一种高效利用亚麻刺盘孢霉合成7α-羟基-雄甾烯酮的方法
【专利摘要】本发明属生物【技术领域】，涉及一种利用亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum?lini）ST-1羟化雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)为新型甾体化合物7α-羟基-雄甾烯酮（7α-OH-AD）的方法。采用两步转化法，在底物投料量为10g/L的条件下，转化率高达90%，产物7α-OH-AD总得率为79.32%。
【专利说明】—种高效利用亚麻刺盘孢霉合成7 a-羟基-雄留烯酮的方
法【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种高效利用亚麻刺盘孢霉 (Colletotrichum Iini) ST-1 轻化雄甾-4-烯-3，17- 二酮(AD)为 7 a -羟基-雄甾烯酮 (7 a-OH-AD)的方法。
【背景技术】
[0002]雄留-4-烯-3，17-二酮(AD)，是植物留醇经微生物切除边链后所形成的产物。由于AD母核的结构特点，其在留体药物合成领域被称为“激素之母，药用黄金”，全球年产值近100亿美元。采用生物转化技术，在AD母核的不同位点引入一个或多个羟基，可形成多种甾体药物前体，被广泛的用于合成蛋白同化激素、雄性激素、螺内脂，还可以用于合成氢化可的松、氢化泼尼松、黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物。目前，国家已把留体激素药物新资源开发作为医药行业近期技术发展的方向和重点之一。
[0003]开发留体体激素药物新资源，最大的难点在于寻找对留体具有高转化率、高选择性、高产物得率的优势菌株和合成一些具有潜力的新型留体化合物。目前，对AD具有转化能力的主要是分枝杆菌属其不仅转化周期长、底物转化率低而且易形成其他的多种副产物。另外，八0的羟化产品单一，仅90、150、140羟化有见报道，关于7 a 的羟化仍未见研究。因此，利用高转化效率的菌株羟化AD以形成具有生物活性的新型甾体化合物，不仅为留体药物合成提供了重要的前体化合物，同时可为留体药物的合成开辟新途径，具有一定的理论研究价值和市场经济价值。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种获得新型甾体化合物7a-羟基-雄烯二酮 (7 a -OH-AD)方法,通过两步发酵法,利用亚麻刺盘孢霉{Colletotrichum Iini ) ST-1的生长细胞将雄甾-4-烯-3，17- 二酮(AD)高效转化为I a -0H-AD。
[0005]应用上述方法转化AD生产I a -OH-AD,其步骤如下:
(1)采用保藏号为CGMCC `N0.6501 的 C.1ini ST-1 为生产菌种，25_40°C，120-220 r/ min条件下活化培养得到种子液，然后将种子液稀释涂布到PDA平板上；
(2)制备C.1ini ST-1菌株的细胞液体培养物:挑取步骤(1)的PDA固体培养基上的 C.1ini ST-1菌株一环，接种于已灭菌的装有20-50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，培养温度为25-40°C，置摇床上以120-220 r/min的转速培养12-16 h至对数生长中期，即得到C.1ini ST-1菌株的细胞液体培养物；
(3)发酵培养:将步骤(2)中制备好的细胞液体培养物以8-10%(v/v)的接种量接入发酵培养基，装液量为250 mL锥形瓶中装20-50 mL发酵培养基，培养温度为25_40°C，在 120-220 r/min的转速下培养20-24 h，得发酵液。
[0006](4)生物转化:称取适量底物AD，投入步骤(3)中的菌体发酵液，使其终浓度为8-10 g/L，在转化温度28°C，200-220 r/min的转速下转化48-60 h，即得转化液。
[0007](5)产物检测:将步骤(4)的转化液在8000-12000 r/min下离心5-10 min，上清用等体积乙酸乙酯抽提3次，菌体用适量氯仿抽提3次，合并抽提液后于旋转蒸发仪中旋至有晶体出现，乙腈复溶晶体并通过0.22 um的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析AD、7 a -OH-AD的含量。
[0008]其中步骤(1)中所述的PDA培养基的成分及配比为:土豆200-500 g/L ;葡萄糖20-50 g/L;酵母粉2-10 g/L;琼脂粉10-20 g/L ;pH自然，在121°C高压蒸汽下灭菌 20min ;步骤(2)所述种子培养基的成分及配比为:花生饼粉10-20 g/L，淀粉15-30 g/L ； 葡萄糖 20-50 g/L ;酵母粉 10-30g/L ；NH4NO3 5-10 g/L ；KC1 0.1-1 g/L ；K2HPO4 0.1-1.0 g/L ；MgS04*7H20 0.01-0.1 g/L ；FeS04*7 H2O 0.01-0.1 g/L g/L ;灭菌前调培养基的 pH 至 6.0-6.5，在121°C高压蒸汽下灭菌20min ;步骤(3)所述发酵培养基的成分及配比为:葡萄糖 10-100 g/L;淀粉 10-30 g/L;酵母粉 5-50g/L;蛋白胨 5-50 g/L ; NaC I 0.2-2 g/L ； K2HPO4 0.1-1.0 g/L ；KH2PO4 0.1-1.0 g/L ；MgS04 0.01-0.1 g/L ；FeS04*7 H2O 0.01-0.10 g/ L ；pH 6.5-7.5,121°C高压蒸汽下灭菌 20 min。
[0009]本发明所述的合成新型甾体化合物7 a -OH-AD的方法，是首次提出利用C.1ini ST-1 羟化 AD 为 7 a -0H-4AD。
[0010]
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为本发明的C 7i/?i ST-1在发酵培养基中转化AD为7 a-OH-AD的过程研究。
[0012]
【具体实施方式】
[0013]实施例1制备亚麻刺盘孢霉{Colletotrichum Iini )ST_1菌株的细胞液体培养物 (I)挑取固体PDA培养基上的亚麻刺盘孢霉菌株一环，接种在装有30 mL种子培养基
的250 mL锥形瓶中，在30°C下，置于摇床上以200 r/min的转速培养20-24 h至对数期，SP 制得C 7i/?i ST-1的细胞液体培养物。
[0014](2)种子培养基的成分 及配比为:花生饼粉10-20 g/L，淀粉15-30 g/L ;葡萄糖 20-50 g/L ;酵母粉 10-30g/L ;NH4N03 5-10 g/L ；KC1 0.1-1 g/L ；K2HPO4 0.1-1.0 g/ L ；MgS04*7H20 0.01-0.1 g/L ；FeS04*7 H2O 0.01-0.1 g/L g/L ;灭菌前调培养基的 pH 至
6.0-6.5,在121°C高压蒸汽下灭菌20min。
[0015]实施例2亚麻刺盘孢霉(Cb776^otricA_ Iini) ST-1菌株的摇瓶发酵
(I)将上述C Iini ST-1的细胞液体培养物以8-10% (w/w)的接种量接种在装有已灭菌的装有30 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，在20-40°C条件下，置于摇床上以120-200 r/min的转速培养，发酵20-24 h，菌体进入对数生长期。
[0016](2)发酵培养基的成分及配比为:葡萄糖10-100 g/L;淀粉10-30 g/L ;酵母粉 5_50g/L ;蛋白胨 5-50 g/L ；NaCl 0.2-2 g/L ；K2HPO4 0.1-1.0 g/L ；KH2PO4 0.1-1.0 g/L ； MgSO4 0.01-0.1 g/L ；FeS04*7 H2O 0.01-0.10 g/L ；pH 6.5-7.5，121°C高压蒸汽下灭菌 20 min。[0017]实施例2亚麻刺盘孢霉(Colletortrichum Iini ) ST-1菌株转化AD
精确称取适量AD，投入步骤(3)中的菌体发酵液，使AD终浓度为10 g/L，在转化温度 28°C, 200-220 r/min 的转速下转化 48-60 h。
【权利要求】
1.一种利用亚麻刺盘孢霉iColletotrichum Iini ) ST-I合成新型留体化合物 7 a -OH-AD的方法，其特征为：250 mL三角瓶装20-40 mL的发酵培养基，接种量为重量比 8-10%,培养温度25-40°C，摇床转速180-220 r/min,培养20-24 h后投入适量AD，继续转化 48-60 ho
2.如权利要求1所述的亚麻刺盘孢霉iColletotrichumIini)ST_1轻化AD的方法,其特征在于，所用发酵培养基组成如下：葡萄糖10-100 g/L;淀粉10-30 g/L;酵母粉5-50g/ L ;蛋白胨 5-50 g/L ；NaCl O. 2-2 g/L ；Κ2ΗΡ04 0. 1-1. 0 g/L ；KH2PO4 0. 1-1. 0 g/L ；MgS04 0. 01-0. I g/L ;FeS04.7 H2O 0. 01-0. 10 g/L ；pH 6. 5-7. 5，121°C高压蒸汽下灭菌 20 min。
【文档编号】C12P33/06GK103555806SQ201310570312
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月16日 优先权日:2013年11月16日
【发明者】许正宏, 吴燕, 史劲松, 李会, 李恒, 张旦旦, 许鸿瑜 申请人:江南大学