性控精液的分离方法
【专利摘要】本发明涉及动物繁殖领域，特别涉及性控精液的分离方法，包括以下步骤：将原精通过40-60微米过滤器第一次过滤，得到去除精子团及杂物的滤后精液；检测滤后精液的活力，得到活力为0.6-0.85的待染色滤后精液；将活力为0.6-0.85的待染色滤后精液进行染色，得到染色精液；将染色精液使用流式细胞仪分离，得到含有X染色体的精液和含有Y染色体的精液。本发明提供的性控精液的分离方法，能够保证待染色滤后精液染色的均匀性和稳定性，进而利于将含有X染色体的精液和含有Y染色体的精液高效的分离。此外，滤后精液不易出现堵塞流式细胞仪的喷嘴的现象，进而保证整个分离过程的顺畅进行。
【专利说明】性控精液的分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物繁殖领域，具体而言，涉及一种性控精液的分离方法。
【背景技术】 [0002]动物的性别控制(sex control)技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术；具体的，该技术是利用动物的含有X染色体和含有Y染色体的精液中DNA含量的差异，借助特异性染色剂染色，然后根据发出的荧光强度，通过计算机判别精子类别，再通过给精液液滴附加电荷，根据静电原理，将含有X染色体的精液和Y染色体的精液分离，并选择性的应用于动物繁殖中。
[0003]在相关技术中，将性控精液分离的方法中，常见的操作是直接将原精检测活力后染色，染色结束后分离；但是，由于原精中一般会含有较大的精子团以及一些杂物，这些精子团以及杂物常会导致原精染色不均匀，进而造成含有X染色体的精液和Y染色体的精液的分离效果不理想。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种性控精液的分离方法，以解决上述的问题。
[0005]本发明的实施例中提供的性控精液的分离方法，包括:将原精通过40-60微米过滤器第一次过滤，得到去除精子团及杂物的滤后精液；检测滤后精液的活力，得到活力为
0.6-0.85的待染色滤后精液；将活力为0.6-0.85的所述待染色滤后精液进行染色，得到染色精液；将所述染色精液使用流式细胞仪分离，得到含有X染色体的精液和含有Y染色体的精液。
[0006]本发明的实施例提供的性控精液的分离方法，在分离精液的过程中，将原精通过40微米-60微米过滤器过滤，得到去除精子团及杂物的滤后精液，然后活性检测、染色以及分离之后得到含有X染色体的精液和含有Y染色体的精液，进而实现将原精分离的整个过程。由于原精在检测之前通过40微米-60微米过滤器过滤，40微米-60微米的过滤器可以将原精中含有的精子团以及杂物过滤掉，进而在后续染色的过程中，能够保证待染色滤后精液染色的均匀性和稳定性，进而利于将含有X染色体的精液和含有Y染色体的精液高效的分离。
[0007]此外，本实施例的这种性控精液的分离方法，将原精通过40微米-60微米过滤器第一次过滤，得到去除精子团及杂物滤后精液，因此在后续分离的过程中，滤后精液不易出现堵塞流式细胞仪的喷嘴的现象，进而保证整个分离过程的顺畅进行。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1示出了本发明实施例一提供的性控精液的分离方法的流程图；
[0009]图2示出了本发明实施例二提供的性控精液的分离方法的流程图。【具体实施方式】[0010]下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
[0011]本发明的实施例中提供的性控精液的分离方法，包括以下步骤，请参考图1:
[0012]步骤101:将原精通过40-60微米过滤器进行第一次过滤，得到去除精子团及杂物的滤后精液；
[0013]在步骤101中，通过40-60微米过滤器过滤可以实现将原精中的精子团及杂物过滤的效果，进而保证后续分离过程中的通畅性，优选的，可以选取50微米过滤器实现过滤的效果。
[0014]步骤102:检测滤后精液的活力，得到活力为0.6-0.85的待染色滤后精液；
[0015]滤后精液通过活力检测之后，选择活力为0.6-0.85的滤后精液，即得到待染色的滤后精液。
[0016]步骤103:将活力为0.6-0.85的待染色滤后精液进行染色，得到染色精液；
[0017]步骤104:将染色精液使用流式细胞仪分离，得到含有X染色体的精液和含有Y染色体的精液。
[0018]具体的，染色的温度控制在32°C _36°C之间，当待染色滤后精液处于32°C _36°C之间时，其活性较高，因此，在32°C _36°C的温度区间进行染色可以保证染色的效果。
[0019]本发明的实施例提供的性控精液的分离方法，在分离精液的过程中，将原精通过40-60微米过滤器过滤，得到去除精子团及杂物的滤后精液，然后活性检测、染色以及分离之后得到含有X染色体的精液和含有Y染色体的精液，进而实现将原精分离的整个过程；由于原精在检测之前通过40-60微米过滤器过滤，40-60微米的过滤器可以将原精中含有的精子团以及杂物过滤掉，进而在后续染色的过程中，能够保证待染色滤后精液染色的均匀性和稳定性，进而利于将含有X染色体的精液和含有Y染色体的精液高效的分离。
[0020]此外，本实施例的这种性控精液的分离方法，将原精通过40-60微米过滤器第一次过滤，得到去除精子团及杂物的滤后精液，因此在后续分离的过程中，滤后精液不易出现堵塞分离仪的现象，进而保证整个分离过程的顺畅进行。
[0021]为了使得本发明实施例一的浮选方法得到更好的应用，更加有效应用到性控精液的分离工艺中，本发明还在上述实施例一的基础之上提供了实施例二，实施例二是在实施例一的基础上做出的进一步的限定和增加，现做详细的阐述和解释，请参考图2:
[0022]实施例二
[0023]步骤201:将原精通过40-60微米过滤器第一次过滤，得到去除精子团及杂物的滤后精液；
[0024]步骤202:吸取15-25微升滤后精液滴加在经过32°C _36°C预热的载玻片上保持
0.5-1.5分钟后在200-400倍显微镜下观察滤后精液的活力；
[0025]具体的，在检测活力的过程中，可以通过步骤202的操作进行；此外，在具体的测活的过程中，达到分离标准的精液可以活力为0.6-0.85，密度≥10亿/ml，为标准，对于密度6-8亿/ml之间的滤后精液，可以将其离心后使得密度达到分离的标准后进行染色操作。
[0026]步骤203:将 Staining Talp 液和 49ffigg yolk Talp 液在 32°C _36°C 的温度下分别预热10-20分钟,得到预热后的Staining Talp液和预热后的4?:gg yolk Talp液；
[0027]其中，每1000ml Staining Talp 液由 HEPES (40.0OmM) 9.520g> Magnesi u mChloride6-Hydrate crystal (0.40mM) 0.080g> Sodi u m Chloride (95.0OmM) 5.518g、Potassium Chloride (3.0OmM) 0.224g> Sodi U m Bicarbonate Di basic/Anhydrous(0.30mM)0.040g、Sodi u m Bicarbonate(10.00mM)0.840g>Pyruvic Acid(2.00mM)0.220g、Glucose (5.0OmM) 0.900g> Lactic Acid, 60%Syrup25.00(mM)3.610ml> Bovine SerumAlb V- min3.0OOg 配置而成；
[0028]具体的配置方法包括:按上述数据准确称量所需试剂依次放入盛有该配液总量3/4的超纯水烧杯中充分溶解；溶解后用NaOH溶液将pH值调为7.40 ;将溶液完全移入体积相对应的容量瓶内，用超纯水反复冲洗烧杯内壁移入容量瓶填充至刻度后充分混匀；配置完毕后用灭菌后板式过滤器进行过滤灭菌；滤后液每1000毫升液添加庆大霉素针剂2.5ml。
[0029]每1000ml4%Egg yolk Talp 液由 Staining Talp 液 957.5ml、5%FD (ml) 2.6ml、Egg_yolk40ml组成；具体的配置方法包括；将相应体积的Staining Talp液移入相应的容量瓶内，然后用移液管将5%FD加入容量瓶；用Staining Talp液填充至容量瓶的刻度后充分混匀；将用酒精消毒后的新鲜鸡蛋弃除蛋清后用无菌过滤纸去除剩余的蛋清，挤破膜将蛋黄挤入量筒至所需体积的刻度处；用封口膜封好的量筒口后充分混匀。再将溶液倒入烧杯用磁力搅拌器搅拌30分钟，5°C下静置过夜(12小时)；静置后的溶液吸去量筒上层5-10毫升液废弃，然后慢慢倾斜量筒把上清液倒入烧杯(防止将沉淀物倒入)；用HCL溶液将pH调至5.50，静置30分钟后吸去烧杯上层油状物。将剩余上清液分装入离心管，两两平衡。放入离心机内离心(5°C、10000-120(K)转/分钟、30分钟)，离心结束后吸去各个离心管上层油状物，将离心后溶液收集到试剂瓶内用灭好菌板式过滤器(上层1.2 的过滤膜，下层0.22 y m的过滤膜)过滤除菌，滤后液每1000毫升液添加庆大霉素针剂2.6ml。
[0030]步骤204:在32°C _36°C的温度下，在待染色滤后精液中加入荧光染料，混匀后得到初染精液；
[0031]在步骤204中，具体的，可以是在待染色滤后精液中加入抗生素溶液后再加入荧光染料，混匀后得到初染精液；
[0032]抗生素可以对待染色滤后精液中所含的细菌起到抑制甚至杀灭的作用，为了实现更好的效果，优选的在本实施例中，抗生素溶液为联合抗生素，包括:泰勒霉素溶液、庆大霉素溶液和由林肯霉素和壮观霉素配成的林肯-壮观溶液；并且优选的，泰勒霉素溶液、庆大霉素溶液和林肯-壮观溶液的体积比为3:3:4 ;
[0033]其中,泰勒霉素溶液的配置方法包括:准确称取泰勒菌素(tylosin) 0.19g完全溶解于IOml的2.9%的柠檬酸钠，使最终浓度为19.0mg/ml。
[0034]庆大霉素溶液的配置方法包括:准确称取庆大霉素(gentamicin) 1.0g完全溶解于10.1ml的2.9%的柠檬酸钠，使最终浓度为99.01mg/ml。
[0035]林肯-壮观溶液的配置方法包括:每毫升超纯水溶解0.05g林肯霉素(Iincomycin)和0.1g壮观霉素(spectino mycin)。根据生产需要可依据上述数据增加配液量，并分装到2毫升离心管内。
[0036]将配置好的泰乐霉素溶液、林肯-壮观溶液、庆大霉素溶液按3:3:4比例添加在一起混匀，混合好的溶液即为联合抗生素。
[0037]并且，在该步骤中，具体的，在每毫升待染色滤后精液中加入20微升抗生素溶液后再加入荧光染料混匀后得到初染精液；
[0038]以每毫升待染色滤后精液配20微升联合抗生素，这样其所能抑制的细菌种类多，并且抑制效果明显。
[0039]在步骤204中，荧光染料包括:Hoechst33342 ;Hoechst33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。因此，在本实施例中作为滤后精液的荧光染料。
[0040]步骤205:在初染精液中加入预热后的Staining Talp液后混匀，孵育40分钟-50分钟，得到孵育后的精液；
[0041]具体的，在步骤205中，具体为在初染精液中加入预热后的Staining Talp液后混匀，在32°C -36°C的水浴锅中，暗室孵育40分钟-50分钟，得到孵育后的精液；优选的，在孵育的过程中选取利用水浴锅暗室孵育的操作，水浴锅便于控制孵育温度。
[0042]步骤206:在孵育后的精液中加入预热后的4%Egg yolk Talp液后通过40微米-60微米过滤器进行第二次过滤，得到染色精液；
[0043]由于在孵育后的精液加入了 49ffigg yolk Talp，因此，为了方便后续的分离过程，防止在分离过程中出现堵塞流式细胞仪的喷嘴的现象，优选的，可以将孵育后的精液进行第二次过滤。在具体的操作中，优选50微米过滤器进行第二次过滤，而且在第二次过滤之前，需要将加入了 49ffigg yolk Talp的精液摇匀。
[0044]步骤207:将染色精液使用流式细胞仪分离，得到含有X染色体的精液和含有Y染色体的精液。`
[0045]通过流式细胞仪就可以实现将染色精液分离的过程，进而得到含有X染色体的精液和含有Y染色体的精液，并应用到可控制动物性别的繁育过程中。
[0046]此外，在上述实施例的林肯-壮观溶液中，优选的，林肯霉素与壮观霉素的浓度比为 1:2。
[0047]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.性控精液的分离方法，其特征在于，包括以下步骤: 将原精通过40-60微米过滤器第一次过滤，得到去除精子团及杂物的滤后精液； 检测所述滤后精液的活力，得到活力为0.6-0.85的待染色滤后精液； 将活力为0.6-0.85的所述待染色滤后精液进行染色，得到染色精液； 将所述染色精液使用流式细胞仪分离，得到含有X染色体的精液和含有Y染色体的精液。
2.根据权利要求1所述的性控精液的分离方法，其特征在于，在所述检测所述滤后精液的活力，得到活力为0.6-0.85的待染色滤后精液的步骤中，所述检测所述滤后精液的活力，具体包括: 吸取15-25微升滤后精液滴加在经过32°C -36°C预热的载玻片上保持0.5-1.5分钟，然后在200-400倍显微镜下观察所述滤后精液的活力。
3.根据权利要求2所述性控精液的分离方法，其特征在于，在所述将活力为0.6-0.85的所述待染色滤后精液进行染色，得到染色精液的步骤中，具体包括: 将Staining Talp液和49ffigg yolk Talp液分别在32°C _36°C的温度下预热10-20分钟，得到预热后的Staining Talp液和预热后的4?:gg yolk Talp液； 在32°C -36°C的温度下，在所述待染色滤后精液中加入荧光染料，混匀后得到初染精液； 在所述初染精液中加入所述预热后的Staining Talp液后混匀，孵育40分钟-50分钟，得到孵育后的精液； 在所述孵育后的精液中加入所述预热后的49ffigg yolk Talp液，摇匀后得到所述染色精液。
4.根据权利要求3所述的性控精液的分离方法，其特征在于，在32°C_36°C的温度下，在所述待染色滤后精液中加入荧光染料，混匀后得到初染精液的步骤，具体包括: 在所述待染色滤后精液中加入抗生素溶液后再加入荧光染料，混匀后得到所述初染精液。
5.根据权利要求4所述的性控精液的分离方法，其特征在于，所述抗生素溶液包括泰勒霉素溶液、庆大霉素溶液和由林肯霉素和壮观霉素配成的林肯-壮观溶液； 其中，所述泰勒霉素溶液、所述庆大霉素溶液和所述林肯-壮观溶液的体积比为3:3:4。
6.根据权利要求4所述的性控精液的分离方法，其特征在于，在所述待染色滤后精液中加入抗生素溶液后再加入荧光染料，混匀后得到所述初染精液的步骤中，具体包括: 在每毫升所述待染色滤后精液中加入20微升所述抗生素溶液后再加入荧光染料混匀后得到所述初染精液。
7.根据权利要求4所述的性控精液的分离方法，其特征在于，在所述待染色滤后精液中加入抗生素溶液后再加入荧光染料，混匀后得到所述初染精液的步骤中； 所述荧光染料包括:Hoechst33342。
8.根据权利要求3所述的性控精液的分离方法，其特征在于，在所述初染精液中加入所述预热后的 Staining Talp液后混匀,孵育40分钟-50分钟,得到孵育后的精液的步骤，具体包括:在所述初染精液中加入所述预热后的Staining Talp液后混匀，在32°C _36°C的水浴锅中，暗室孵育40分钟-50分钟，得到所述孵育后的精液。
9.根据权利要求3所述的性控精液的分离方法，其特征在于，在所述孵育后的精液中加入所述预热后的4?:gg yolk Talp液,摇匀后得到所述染色精液的步骤,具体包括: 在所述孵育后的精液中加入所述预热后的4?:gg yolk Talp液后通过40微米-60微米过滤器进行第二次过滤，得到所述染色精液。
10. 根据权利要求5所述的性控精液的分离方法，其特征在于，在由林肯霉素和壮观霉素配成的所述林肯-壮观溶液中: 所述林肯霉素与所述壮观霉素的浓度比为1:2。
【文档编号】C12N5/076GK103525760SQ201310456121
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】帅志强, 苏冠宇 申请人:大连金弘基种畜有限公司