液与菌体沉淀；向所得菌体沉淀中按照每克沉淀用100ml高渗缓冲液(20mM TrisCl, 2.5mM EDTA，pH 8.0，并加入蔗糖至其质量体积浓度为200g/L)的比例加入高渗缓冲液，并使菌体悬浮均匀；放置20分钟，混匀后于6000rpm离心，收集高渗缓冲液处理后所得菌体沉淀；向高渗缓冲液处理所得菌体沉淀中按照每克沉淀用100ml低渗缓冲液(20mM TrisCl, 2.5mM EDTA,pH 8.0)的比例加入低渗缓冲液，并使菌体悬浮均匀；放置20分钟，混匀后于6000rpm离心，分别收集低渗缓冲液处理后所得上清液与菌体沉淀；向步骤4所得菌体沉淀继续按照步骤3、步骤4所述实验流程用高渗缓冲液与低渗缓冲液重复处理2次，分别收集所得上清液与菌体沉淀。
[0014]大肠杆菌细胞经上述EDTA法与渗透压法联合处理后，取Iml样品离心，离心管底部无肉眼可见的菌体细胞沉淀，同时上清显示为澄清。分别取120微升破碎前及破碎后样品，进行菌落形成实验检测，结果表明，破碎前样品形成菌落2250个，破碎后样品形成菌落18个，细胞破碎率达到99.2%。
[0015]实施例2· 室温下离心大肠杆菌菌液，收取大肠杆菌细胞菌体50毫克，按照每毫克湿重的大肠杆菌菌体用1.25ml重悬缓冲液(50mM TrisCl, IOOmM NaCl,pH 8.0)的比例加入重悬缓冲液，并且使菌体悬浮均匀；向所得重悬菌液中加入pH 8.0的0.5M EDTA溶液，至EDTA最终浓度达到50mM,混匀后于4°C静置过夜，8000rpm离心IOmin,分别收集上清液与菌体沉淀；向所得菌体沉淀中按照每克沉淀用100ml高渗缓冲液(20mM TrisCl, 2.5mM EDTA，pH 8.0，并加入蔗糖至其质量体积浓度为200g/L)的比例加入高渗缓冲液，并使菌体悬浮均匀；放置20分钟，混匀后于6000rpm离心，收集高渗缓冲液处理后所得菌体沉淀；向高渗缓冲液处理所得菌体沉淀中按照每克沉淀用100ml低渗缓冲液(20mM TrisCl, 2.5mM EDTA,pH 8.0)的比例加入低渗缓冲液，并使菌体悬浮均匀；放置20分钟，混匀后于6000rpm离心，分别收集低渗缓冲液处理后所得上清液与菌体沉淀；向步骤4所得菌体沉淀继续按照步骤3、步骤4所述实验流程用高渗缓冲液与低渗缓冲液重复处理2次，分别收集所得上清液与菌体沉淀。
[0016]大肠杆菌细胞经上述EDTA法与渗透压法联合处理后，取Iml样品离心，离心管底部无肉眼可见的菌体细胞沉淀，同时上清显示为澄清。分别取120微升破碎前及破碎后样品，进行菌落形成实验检测，结果表明，破碎前样品形成菌落2380个，破碎后样品形成菌落7个，细胞破碎率达到99.7%。`
【权利要求】
1.一种温和高效破碎大肠杆菌细胞的方法，按照下述步骤进行: (1)配制足量重悬缓冲液、高渗缓冲液及低渗缓冲液； (2)室温下收集大肠杆菌菌液，离心收集大肠杆菌菌体，按照每克湿重的大肠杆菌菌体用125ml重悬缓冲液的比例加入重悬缓冲液，并且使菌体悬浮均匀； (3)向所得重悬菌液中按照菌液与EDTA溶液体积比为9:1~49:1的比例加入pH 8.0的0.5M EDTA溶液，至EDTA最终浓度达到10~50mM，混匀后于4°C静置过夜，8000rpm离心IOmin,分别收集上清液与菌体沉淀； (4)向所得菌体沉淀中按照每克沉淀用100ml高渗缓冲液的比例加入高渗缓冲液，并使菌体悬浮均匀；放置20分钟，混匀后于6000rpm离心，收集高渗缓冲液处理后所得菌体沉淀； (5)向高渗缓冲液处理所得菌体沉淀中按照每克沉淀用100ml低渗缓冲液的比例加入低渗缓冲液，并使菌体悬浮均匀；放置20分钟，混匀后于6000rpm离心，分别收集低渗缓冲液处理后所得上清液与菌体沉淀； (6)继续按照步骤4、步骤5所述用高渗缓冲液与低渗缓冲液的操作流程重复处理步骤4所得菌体沉淀2次，分别收集所得上清液与菌体沉淀； 合并上述各步骤所得上清液，即得大肠杆菌细胞内的可溶性成分，沉淀中为大肠杆菌细胞内的不溶性成分。
2.根据权利要 求1中所述的一种温和高效破碎大肠杆菌细胞的方法，其特征在于其中所述的重悬缓冲液为50mM Tris*Cl, IOOmM NaCl, pH 8.0 ;高渗缓冲液为20mM Tris*Cl,2.5mM EDTA，pH 8.0，并加入蔗糖至其质量体积浓度为200g/L ;低渗缓冲液为20mMTris*Cl,2.5mM EDTA, pH 8.0。
【文档编号】C12R1/19GK103667064SQ201310429369
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】闻崇炜, 宁德刚 申请人:江苏大学