用于检测传染性造血器官坏死病毒的lamp引物及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的LAMP引物及应用。本发明所提供的引物为引物组，由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本发明利用以上引物，通过在反应液加入SYBR?Green?I荧光染料，建立了IHNV?RT-LAMP可视化检测方法，且该方法灵敏度高、特异性好、成本低、不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，这对鲑鳟鱼鱼苗的引种、无特定病原体种鱼的培育，以及鲑鳟鱼无公害健康养殖均有重要意义。
【专利说明】用于检测传染性造血器官坏死病毒的LAMP引物及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的LAMP引物及应用。
【背景技术】
[0002]传染性造血器官坏死病(infectioushaematopoietic necrosis, IHN)是由传染性造血器官坏死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus, IHNV)引起的一种常见的危害鲑鳟鱼类的急性病毒性传染病。自从上世纪50年代在美国首次暴发以来，IHNV已经扩散至欧洲、澳洲、亚洲等十余个国家。IHNV可造成鲑鳟鱼鱼苗近100%的死亡率，对世界的鲑鳟鱼养殖业造成了巨大的经济损失。因此，实用、快速、灵敏、准确的IHNV检测技术的建立在IHN早期诊断、水产品卫生质量监督、疫情监测等方面具有重要的意义。目前，世界动物卫生组织推荐的IHN的几种诊断方法包括细胞培养分离方法、免疫学方法(中和试验法、间接荧光抗体法和ELISA法)和分子生物学方法(PCR法、PCR探针和序列测定法)。PCR方法是目前最常用的快速检测方法，已经有以PCR技术为依托的商业化的IHNV检测试剂盒，这些检测试剂盒需要专门的仪器或者对PCR产物进行凝胶电泳与紫外线分析才能确定检测结果。
[0003]环介导等温扩增(loopmediated isothermal amplification,LAMP)技术是2000年Notomi等在PCR基础上创建的另外一种形式的核酸扩增技术。与PCR技术相比，两者最大的差异在于靶基因引物的设计上。其中，PCR只使用一对与靶基因两端序列互补的上下游引物，而LAMP 则针对靶基因的6个不同区域，设计4种特异引物一内侧引物对和外侧引物对，必要时再加上环形引物对，对靶基因进行扩增，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行扩增反应，因此其特异性和敏感性均比PCR更高。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是提供一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增引物组。
[0005]本发明所提供的用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增引物组，具体可为引物组A或引物组B ;所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；
[0006]所述引物I (F3)、所述引物2 (B3)、所述引物3 (FIP)、所述引物4 (BIP)、所述引物5 (Loop-F)和所述引物6 (Loop-B)的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
[0007]所述引物组A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比可为1:1:8:8:4:4。所述引物组B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比可为1:1:8:8。
[0008]在本发明的一个实施例中，所述引物I (F3)和所述引物2 (B3)在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为0.2 PM;所述引物3 (FIP)和所述引物4 (BIP)在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为1·6μΜ;所述引物5 (Loop-F)和所述引物6 (Loop-B)在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为O. 8 μ Μ。
[0009]所述引物组中，引物I (F3)和引物2 (Β3)组成外侧引物对；引物3 (FIP)和引物4 (BIP)组成内侧引物对；引物5 (Loop-F)和引物6 (Loop-B)组成环形引物对。序列I由20个核苷酸组成，序列2由20个核苷酸组成，序列3由45个核苷酸组成，序列4由46个核苷酸组成，序列5由18个核苷酸组成，序列6由20个核苷酸组成。
[0010]本发明的又一个目的是提供一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂。
[0011]本发明所提供的用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂，具体可包括反转录酶、链置换型DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和所述引物组。
[0012]当所述引物组为所述引物组A时，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录酶和所述链置换型DNA聚合酶在所述扩增试剂中的配比可为 5pmol ：5pmol ：40pmol ：40pmol ：20pmol ：20pmol ：25mmol ：5nmol ： IOU ：8U0
[0013]当所述引物组为所述引物组B时，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物
4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录酶和所述链置换型DNA聚合酶在所述扩增试剂中的配比可为 5pmol ：5pmol ：40pmol ：40pmol ：25mmol ：5nmoI ： IOU :8U。
[0014]在本发明中，所 述反转录酶具体可为AMV反转录酶；所述链置换型DNA聚合酶具体可为Bst2. ODNA聚合酶(如NEB公司产品目录号为M0537S的产品）或Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。
[0015]在本发明的一个实施例中，所述试剂具体由所述AMV反转录酶、所述Bst2. ODNA聚合酶、所述dNTPs、10X等温扩增缓冲液和所述引物组组成；其中，所述IOX等温扩增缓冲液的ρΗ8· 8，溶剂为水，溶质及其浓度如下：Tris-HC120mM、KC150mM、（NH4)2SO4IOmM、MgS042mM、Tween-20 体积分数 O. 1%。
[0016]所述AMV反转录酶为Promega公司产品；所述Bst2. ODNA聚合酶为New EnglandBiolabs公司产品。
[0017]在实际使用过程中，上述试剂的各组分在(逆转录）环介导等温扩增反应体系中的终浓度为：所述引物I和所述引物2各0.2 μ mol/L;所述引物3和所述引物4各1.6 μ mol/L ;所述引物5和所述引物6各O. 8ymol/L ;所述dNTPslmmol/μ L ;所述AMV反转录酶O. 4U/μ L ;所述Bst2. ODNA聚合酶O. 32U/ μ L ;所述IOX等温扩增缓冲液体积分数10%。
[0018]本发明的还一个目的是提供一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒。
[0019]本发明所提供的用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒，含有所述扩增试剂和荧光显色剂。
[0020]所述荧光显色剂为荧光染料SYBR Green I (如Invitrogen公司产品）。
[0021]如下a)或b)的应用也属于本发明的保护范围：
[0022]a)所述引物组在制备所述试剂盒中的应用；
[0023]b)所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有传染性造血器官坏死病毒的产品中的应用。[0024]应用所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒检测或辅助检测待测样品中是否含有传染性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤:用所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒在63-65°C (如63°C或65°C )条件下对所述待测样品进行时长60min的环介导等温扩增反应，之后在80°C放置2min终止反应，按照如下方法确定所述待测样品中是否含有传染性造血器官坏死病毒:向反应体系中加入SYBR Green I型核酸染料，如果反应液变成荧光绿色，说明待测样品中含有传染性造血器官坏死病毒，若反应体系呈现红棕色，则说明待测样品中没有传染性造血器官坏死病毒，该方法实现了检测结果的可视化。当然也可将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测待测样品中是否含有传染性造血器官坏死病毒，电泳检测若出现阶梯状DNA条带，则说明待测样品中含有传染性造血器官坏死病毒，若未出现阶梯状DNA条带，则说明待测样品中没有传染性造血器官坏死病毒。
[0025]所述待测样品来源于淡水或海洋动物，如鱼类，具体如鲑鳟鱼。
[0026]在本发明中，所述传染性造血器官坏死病毒为感染鱼类(如鲑鳟鱼)的传染性造血器官坏死病毒，具体如传染性造血器官坏死病毒(IHNV)毒株WRAC (美国典型培养物保藏中心，ATCC* Number:VR-1392 TM)。
[0027]本发明将逆转录环介导的等温扩增技术(reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification, RT-LAMP)引入到传染性造血器官坏死病毒(infectioushaematopoietic necrosis virus, IHNV)检测中，建立了简单、快速、灵敏的IHNV检测方法。针对IHNV的聚合酶蛋白基因(Polymerase protein, L)的8个区域设计6条特异性引物，以IHNV基因组RNA为模板，在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下进行RT-LAMP，反应产物添加SYBR Green I荧光染料后，通过肉眼观察阳性样本表现为荧光绿色，而阴性样本表现为红棕色。该方法实现了检测结果的可视化。特异性分析显示该方法不与传染性胰腺坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)及同属的水生动物病毒性出血败血症(viral haemorrhagic septicaemia virus, VHSV)发生交叉反应,并且可检测不低于 IOpfuIHNV的RNA，具有良好的特异性和很高的灵敏性。以上可视化结果均被2%琼脂糖凝胶电泳证明。本研究所建立的IHNV RT-LAMP可视化检测方法灵敏度高、特异性好、成本低、不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测。本发明对鲑鳟鱼鱼苗的引种、无特定病原体种鱼的培育，以及鲑鳟鱼无公害健康养殖均有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为不同稀释度病毒悬液感染EPC细胞后在细胞板上形成的空斑。
[0029]图2为RT-LAMP检测方法反应温度优化结果。其中，A为可视化检测结果，1:阴性对照；2-4:61°C、63°C、65°C。B 为凝胶检测结果，泳 1:阴性对照；2_4:61°C、63°C、65°C ；M:DL2000DNA Marker。
[0030]图3为RT-LAMP检测方法特异性检测结果。其中，A为可视化检测结果，I:IHNV ；2:IPNV ；3:VHSV ；B 为凝胶检测结果，I:IHNV ；2:IPNV ；3:VHSV ；M:DL2000DNA Marker。
[0031]图4为RT-LAMP检测方法灵敏度检测结果。其中，A为可视化检测结果，1_7:5、10、25、50、102、103、104pfu IHNV RNA。B 为凝胶检测结果，1-7:5、10、25、50、102、103、104pfuIHNV RNA ；M:DL2000DNA Marker。
[0032]图5为用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒的实际应用结果结果。其中，A为可视化检测结果，1-7 :1-7号样品；B为凝胶检测结果，1-7 :1-7号样品，M ：DL2000DNA Marker。
【具体实施方式】
[0033]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0034]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035]传染性造血器官坏死病毒（IHNV)毒株WRAC :美国典型培养物保藏中心，ΛI CX'"Number :VR_1392 TM。
[0036]传染性膜腺坏死病毒（infectiouspancreatic necrosis virus, IPNV):美国典型培养物保藏中心，ATCCk Number ：VR-890 TM。
[0037]水生动物病毒性出血败血症（viralhaemorrhagic septicaemia virus, VHSV)：美国典型培养物保藏中心，Λ?_α." Number :VR-1387 ΤΜ。
[0038]AMV反转录酶购自Promega公司，其产品目录号为M5101 ;Bst2. ODNA聚合酶购自NEB公司，其产品目录号为M0537S ；SYBR Green I和Trizol购自Invitrogen公司；DKZW-D-2电热恒温水浴锅购自北京市永光明医疗仪器有限公司；凝胶成像系统UniversalHood II 购自 BIO-RAD。
[0039]实施例I、用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒的制备及使用方法
[0040]一、用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增引物组的制备
[0041]本实施例用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增引物组由引物I、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成。这六个引物按照如下方法制备：根据GenBank收录的IHNV聚合酶蛋白的多条基因序列，进行比对，选取聚合酶基因特异性保守区段，利用在线软件 PrimerExplorer V4 (https: //primerexplorer. jp/elamp4. 0.0/)针对 L 基因保守区设计3对RT-LAMP引物，序列见表1，引物由哈尔滨博仕生物公司合成。
[0042]表1L基因RT-LAMP弓丨物序列
[0043]
【权利要求】
1.用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增引物组，为引物组A或引物组B ;所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成； 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于:所述引物组A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为1:1:8:8:4:4 ;所述引物组B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为1:1:8:8。
3.用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂，包括反转录酶、链置换型DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和权利要求1或2所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于:所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录酶和所述链置换型DNA聚合酶在所述扩增试剂中的配比为 5pmol:5pmol:40pmol:40pmol:20pmol:20pmol:25mmol:5nmol:10U:8U ;或 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录酶和所述链置换型DNA聚合酶 在所述扩增试剂中的配比为5pmol:5pmol:40pmol:40pmol:25mmol:5nmol: IOU:8U。
5.根据权利要求3或4所述的试剂，其特征在于:所述反转录酶为AMV反转录酶。
6.根据权利要求3-5中任一所述的试剂，其特征在于:所述链置换型DNA聚合酶为Bst2.0DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。
7.根据权利要求3-6中任一所述的试剂，其特征在于:所述试剂由所述AMV反转录酶、所述Bst2.0DNA聚合酶、所述dNTPs、10 X等温扩增缓冲液和权利要求1或2所述的引物组组成； 所述IOX等温扩增缓冲液的pH8.8，溶剂为水，溶质及其浓度如下:Tris-HC120mM、KC150mM、(NH4)2S0410Mm、MgS042mM、Tween-20 体积分数 0.1%。
8.用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于:所述试剂盒含有权利要求3-7中任一所述扩增试剂和荧光显色剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于:所述荧光显色剂为荧光染料SYBRGreen I。
10.如下a)或b)的应用: a)权利要求1或2所述的引物组在制备权利要求8或9所述试剂盒中的应用； b)权利要求1或2所述引物组，或权利要求3-7中任一所述试剂，或权利要求8或9所述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有传染性造血器官坏死病毒的产品中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103525951SQ201310506902
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】徐黎明, 卢彤岩, 刘淼 申请人:中国水产科学研究院黑龙江水产研究所