从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法，该方法步骤为：对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；特异性引物的制备；荧光核酸恒温扩增检测技术RealAmp反应；RealAmp标准曲线的构建；结果判断。本发明提供的实时荧光核酸恒温扩增检测技术是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定的优点，RealAmp可以定量检测病原物，由于LAMP的特性，Bst?DNA?polymerase具有链置换能力，对土壤DNA提取物中包含的抑制物质具有很好的耐受性，针对土壤开展检测工作，采用不开盖、不易受污染物的影响且能现场检测土壤样品，分析判断反应产物的方法极为简单，适宜于广泛地推广应用。
【专利说明】从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于香蕉枯萎病菌检测领域，尤其涉及一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法。
【背景技术】
[0002]香蕉为芭蕉科芭蕉属植物，是热带亚热带地区重要的经济作物和粮食作物。香蕉枯萎病是香蕉产业的毁灭性病害，严重制约着我国香蕉产业健康发展。
[0003]香蕉枯萎病病原菌为Fusarium oxysporum Schlevht.f.sp.cubense (E.F.Smith)Snyd.&Hans.(Foe),曾用名Fusarium cubense E.F.Smith,属于半知菌类,瘤座菌目，键抱菌属，中文名称为尖孢镰孢菌古巴专化型。该菌分为3个小种(race)。在我国，主要为I号小种(racel，Rl)和4号小种(race4，R4)。I号小种发生历史悠久，主要侵染粉蕉等，可以通过改种Cavendish类香蕉来解决I号小种的危害。4号小种于1996年传入我国，严重危害我国香蕉产业的安全。4号小种又细分为亚热带4号小种(Subtr0picalrace4，ST4)和热带 4 号小种(Tropicalrace4, TR4)。 [0004]香蕉枯萎病的传播分远距离传播和近距离传播，远距离以病原菌随香蕉组培苗二级苗的调运为主，近距离传播是病原菌在蕉园内随土壤传播蔓延。Foc是一种维管束病害，也是热带重要的土传病害，Foc的厚垣孢子在土壤中可以存活很多年，一旦遇到寄主即可侵染发病。因此，在实际生产中迫切需要针对土壤的病原菌快速检测技术，用来检测组培苗二级苗土壤、新开辟蕉园土壤是否带菌以及疑似病株的快速诊断。因此，建立一套香蕉枯萎病病原菌4号小种快速、稳定的检测方法是我国香蕉安全生产的重要保证。
[0005]近年来，有报道证实基于PCR的方法已经成功用于Foc的检测，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR检测技术需要特殊的仪器设备且检测成本较高，而且它的检测时间也还是比较长(2~3小时)，不适合田间大规模的快速应用。此外，由于目前报道的PCR检测方法主要应用与感染的香蕉植株，没有针对土壤开发相关的快速诊断技术。因此，在加强香蕉苗木以及土壤病原菌的检疫监测中，迫切需要开发一种灵敏度高、操作简便、成本低廉且结果判断迅速的检测方法，在一定程度上可以取代PCR的检测方法。
[0006]DNA 环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification ofDNA, LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性(Notomi等，2000)。该方法通常是按如下步骤进行:步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA ;步骤二、特异性引物的制备:确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应:将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63°C保温1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。
[0007]实时突光核酸恒温扩增检测技术(real-time fluorescence loop-mediatedisothermal amplification assay,简称RealAmp)是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，可以定量检测病原物，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点。此外，SYBR GreenI是目前LAMP产物最灵敏的检测方法之一，但是在RealAmp中SYBR GreenI的加入可能会抑制LAMP的反应效率，因此，在实际操作中普遍采用SYT0-9荧光染料进行RealAmp反应，而把SYBRGreenI染色颜色判断结果作为定量检测的一种辅助判断措施。
[0008]Linetal.(2009)通过随机引物扩增RAPD获得一个Focrace4特异性的0PA0 2404RAPD分子标签(GenBank登录号EF155535.1),以此序列为基础设计特异引物检测Race4。并根据 0PA024(I4 序列设计了 Focrace4 的 PCR特异性引物 Foc-l/Foc-2 (5' -CAGGGGATGTATGAGGAGGCT-3' /5' -GTGACAGCGTCGTCTAGTTCC-3')，扩增片段大小为 242bp，对香蕉组织进行快速检测分析。
[0009]Lietal.(2013)根据Focrace4特异性PCR引物Foc-l/Foc-2扩增序列进行测序后命名为 Foc242，并根据此序列设计了 FocSc-l/FocSc-2 (5' -CAGGG GATGTATGAGGAGGCTAGGCTA-3' /5' -GTGACAGCGTCGTCTAGTTCCTTGGAG-3')的real-timePCR引物，对疑似香蕉的叶片和假茎等组织进行定量Foc检测。
[0010]Ditaetal.(2010)通过分析香蕉枯萎病病原菌不同小种TEF-1 α基因和IGS基因序列的分析得到，IGS基因具有足够的SNP可以用于设计引物特异性检查TR4，而TEF-1 α基因不具备足够的SNP，序列相对保守无法区分不同的小种，因此，以IGS的SNP多态性为基础设计了热带4号小种(Tropicalrace4，TR4)的PCR扩增的特异性引物对FocTR4_F(5' -CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3 ' )/FocTR4_R (5 ' -CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3 ')可以检测FocTR4，扩增片段大小为46 3bp。
[0011]Lietal.(2013)根据 Focrace4RAPD 特异性序列 OPAO2404 (GenBank 登录号EF155535.1)设计LAMP引物并应用该技术对感染的香蕉组织进行检测。
[0012]目前，Linetal.(2009) ,Ditaetal.(2010)建立的 PCR 检测方法，Lietal.(2013)建立的real-timePCR方法以及Lietal.(2013)建立的LAMP检测方法均有不足之处。
[0013]第一，PCR及LAMP方法均无法进行定量检测，并且该技术仅针对香蕉组织，而不是针对土壤进行检测。第二，Real-timePCR虽然可以定量检测，也不针对土壤进行定量病原菌检测。此外，这些方法需要提取较高纯度的样品基因组DNA、用时较长，也不能现场检测土壤样品，且需要昂贵而精密的温度循环装置，必须借助电泳仪才能对判别扩增产物的阳性或阴性，成本高，不易操作，需要具有一定技术水平的专业人员才能开展检测工作。
【发明内容】
[0014]本发明实施例的目的在于提供一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法，旨在解决以往第一代LAMP检测方法的灵敏度低、特异性低、污染严重、反应稳定性差的问题。
[0015]本发明是这样实现的，一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法，该从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法包括以下步骤:
[0016]步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA ；
[0017]步骤二、特异性引物的制备；
[0018]步骤三、荧光核酸恒温扩增检测技术RealAmp反应；[0019]步骤四、RealAmp标准曲线的构建；
[0020]步骤五、结果判断。
[0021]进一步，步骤一被检样品DNA提取的步骤:
[0022]按照I克土对应2ml的比例加入SPCB缓冲液，100 μ g/ml蛋白酶K37 °C处理30min-60min,然后终浓度为1%的SDS65°C度水浴l_2hr后，室温离心取上清，等体积的氯仿抽提一次去除蛋白，若抽提后界面还不清晰，可以考虑氯仿抽提一次；离心后取上清，加入
0.3M的NaAcPh5.2和等体积的异丙醇_20°C Ihr沉淀DNA，离心后用75%乙醇清洗1_3次，加入 100 μ I 的 CldH2O ；
[0023]SPCB 缓冲液为 100mmol/LTris-HCl，lOOmmol/LEDTA，120mMNa3P04，2%CTAB，
1.5MNaCl, ρΗ8.0，2% 巯基乙醇；
[0024]纯化步骤:G_50与PVPP混合制备纯化柱子，也可采用Bio-rad的MicroBio-Spin,过柱后保存DNA备用；
[0025]柱子制备:0.8mlG-75slurry加入离心管约13_14mm，在上面加入干的PVPP约5-7mm,然后两次加入IOOul的水后350 X g3min,最后在制备好的柱子中加入100 μ I的土壤DNA, 350g离心Imin,再次离心纯化DNA。
[0026]进一步，步骤二中特异性引物的制备具体方法如下:
[0027]I)根据FocSCAR特异性序列GenBank登录号EF155535.1设计出2对特异性引物，包含内侧引物F3和B3和外侧引物FIP和BIP各一对；
`[0028]2)由两对引物构成的引物混合液，其中F3即5' -CGAATGGCAAGAGTCTGTT-3;和B3 即 5' -TGTTCTGCCAGTTTGACG-3'为外侧引物，FIP 即 5' -GAGCGCGGTGGCTCAATACGATACCTGTGAAGTCGC-3'和 BIP 即 5' -CGCTGGCTTCCGAAACTACTTGACAAGAACACCAGAAGC-3 '为内侧引物，所述外引物FocTR4-F3和所述外引物FocTR4-B3的浓度分别为5ρπιο1/μ I ;所述内引物FocTR4-FIP和所述内引物FocTR4-BIP的浓度均为40ρπιο1/μ I。
[0029]进一步，步骤三荧光核酸恒温扩增检测技术RealAmp反应具体方法为:
[0030]将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63°C保温90min进行循环链置换反应；
[0031]RealAmp25 μ L反应体系:IyL抽提的核酸DNA作为模板，
2.5 μ LlOXBstDNApolymersebuffer> 1.4mMdNTPs、0.8mM 甜菜喊、8mMMgS04、0.2 μ M 的外引物 Β3 和 F3、1.6yM 的内引物 FIP 和 BIP、lyL Bst DNA polymerase8U/ μ L, 0.2 μ MSYT0-9荧光染料，补水至25 μ L，然后再加入等体系的石蜡油覆盖整个反应液防止挥发；
[0032]RealAmp 反应在 ESE-QuantTubeScanner 上进行，63 °C 反应 90min 后 80 °C 反应IOmin终止反应；
[0033]RealAmp反应前在反应管内盖上加如IyLl = IO倍稀释的SYBRGreenI荧光染料，待反应结束后离心将SYBRGreenI加入LAMP反应液中进行显色观察；
[0034]设置阳性对照反应时，用感染FOC的柑橘基因组总DNA代替；设置阴性对照反应时，用TE即IOOmMTris-HClpH8.0与50mMEDTA代替，将含有配制好的反应溶液的反应管置于63°C反应90min ;反应结束后显示屏上显示扩增曲线。
[0035]进一步,步骤四构建RealAmp标准曲线的方法如下:
[0036]采用RealAmp的外侧引物F3/B3，克隆该序列到pMD18_T载体测序正确后的质粒，命名为pMD18-T-FocR4，用于构建标准曲线；
[0037]香蕉枯萎病菌4号小种的PCR检测反应体系为:2.5 μ LlOXPCRbuffer即Mg2+，
2μ LdNTPs 即 2.5mMeach, 0.25 μ LTaq 聚合酶 5U/ μ L，引物 F3/B3 各 I μ LlOpM, I μ LDNA,补水至25 μ L ；
[0038]PCR反应的条件:94°C预变性3min，94°C变性30s、60°C退火30s、72°C延长30s、进行30次循环；72°C延长7min ；
[0039]反应结束后，取5 μ L反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳后染色观察结果，PCR扩增条带切胶回收连接pMD-18-T载体后测序正确后，将该质粒命名为pMD18-T-FoCR41.2ng/yL, 10倍梯度稀释后作为模板用于评估RealAmp的检测灵敏度并由此构建香蕉枯萎病菌4号小种的RealAmp标准曲线。
[0040]进一步，步骤五结果判断采用两种方法判断结果；
[0041]—种是定量检测结果的判断,在ESE-QuantTubeScanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果；
[0042]第二种，反应结束后用手甩,也可采用离心将反应管内盖上的SYBRGreenI混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
[0043]本发明提 供的实时突光核酸恒温扩增检测技术(Real-time fluorescenceloop-meidated isothermal amplification assay,简称 RealAmp)是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，克服以往第一代LAMP检测方法的不足，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点。
[0044]RealAmp第一可以定量检测病原物,第二，由于LAMP的特性,BstDNApolymerase具有链置换能力，对土壤DNA提取物中包含的抑制物质具有很好的耐受性。第三，针对土壤开展检测工作。第四，采用不开盖(closed-tubedetection technique)不易受污染物的影响且能现场检测土壤样品，分析判断反应产物的方法极为简单，适宜于广泛地推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1是本发明提供的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法流程图。
[0046]图2是本发明实施例提供的Focrace4LAMP引物设计示意图。
[0047]图3是本发明实施例提供的香蕉枯萎FocRace4RealAmp特异性测试图；
[0048](A)以香蕉枯萎病病原菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense (Foc) ) I 号小种(racel )、亚热带 4 号小种(SubtropicalRace4, ST4)、热带 4 号小种(Tropical Race4,TR4)、甜瓜蔓枯病菌(Mycosphaerella melonis)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerium)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)的 DNA 以及土壤、水为对照用来测试LAMP的特异性(分别对应编号的1-8)，仅模板是FoCRaCe4 (TR4和ST4)基因组DNA的显色为绿色，其余均为橙色。
[0049](B)使用香蕉枯萎病菌4号小种(Race4)特异性PCR检测引物Foc-l/Foc-2，扩增(A)中的1-8，仅模板是TR4和ST4基因组DNA显示有单一 242bp条带，其余均无条带；“M，，MarkerDL2000。
[0050](C) SYBRGreenI染色法检测(A)中各个模板的RealAmp扩增产物，绿色是阳性,而橙色是阴性。
[0051](D)各个模板采用ESE-QuantTubeScanner仪器进行RealAmp扩增反应后的扩增曲线。X轴表不扩增时间(min), Y轴表不响应的突光信号强度(mV)。
[0052]图4是本发明实施例提供的Focrace4RealAmp检测的灵敏度及其标准曲线构建图；
[0053](A)以pMD18-T-Foc质粒DNA为模板(1.2ng/ μ L)进行RealAmp灵敏性分析，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示RealAmp的检测下限约为1.2pg/ μ L。
[0054](B) SYBRGreenI染色法检测(A)中各个模板的RealAmp扩增产物，辅助判断结果。绿色是阳性，而橙色是阴性，染色结果与(A)中的电泳检测结果一致。
[0055](C)各浓度 pMDl8_T-Foc 质粒 DNAESE-Quant Tube Scanner 仪器进行 RealAmp 扩增反应后的扩增曲线。X轴表示扩增时间(min)，Y轴表示响应的荧光信号强度(mV)。
[0056](D)香蕉枯萎病菌4号小种RealAmp扩增曲线的构建。不同浓度的起始模板DNA浓度与相应的Tt值之间的关系而构建，X轴表示起始模板浓度的对数值，Y轴表示不同浓度模板扩增达到阈值所用的时间(Tt)。
[0057]图5是本发明实施例提供的田间部分土壤样品香蕉枯萎病菌4号小种的定量检测分析图； [0058](A) ESE-QuantTubeScanner仪器进行RealAmp扩增反应后的扩增曲线，无菌水为阴性对照(Control)。以浓度为6.8X 10_3ng的质粒DNA为阳性对照(编号为11)，其余12，13,41,42,43和45为不同蕉园采集的土壤。
[0059](B)依据标准曲线所计算出的每克土壤中的香蕉枯萎病菌4号小种的含量。编号同(A)。
【具体实施方式】
[0060]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0061]图1示出了本发明提供的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。
[0062]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0063]步骤一、对被检样品进行预处理，快速提取被检样品的DNA
[0064]DNA提取步骤:按照I克土对应2ml的比例加入SPCB缓冲液(IOOmmo I/LTris-HCl, IOOmmoI/LEDTA, 120mMNa3P04, 2%CTAB, 1.5MNaCl, ρΗ8.0, 2% 巯基乙醇)，100 μ g/ml蛋白酶K37°C处理30min-60min，然后终浓度为1%的SDS65°C度水浴l_2hr后，(室温)离心取上清，等体积的氯仿抽提一次去除蛋白，如果抽提后界面还不清晰，可以考虑氯仿抽提一次。离心后取上清，加入0.3M的NaAc (Ph5.2)和等体积的异丙醇_20°C Ihr沉淀DNA，离心后用75%乙醇清洗1-3次，加入100 μ I的ddH20。
[0065]纯化步骤:G_50与PVPP混合制备纯化柱子(或者采用Bio-rad的MicroBio-Spin),过柱后保存DNA备用。
[0066]柱子制备:0.8mlG_75slurry加入离心管约13_14mm,在上面加入干的PVPP约5-7mm,然后两次加入IOOul的水后350Xg3min。最后在制备好的柱子中加入100 μ I的土壤DNA, 350g离心Imin (离心让DNA进入G-75),再次离心纯化DNA即可。
[0067]步骤二、特异性引物的制备:
[0068]根据FocSCAR特异性序列(GenBank登录号EF155535.1)设计出2对特异性引物，包含内侧引物(F3和B3)和外侧引物(FIP和BIP)各一对。由两对引物构成的引物混合液，其中 F3 (5' -CGAATGGCAAGAGTCTGTT-3')和 B3 (5' -TGTTCTGCCAGTTTGACG-3')为外侧引物，FIP (5' -GAGCGCGGTGGCTCAATACGATACCTGTGAAGTCGC-3' ^PBIP (5' -CGCTGGCTTCCGAAACTACTTGACAAGAACACCAGAAGC-3')为内侧引物，所述外引物FocTR4_F3和所述外引物FocTR4-B3的浓度分别为5pmol/y l ;所述内引物FocTR4_FIP和所述内引物FocTR4_BIP的浓度均为40pmol/μ l。
[0069]表lFocrace4RealAmp特异性检测引物序列
[0070]
【权利要求】
1.一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法，其特征在于，该从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法包括以下步骤: 步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA ； 步骤二、特异性引物的制备； 步骤三、荧光核酸恒温扩增检测技术RealAmp反应； 步骤四、RealAmp标准曲线的构建； 步骤五、结果判断。
2.如权利要求1所述的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法，其特征在于，步骤一被检样品DNA提取的步骤: 按照I克土对应2ml的比例加入SPCB缓冲液，100 μ g/ml蛋白酶K37 °C处理.30min-60min,然后终浓度为1%的SDS65°C度水浴l_2hr后，室温离心取上清，等体积的氯仿抽提一次去除蛋白，若抽提后界面还不清晰，可以考虑氯仿抽提一次；离心后取上清，加入.0.3M的NaAcPh5.2和等体积的异丙醇_20°C Ihr沉淀DNA，离心后用75%乙醇清洗1_3次，加入 100 μ l 的 CldH2O ；
SPCB 缓冲液为 100mmol/LTris-HCl，IOOmmoI/LEDTA, 120mMNa3P04, 2%CTAB, 1.5MNaCl,ρΗ8.0，2%巯基乙醇； 纯化步骤:G_50与PVPP混合制备纯化柱子,也可采用Bio-rad的Micro Bio-Spin,过柱后保存DNA备用； 柱子制备:0.8mlG-75slurry加入离心管约13_14mm,在上面加入干的PVPP约5_7mm,然后两次加入1OOul的水后350 X g3min，最后在制备好的柱子中加入100 μ1的土壤DNA，350g离心Imin,再次离心纯化DNA。
3.如权利要求1所述的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法，其特征在于，步骤二中特异性引物的制备具体方法如下: 1)根据FocSCAR特异性序列GenBank登录号EF155535.1设计出2对特异性引物，包含内侧引物F3和B3和外侧引物FIP和BIP各一对； 2)由两对引物构成的引物混合液，其中F3即5'-CGAATGGCAAGAGTCTGTT-3'和B3即.5' -TGTTCTGCCAGTTTGACG-3 '为外侧引物，FIP 即 5' -GAGCGCGGTGGCTCAATACGATACCTGTGAAGTCGC-3 '和 BIP 即 5 ' -CGCTGGCTTCCGAAACTACTTGACAAGAACACCAGAAGC-3 '为内侧引物，所述外引物FocTR4-F3和所述外引物FocTR4-B3的浓度分别为δρπm/μl ;所述内引物FocTR4-FIP和所述内引物FocTR4-BIP的浓度均为40pmol/y l。
4.如权利要求1所述的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法，其特征在于，步骤三荧光核酸恒温扩增检测技术RealAmp反应具体方法为: 将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63 °C保温90min进行循环链置换反应； RealAmpZSyL反应体系:IyL抽提的核酸DNA作为模板，.2.5 μ LlOXBstDNApolymersebuffer>1.4mMdNTPs、0.8mM 甜菜喊、8mMMgS04、0.2 μ M 的外引物 Β3 和 F3、1.6 μ M 的内引物 FIP 和 Β1Ρ、1 μ LBstDNApolymerase8U/ μ L，0.2 μ MSYT0-9 荧光染料，补水至25 μ L，然后再加入等体系的石蜡油覆盖整个反应液防止挥发； RealAmp 反应在 ESE-QuantTubeScanner 上进行，63°C 反应 90min 后 80°C 反应10min 终止反应； RealAmp反应前在反应管内盖上加如I μ L1: 10倍稀释的SYBR GreenI荧光染料，待反应结束后离心将SYBRGreenI加入LAMP反应液中进行显色观察； 设置阳性对照反应时，用感染FOC的柑橘基因组总DNA代替；设置阴性对照反应时，用TE即100mMTris-HClpH8.0与50mM EDTA代替，将含有配制好的反应溶液的反应管置于63°C反应90min ;反应结束后显示屏上显示扩增曲线。
5.如权利要求1所述的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法，其特征在于，步骤四构建RealAmp标准曲线的方法如下: 采用RealAmp的外侧引物F3/B3，克隆该序列到pMD18_T载体测序正确后的质粒，命名为pMD18-T-FocR4，用于构建标准曲线； 香蕉枯萎病菌4号小种的PCR检测反应体系为:2.5 μ LlO XPCRbuffer即Mg2+，2μ LdNTPs 即 2.5mMeach, 0.25 μ LTaq 聚合酶 5U/ μ L，引物 F3/B3 各 I μ LlOpM, I μ LDNA,补水至25 μ L ； PCR反应的条件:94°C预变性3min，94°C变性30s、60°C退火30s、72°C延长30s、进行30次循环；72°C延长7min ； 反应结束后，取5 μ L反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳后染色观察结果，PCR扩增条带切胶回收连接pMD-18-T载体后测序正确后，将质粒命名为pMD18-T-FoCR41.2ng/yL, 10倍梯度稀释后作为模板用于评估RealAmp的检测灵敏度并由此构建香蕉枯萎病菌4号小种的RealAmp标准曲线。
6.如权利要求1所述的从土壤`中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法，其特征在于，步骤五结果判断采用两种方法判断结果； 一种是定量检测结果的判断，在ESE-Quant Tube Scanner反应结束后,仪器自动根据标准曲线显示定量结果； 第二种，反应结束后用手甩，也可采用离心将反应管内盖上的SYBRGreenI混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
【文档编号】C12Q1/68GK103757093SQ201310536459
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】彭军, 张欣, 张贺, 蒲金基, 谢艺贤, 漆艳香, 喻群芳, 谢培兰 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所