一种实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法
【专利摘要】本发明公开了一种实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法，包括对被检样品进行预处理，快速提取DNA；根据HLB16SrDNA保守序列设计出2对特异性引物，包含内侧引物HLB-F3、HLB-B3和外侧引物HLB-FIP、HLB-BIP各一对，制备特异性引物；荧光核酸恒温扩增检测技术反应；荧光核酸恒温扩增检测标准曲线的构建，根据不同稀释的模板pMD18-T-HLB的质粒浓度与相应的Tt值之间的关系而构建的，X轴表示起始模板浓度的对数值，Y轴表示不同浓度模板扩增达到阈值所用的时间；采用定量检测结果判断，在ESE-Quant?TubeScanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果，反应结束后瞬时离心将反应管内盖上SYBRGreenI混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果。本发明灵敏度高、高特异性、低污染、反应稳定的优点。
【专利说明】一种实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于柑橘黄龙病检测【技术领域】，尤其涉及一种实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法。
【背景技术】
[0002]柑橘黄龙病(CitrusHuanglongbing,HLB)是世界柑橘生产上最具毁灭性的的病害之一，国内外植物检疫的重要对象。目前HLB主要分布在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50个国家和地区。柑橘黄龙病病原菌能侵染各种柑橘类植物，症状有斑驳型黄化、均匀型黄化、缺素型黄化和“橡皮”果等，缩短植株经济寿命，降低产量和品质，造成巨大的经济损失。中国19个柑橘产生产省(市、自治区)中大多数收到该病害的威海，严重制约柑橘产业的健康发展。
[0003]柑橘黄龙病病原菌尚不能人工培养，目前普遍认为原核生物薄壁菌门变形菌纲(Proteobacteria) α -变型菌纲(Alphaproteobacteriacea)根瘤菌目(Rhizobiales)根瘤菌科(Rhizobiaceae)韧皮部杆菌属(‘CandidatusLiberibacter’ )是引起黄龙病的主要病原菌，其病原菌分为亚洲种(‘Ca.L.asiaticus’)、非洲种(‘Ca.L.africanus’ )和美洲种(‘Ca.L.americanus’ ),我国柑橘黄龙病病原主要是亚洲种(‘Ca.L.asiaticus’)。由于柑橘黄龙病尚无特效治疗性药剂，也没有抗(耐)病品种可供应用。因此，严格的检疫措施、种植无病苗木、及时挖除病树，以及系统而全面防治木虱是目前防治黄龙病较为有效的方法，而快速、稳定、灵敏的检测方法是无毒种苗生产的重要保证。
[0004]近年来，有报道证实基于PCR的方法已经成功用于HLB的检测，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR检测技术需要特殊的仪器设备且检测成本较高，而且它的检测时间仍然比较长(2~3小时)，不适合田间大规模的快速应用。因此，在加强柑橘苗木检疫监测中，迫切需要开发一种灵敏度高、操作简便、成本低廉且结果判断迅速的检测方法，在一定程度上可以取代PCR的检测方法。
[0005]日本学者Notomi等于2000年首次开发了环介导等温核酸扩增反应(loop-mediatedisothermalamplification, LAMP),该技术依赖六条特异引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，该技术先利用两条内引物和两条外引物，通过链置换作用形成茎环状DNA结构，然后在内引物的作用下通过环介导的自动循环链置换反应大量扩增靶序列，具有特异性强、敏感性高、简便易行等特点。实时突光核酸恒温扩增检测技术(real-timef luorescenceloop-mediatedi sothermalamp Iificationassay,简称RealAmp)是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时突光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，可以定量检测病原物，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点。此外，SYBRGreenI是目前LAMP产物最灵敏的检测方法之一，但是在RealAmp中SYBRGreenI的加入可能会抑制LAMP的反应效率，因此，在实际操作中普遍采用SYT0-9荧光染料进行RealAmp反应，而把SYBRGreenI染色颜色判断结果作为定量检测的一种辅助判断措施。[0006]该方法通常是按如下步骤进行:步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA ;步骤二、特异性引物的制备:确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、实时荧光核酸恒温扩增(RealAmp)反应:将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63°C保温1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。
[0007]目前，国外 Okudaetal.(2005)黄龙病亚洲种的 tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB 基因建立了 HLB亚洲种的LAMP检测技术，其检测灵敏度能够检出大约300个基因拷贝，并对日本和印度尼西亚的HLB进行了检测分析。在国内，黄丽等(2012)采用核糖体的外膜蛋白基因(Genebank登录号:AY842429)建立HLB的LAMP快速检测方法，质粒DNA拷贝数为3.9 X IO1的模板仍然可以有效扩增，比Okudaetal.(2005)的LAMP检测灵敏度更高，作者推测可能是引物扩增效率以及反应体系优化的结果。孔德英等(2013)同样采用核糖体的外膜蛋白基因(Genebank登录号:HQ2627229.1)为靶标建立了亚洲种的LAMP检测方法，其灵敏度可达25pg/ μ L，与对照实时荧光PCR方法灵敏度相同。
【发明内容】
[0008]本发明实施例的目的在于提供一种实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法，旨在解决现有的柑橘黄龙病检测方法存在的灵敏度低、特异性低、高污染、反应不稳定的问题。
[0009]本发明实施例是这样实现的，本发明实施例的实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法，该实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法步骤如下:
[0010]步骤一、对被检样品进 行预处理，提取DNA，取当季老熟叶片中脉近叶柄处5mg~IOmg置于1.5mL离心管中，在液氮中研磨至粉末状后加入60 μ LTES缓冲液，70°C恒温水浴7min后再加入60yL酚:氯仿:异戊醇混合液，混合液中酚:氯仿:异戊醇的重量比为25:24:1,润旋混匀后12000rpm离心5min,取40 μ L上清液加入由SephadexG-50_80构成的微柱中，4°C、5000rpm离心4min，用一新的无菌1.5mL的离心管收集滤液，_20°C保存备用；
[0011]步骤二、根据HLB 16SrDNA保守序列设计出2对特异性引物，包含内侧引物HLB-F3、HLB-B3和外侧引物HLB-FIP、HLB-BIP各一对，制备特异性引物；
[0012]步骤三、荧光核酸恒温扩增检测反应；将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63°C保温90min进行循环链置换反应；
[0013]步骤四、荧光核酸恒温扩增检测标准曲线的构建；采用HLB亚洲种特异性PCR引物OIl和012c，该引物扩增的的rDNA序列包含整个RealAmp的扩增区间，克隆该序列到PMD18-T载体测序正确后的质粒，命名为PMD18-T-HLB，用于构建标准曲线；
[0014]HLB 的 PCR 检测反应体系的方法:2.5 μ L10XPCRbufferMg2+，2 μ L dNTPs ( 2.5mMeach)，0.25 μ LTaq 聚合酶(5U/yL)，弓 I 物 OIl(5' -GCGCGTATTTTATACGAGCGGCA-3')和 0I2c(5' -GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3 ')各
Iμ L (IOpM), I μ LDNA,补水至 25 μ L ；PCR 反应的条件:94°C 预变性 3min，94°C 变性 30s、60°C退火30s、72°C延长90s、进行35次循环；72°C延长7min，反应结束后，取5 μ L反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳后EB染色观察结果，PCR扩增条带切胶回收连接pMD-18-T载体后测序正确后，将该质粒命名为pMD18-T-HLB10ng/l.! L，10倍梯度稀释后作为模板用于评估荧光核酸恒温扩增的检测灵敏度并由此构建HLBRealAmp的标准曲线；
[0015]步骤五、采用定量检测结果的判断,在ESE-QuantTubeScanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果，反应结束后瞬时离心将反应管内盖上的SYBRGreenI混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果。
[0016]进一步，在步骤一中，DNA提取液包含:IOOmMTris-HClpH8.0、20mM EDTApH8.0 和2%w/vSDS0
[0017]进一步，在步骤二中，由两对引物构成的引物混合液，其中HLB-F3即5' -GGCCTTAGGGTTGTAAAGC-3 '和 HLB-B3 即 5 ' -CACCTCTACACTCGGAATTC-3 '为外侧引物，HLB-FIP 即 5' -GGCTGCTGGCACGAAGTTACGCCGGAGAAGATAATGAC-3'和 HLB-BIP 即 5' -GCGAGCGTTGTTCGGAATAACGTTGAGCCCTGGGATTTC-3'为内侧引物,外引物 HLB-F3 和所述外弓 I 物HLB-B3的浓度分别为5pmol/y I ;内引物HLB-FIP和内引物HLB-BIP的浓度均为40pmol/μ I。
[0018]进一步，在步骤三中，突光核酸恒温扩增25 μ L反应体系为:1 μ L抽提的核酸DNA 作为模板，2.5 μ LlO X BstDNApoIymersebuffer、1.4mMdNTPs>0.8mM 甜菜喊、8mMMgS04、
0.2μΜ 的外引物 B3 和 F3、l.6μΜ 的内引物 FIP 和 ΒΙΡ、1 μ LBstDNApolymerase8U/ μ L,
0.2 μ MSYT0-9荧光染料，补水至25 μ L，然后再加入等体系的石蜡油覆盖整个反应液；
[0019]荧光核酸恒温扩增反应:63°C反应90min后80°C反应10min终止反应，RealAmp反应前在反应管内盖上加如I μ L1: 10倍稀释的SYBRGreenI荧光染料，待反应结束后瞬时离心将SYBRGreenI加入LAMP反·应液中进行显色观察，设置阳性对照反应时，用感染HLB的柑橘基因组总DNA代替；设置阴性对照反应时，用TE即IOOmMTris-HClpH8.0、50mMEDTA代替，将含有配制好的反应溶液的反应管置于63°C反应90min，反应结束后显示屏上显示扩增曲线。
[0020]进一步，在步骤四中，标准曲线是根据不同稀释的模板PMD18-T-HLB的质粒浓度与相应的Tt值之间的关系而构建的，X轴表示起始模板浓度的对数值，Y轴表示不同浓度模板扩增达到阈值所用的时间。
[0021]本发明提供的实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法，采用实时荧光核酸恒温扩增检测技术是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，可以定量检测病原物，克服了第一代LAMP检测方法的不足，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定的优点，采用不开盖不易受污染物的影响且能现场检测土壤样品，分析判断反应产物的方法极为简单，适宜于广泛地推广应用；通过采用核糖体16SrDNA为靶标序列建立HLB亚洲种的LAMP检测体系，检测灵敏度为Ipg/ μ L质粒DNA，同时改进SYBRGreenI染色方法防止污染，适合高通量的田间检测分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是本发明实施例提供的实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法流程图；
[0023]图2是本发明实施例提供的柑橘HLBRealAmp检测的特异性分析示意图；
[0024]图3是本发明实施例提供的柑橘HLBRealAmp检测的灵敏性性分析示意图；
[0025]图4是本发明实施例提供的柑橘HLBRealAmp标准曲线的构建示意图；
[0026]图5是本发明实施例提供的田间部分样品定量检测分析示意图。【具体实施方式】
[0027]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0028]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0029]如图1所示，本发明实施例的实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法包括以下步骤:
[0030]SlOl:对被检样品进行预处理，快速提取DNA ；
[0031]S102:根据HLB16SrDNA保守序列设计出2对特异性引物，包含内侧引物HLB-F3、HLB-B3和外侧引物HLB-FIP、HLB-BIP各一对，制备特异性引物；
[0032]S103:荧光核酸恒温扩增检测技术反应；
[0033]S104:荧光核酸恒温扩增检测标准曲线的构建，根据不同稀释的模板PMD18-T-HLB的质粒浓度与相应的Tt值之间的关系而构建的，X轴表示起始模板浓度的对数值，Y轴 表示不同浓度模板扩增达到阈值所用的时间；
[0034]S105:采用定量检测结果的判断，在ESE-QuantTubeScanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果，反应结束后瞬时离心将反应管内盖上的SYBRGreenI混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果。
[0035]本发明的具体步骤为:
[0036]步骤一、对被检样品进行预处理，提取DNA，取当季老熟叶片中脉近叶柄处5mg~IOmg置于1.5mL离心管中，在液氮中研磨至粉末状后加入60 μ LTES缓冲液，70°C恒温水浴7min后再加入60yL酚:氯仿:异戊醇混合液，混合液中酚:氯仿:异戊醇的重量比为25:24:1,润旋混匀后12000rpm离心5min,取40 μ L上清液加入由SephadexG-50_80构成的微柱中，4°C、5000rpm离心4min，用一新的无菌1.5mL的离心管收集滤液，_20°C保存备用；DNA 提取液包含:IOOmMTris-HClpH8.0、20mMEDTApH8.0 和 2%w/vSDS。
[0037]步骤二、根据HLB16SrDNA保守序列设计出2对特异性引物，包含内侧引物HLB-F3、HLB-B3和外侧引物HLB-FIP、HLB-BIP各一对，制备特异性引物；由两对引物构成的引物混合液，其中HLB-F3即5 ' -GGCCTTAGGGTTGTAAAGC-3 '和HLB-B3即5 ' -CACCTCTACACTCGGAATTC-3 '为外侧引物，HLB-FIP 即 5 ' -GGCTGCTGGCACGAAGTTACGCCGGAGAAGATAATGAC-3 '和 HLB-BIP 即 5 ' -GCGAGCGTTGTTCGGAATAACGTTGAGCCCTGGGATTTC-3'为内侧引物，外引物HLB-F3和所述外引物HLB-B3的浓度分别为δρπιο?/μ I ;内引物HLB-FIP和内引物HLB-BIP的浓度均为40pmol/y I。
[0038]步骤三、荧光核酸恒温扩增检测反应；将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63 °C保温90min进行循环链置换反应；荧光核酸恒温扩增25 μ L反应体系为:1 μ L抽提的核酸DNA作为模板，2.5 μ LlO XBstDNApolymersebuffer、1.4mMdNTPs、0.8mM 甜菜碱、8mMMgS04、0.2 μ M 的外引物 Β3 和 F3、l.6μΜ 的内引物 FIP 和ΒΙΡ、I μ LBstDNApolymerase8U/ μ L，0.2 μ MSYT0-9 荧光染料，补水至 25 μ L，然后再加入等体系的石腊油覆盖整个反应液；
[0039]荧光核酸恒温扩增反应:63°C反应90min后80°C反应10min终止反应，RealAmp反应前在反应管内盖上加如I μ L1: 10倍稀释的SYBRGreenI荧光染料，待反应结束后瞬时离心将SYBRGreenI加入LAMP反应液中进行显色观察，设置阳性对照反应时，用感染HLB的柑橘基因组总DNA代替；设置阴性对照反应时，用TE即IOOmMTris-HClpH8.0、50mMEDTA代替，将含有配制好的反应溶液的反应管置于63°C反应90min，反应结束后显示屏上显示扩增曲线。
[0040]步骤四、荧光核酸恒温扩增检测标准曲线的构建；采用HLB亚洲种特异性PCR引物OIl和012c，该引物扩增的的rDNA序列包含整个RealAmp的扩增区间，克隆该序列到PMD18-T载体测序正确后的质粒，命名为PMD18-T-HLB，用于构建标准曲线；
[0041]HLB 的 PCR 检测反应体系的方法:2.5 μ L10XPCRbufferMg2+，
2μ L dNTPs ( 2.5mMeach)，0.25 μ LTaq 聚合酶(5U/yL)，弓 I 物 OIl(5' -GCGCGTATTTTATACGAGCGGCA-3')和 0I2c(5' -GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3 ')各I μ L (IOpM), I μ LDNA,补水至 25 μ L ；PCR 反应的条件:94°C 预变性 3min，94°C 变性 30s、60°C退火30s、72°C延长90s、进行35次循环；72°C延长7min，反应结束后，取5 μ L反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳后EB染色观察结果，PCR扩增条带切胶回收连接pMD-18-T载体后测序正确后，将该质粒命名为pMD18-T-HLB10ng/l.! L，10倍梯度稀释后作为模板用于评估荧光核酸恒温扩增的检测灵敏度并由此构建HLBRealAmp的标准曲线；标准曲线是根据不同稀释的模板PMD18-T-HLB的质粒浓度与相应的Tt值之间的关系而构建的，X轴表示起始模板浓度的对数值，Y轴表示不同浓度模板扩增达到阈值所用的时间。
[0042]步骤五、采用定量检测结果的判断,在ESE-QuantTubeScanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果，反应结束后瞬时离心将反应管内盖上的SYBRGreenI混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果。
[0043]结合具体实施例对本发明做进一步的说明:·[0044]步骤一、对被检样品进行预处理，快速提取被检样品的DNA ；
[0045]核酸提取方法:取当季老熟叶片中脉近叶柄处5-10mg置于1.5mL离心管中，在液氮中研磨至粉末状后加入60 μ LTES缓冲液，70°C恒温水浴7min后再加入60 μ L酚:氯仿:异戊醇混合液(25:24:1)，涡旋混匀后12000印111离心51^11，取401^上清液加入由SephadexG-50-80构成的微柱中，4°C、5000rpm离心4min,用一新的无菌1.5mL的离心管收集滤液，_20°C保存备用；
[0046]DNA 提取液包含:IOOmMTris-HCl (pH8.0)、20mMEDTA (ρΗ8.0)和 2% (w/v) SDS ；
[0047]步骤二、特异性引物的制备
[0048]根据HLB16 SrDNA保守序列设计出2对特异性引物，包含内侧引物(HLB-F3和HLB-B3)和外侧引物(HLB-FIP和HLB-BIP)各一对，由两对引物构成的引物混合液，其中HLB-F3 (5' -GGCCTTAGGGTTGTAAAGC-3')和 HLB_B3(5' -CACCTCTACACTCGGAATTC-3')为外侧引物，HLB-FIP (5' -GGCTGCTGGCACGAAGTTACGCCGGAGAAGATAATGAC-3')和 HLB-BIP(5' -GCGAGCGTTGTTCGGAATAACGTTGAGCCCTGGGATTTC-3')为内侧引物，外引物 HLB-F3 和所述外引物HLB-B3的浓度分别为δρπιο?/μ I ;内引物HLB-FIP和内引物HLB-BIP的浓度均为40pmol/μ I ；
[0049]表1HLBRealAmp特异性检测引物序列
[0050]
【权利要求】
1.一种实时突光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法，其特征在于，该实时突光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法步骤如下: 步骤一、对被检样品进行预处理，提取DNA，取老熟叶片中脉近叶柄处5mg~IOmg置于1.5mL离心管中，在液氮中研磨至粉末状后加入60 μ LTES缓冲液，70°C恒温水浴7min后再加入60 μ L酚:氯仿:异戊醇混合液，混合液中酚:氯仿:异戊醇的重量比为25:24:1，涡旋混匀后12000rpm离心5min,取40 μ L上清液加入由SephadexG-50-80构成的微柱中，4°C、5000rpm离心4min，用一新的无菌1.5mL的离心管收集滤液，_20°C保存备用； 步骤二、根据HLB16SrDNA保守序列设计出2对特异性引物，包含内侧引物HLB-F3、HLB-B3和外侧引物HLB-FIP、HLB-BIP各一对，制备特异性引物； 步骤三、荧光核酸恒温扩增检测反应；将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63°C保温90min进行循环链置换反应； 步骤四、荧光核酸恒温扩增检测标准曲线的构建；采用HLB亚洲种特异性PCR引物OIl和0I2c，引物扩增的的rDNA序列包含整个RealAmp的扩增区间，克隆序列到pMD18_T载体测序正确后的质粒，命名为PMD18-T-HLB，用于构建标准曲线； HLB 的 PCR 检测反应体系的方法:2.5μ L10XPCRbufferMg2+，2y LdNTPs(2.5mMeach),·0.25 μ LTaq 聚合酶(5U/ μ L)，引物 OII (5 ' -GCGCGTATTTTATACGAGCGGCA-3 ')和 OI2c(5' -GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3')各 IyL (ΙΟρΜ)，I μ LDNA，补水至 25 μ L ;PCR 反应的条件:94 V预变性3min，94 V变性30s、60 V退火30s、72°C延长90s、进行35次循环；72°C延长7min，反应结束后，取5 μ L反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳后EB染色观察结果，PCR扩增条带切胶回收连接pMD-18-T载体后测序正确后，将质粒命名为pMD18-T-HLB10ng/ μ L，10倍梯度稀释后作为模板用于评估·荧光核酸恒温扩增的检测灵敏度并构建HLB RealAmp的标准曲线； 步骤五、采用定量检测结果的判断，在ESE-QuantTubeScanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果，反应结束后瞬时离心将反应管内盖上的SYBRGreenI混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果。
2.如权利要求1所述的实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法，其特征在于，在步骤一中，DNA 提取液包含:IOOmMTris-HClpH8.0、20mMEDTA pH8.0 和 2%w/vSDS。
3.如权利要求1所述的实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法，其特征在于，在步骤二中，由两对引物构成的引物混合液,其中HLB-F3即5' -GGCCTTAGGGTTGTAAAGC-3;和HLB-B3 即 5' -CACCTCTACACTCGGAATTC-3'为外侧引物，HLB-FIP 即 5' -GGCTGCTGGCACGAAGTTACGCCGGAGAAGATAATGAC-3'和 HLB-BIP 即 5' -GCGAGCGTTGTTCGGAATAACGTTGAGCCCTGGGATTTC-3'为内侧引物，外引物HLB-F3和所述外引物HLB-B3的浓度分别为δρπιο?/μ I ;内引物HLB-FIP和内引物HLB-BIP的浓度均为40pmol/y I。
4.如权利要求1所述的实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法，其特征在于，在步骤三中，荧光核酸恒温扩增25μ L反应体系为:1 μ L抽提的核酸DNA作为模板，·2.5 μ LlOXBstDNApolymersebuffer>1.4mMdNTPs、0.8mM 甜菜喊、8mMMgS04、0.2 μ M 的外引物 Β3 和 F3、1.6 μ M 的内引物 FIP 和 ΒΙΡ、I μ LBstDNApolymerase8U/ μ L，0.2 μ MSYT0-9 荧光染料，补水至25 μ L，然后再加入等体系的石蜡油覆盖整个反应液； 荧光核酸恒温扩增反应:63°C反应90min后80°C反应10min终止反应，RealAmp反应前在反应管内盖上加如I μ L1: 10倍稀释的SYBRGreenI荧光染料，待反应结束后瞬时离心将SYBRGreenI加入LAMP反应液中进行显色观察，设置阳性对照反应时，用感染HLB的柑橘基因组总DNA代替；设置阴性对照反应时，用TE即IOOmMTris-HClpH8.0、50mMEDTA代替，将含有配制好的反应溶液的反应管置于63°C反应90min，反应结束后显示屏上显示扩增曲线。
5.如权利要求1所述的实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法，其特征在于，在步骤四中，标准曲线是根据不同稀释的模板PMD18-T-HLB的质粒浓度与相应的Tt值之间的关系而构建的，X轴表示起始模板浓度的对数值，Y轴表示不同浓度模板扩增达到阈值所用的时间。
【文档编号】C12Q1/06GK103589794SQ201310536458
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】彭军, 郭建荣, 曾凡云, 龙海波, 裴月令 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所