一种低温纤维素酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种纤维素酶突变体，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO：3。本发明的纤维素酶突变体最适作用温度为50℃，且在40℃条件下，仍能保持70%以上的纤维素酶酶活，而野生型纤维素酶的最适作用温度为55℃，在40℃条件下，仅能保持40%的纤维素酶酶活，与之相较，纤维素酶突变体更适合在较低温度下发挥作用，比野生型具有更高的纤维素酶活力；本发明的纤维素酶突变体的最适作用pH为5.0，且在pH4.5-6.5范围内均能保持80%以上的酶活水平，而野生型纤维素酶仅在pH4.5-5.5范围内维持80%以上的酶活，与之相较，突变体的pH适应范围更加宽泛，具有更大的应用空间。
【专利说明】一种低温纤维素酶及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种低温纤维素酶及其应用。
【背景技术】
[0002]纤维素酶，是一种复合酶，是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，习惯上将纤维素酶分成三类:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β_葡萄糖苷酶。纤维素酶是在工业中应用最广泛的酶之一，一般应用于纺织工业、去污剂工业、纸浆和造纸工业、饲料和食品工业(包括烘焙)，以及用于木质纤维素材料水解，用于例如生物乙醇生产等。
[0003]纤维素酶可以按照其一级序列分类成各种糖基水解酶家族，这得到了家族一些成员的三维结构分析的支持(Henrissat 1991,Henrissat和Bairochl993,1996)。例如，糖基水解酶家族5、7、12和45含有内切葡聚糖酶。大多数纺织用酸性纤维素酶属于家族5，而大多数纺织用中性纤维素酶为家族12或45。
[0004]大部分工业用酶通常在高于50°C的条件下才具有较高的催化效率，但是在纺织领域，为了节省能源，更为了提高织物色彩的牢固性以及减轻衣物的收缩，急需在低温度水平(低于50°C)下仍具有良 好性能的酶制剂。
【发明内容】
[0005]本发明为解决现有技术问题，提供了一种纤维素酶突变体及其重组表达菌株。本发明的纤维素酶突变体在低温条件下具有更高的酶活力，可广泛应用于纺织工业领域，效果显著。
[0006]本发明一方面提供了一种纤维素酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的纤维素酶第48位氨基酸由Leu变为Phe，第49位氨基酸由Thr变为Lys，第55位氨基酸由Ala变为Ser，第66位氨基酸由Ala变为Pro，第83位氨基酸由Asp变为Asn，第130位氨基酸由Ile变为Val，第144位氨基酸由Gln变为His，第147位氨基酸由Leu变为He，第156位氨基酸由Leu变为He。
[0007]上述纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其一种编码基因的核酸序列为 SEQ ID NO:4o
[0008]本发明另一方面提供了携带有编码序列为SEQ ID NO:4的纤维素酶突变体基因的质粒。
[0009]将上述质粒转入里氏木霉中进行重组表达，获得的纤维素酶突变体在低温条件下具有更高的酶活。
[0010]本发明还提供了上述纤维素酶突变体在纺织领域中的应用。
[0011]本发明的纤维素酶突变体最适作用温度为50°C，且在40°C条件下，仍能保持70%以上的纤维素酶酶活，而野生型纤维素酶的最适作用温度为55°C，在40°C条件下，仅能保持40%的纤维素酶酶活，与之相较，纤维素酶突变体更适合在较低温度下发挥作用，比野生型具有更高的纤维素酶活力；本发明的纤维素酶突变体的最适作用PH为5.0，且在pH4.5-6.5范围内均能保持80%以上的酶活水平，而野生型纤维素酶仅在pH4.5-5.5范围内维持80%以上的酶活，与之相较，突变体的pH适应范围更加宽泛，具有更大的应用空间。本发明的纤维素酶突变体可广泛应用于纺织加工领域，在PH4.0-8.5范围内应用，无需调酸可直接使用，且效果良好；除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点较小的批差稳定；耐盐性好，直接使用可用于中和除氧后的抛光、染色一浴工艺，能大大节省工时，减少生产成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1:里氏木霉发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指38kD处为重组表达的纤维素酶；
[0013]图2:纤维素酶突变体与野生型相对酶活-温度曲线图；
[0014]图3:纤维素酶突变体与野生型相对酶活-pH曲线图。
【具体实施方式】
[0015]本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。
[0016]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细描述。
[0017]实施例1:纤维素酶基因的 克隆
[0018]1.1纤维素酶突变体的合成
[0019]为了提高纤维素酶(野生型氨基酸序列为SEQ ID NO:1)在低温条件下的酶活力，对该酶的氨基酸位点进行了大量的点突变筛选，最终得到了能在低温条件下仍然保有较高酶活力的低温纤维素酶(氨基酸序列为SEQ ID N0:3)。这些氨基酸突变点分别是L48F，T49K，A55S，A66P，D83N，I130V，Q144H，L147I，L156I。突变后的序列依照里氏木霉的密码偏爱性而优化合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上KpnI和XbaI两个酶切位点。上述基因合成工作由上海生工生物工程股份有限公司完成，合成后的基因序列为SEQ ID N0:4。
[0020]同时通过基因合成的方法得到野生型纤维素酶的基因片段SEQ ID N0:2。
[0021]1.2基因克隆
[0022]合成后的质粒用限制性内切酶XbaI和KpnI (Fermentas)进行酶切；同时，用限制性内切酶XbaI和KpnI对质粒pTG进行酶切；使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接；将连接产物转化进Trans5 α大肠杆菌(Transgen),用氨节青霉素进行选择。为确保准确,对若干克隆进行测序(Invitrogen)。测序结果显示，突变体纤维素酶的基因序列为SEQ ID NO: 4，其编码的氨基酸序列为SEQ IDNO: 3，多个克隆测序结果都一致。
[0023]使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。
[0024]实施例2 =PEG介导的原生质体融合转化木霉及验证[0025]分别吸取里氏木霉(Trichoderma reesei )菌株孢子悬浮液于PDA平板中心(9cm培养皿)，待菌落长满整个培养皿，各切IcmX Icm大小的培养基于120mLYEG+U液体培养基中，在30°C、200rpm的条件培养14~16h。
[0026]用无菌Miracloth滤布收集菌丝体,并用溶液A清洗一次,在无菌条件下将清洗过的菌丝体转移到40mL原生质体化溶液，在30°C、90rpm的条件下培养I~2h，用显微镜观察检测原生质体转化进展。
[0027]用无菌Miracloth滤布过滤上述温浴液体，所得滤液即为原生质体溶液。将原生质体溶液分装于两个50mL无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45mL,在3000rpm条件下离心IOmin以获得沉淀并弃去上清液。用5mL溶液B再清洗沉淀两次。将沉淀重悬浮于IOmL溶液B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离心并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体数目在I X IO8个/mL左右。
[0028]在冰上，将200 μ L上述原生质体溶液加入预冷的无菌7mL离心管中，每个转化反应用I管，加入10 μ g重组质粒,加入50 μ L溶液C,温和混匀后再冰上放置20min。
[0029]将转化上层培养基熔化并保持在55°C ;从冰中移出上述7mL离心管，并向管中加入2mL溶液C和4mL溶液B，温和混匀各管，所得混合物即为原生质体混合物；向3个顶层琼脂试管中的每一个中加入ImL上述原生质体混合物，并立即倾倒与转化下层平板上，并将平板在30°C下培养5~7d至有转化子长出。
[0030]挑取转化子过夜培养,取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min,弃上清；加Λ 400 μ I 抽提缓冲液(IOOmM Tris-HCl, IOOmM EDTA, 250mM NaCl, 1%SDS);然后加 IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65°C水浴20min后，加入200 μ IlOM NH4AC,冰浴IOmin ;13000rpm离心IOmin,取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20°C放置30min ；13000rpm离心lOmin，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于_20°C保存。
[0031]以上述提取转化子基因组DNA为模板，利用上下游引物进行PCR扩增目的基因进行验证。
[0032]上游引物序列为:GGGGTACCATGGCTCTCT CCAAGCT ；
[0033]下游引物序列为:GCTCTAGATTACAAGCAC TGCGAATAC ；
[0034]PCR 扩增条件为 950C 4min ；94°C 40S ；58°C 40S，72°C lmin30 个循环；72°C 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，验证结果显示扩增产物的序列为SEQ ID N0:4。说明本发明构建得到了含纤维素酶突变体基因的里氏木霉工程菌，将其命名为里氏木霉 FN3-2 (Trichoderma reesei FN3-2)。
[0035]采用上述同样的方法将野生型纤维素酶基因片段SEQ ID N0:2转化到里氏木霉中，构建得到重组表达野生型纤维素酶的里氏木霉工程菌，将其命名为里氏木霉Ul-23 (Trichoderma reesei U1-23)。
[0036]溶液A:2.5mLlM K2HPO4, 2.5mLIM KH2PO4,48.156g MgSO4，加入 dlH20 至终体积500mL,用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0037]溶液B:5mLlM Tris (ρΗ7.5)，2.77g CaCl2,109.32g 山梨醇，加入 dlH20 至终体积500mL,用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0038]溶液C:250g PEG4000,2.77g CaCl2, 5mLlM Tris (ρΗ7.5)，加入 dlH20 至终体积500mL,用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0039]原生质体化溶液:将0.4mg 裂解酶(Lysing Enzyme from Trichodermaharzianum, Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0040]转化下层平板:0.l%MgS04, 1%KH2P04, 0.6%(NH4) 2S04, 1% 葡萄糖，0.35% 琼脂粉。[0041 ]转化上层培养基:0.l%MgS04, 1%KH2P04, 0.6% (NH4) 2S04, 1% 葡萄糖，18.3% 山梨
醇，0.35%琼脂糖。
[0042]微量元素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4.7Η20，8.8g ZnSO4.7Η20，0.4gCuSO4.5Η20，0.15g MnSO4.4Η20，0.Ig Na2B4O7.IOH2O, 50mg (NH4) 6Μο7024.4Η20，0.2mL 浓 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0043]PDA平板:20g葡萄糖,200g 土豆蒸煮液，15g琼脂,加入dlH20至终体积1000mL,高
压蒸气灭菌。
[0044]YEG+U液体培养基:20g葡萄糖，5g酵母提取物，Ig尿苷，加入dlH20至终体积1000mL,高压蒸气灭菌。
[0045]实施例3发酵验证
[0046]将上述构建得到的里氏木霉工程菌FN3-2 (Trichoderma reesei FN3-2)与里氏木霉工程菌Ul-23 (Trichoderma reesei U1-23)分别接种于MM发酵培养基(1.5%葡萄糖，1.7% 乳糖，2.5% 玉米浆，0.44%(NH4) 2S04,0.09%MgS04, 2%KH2P04,0.04%CaCl2，0.018% 吐温-80，0.018%微量元素·)培养，30°C培养48小时，然后25°C培养48小时，分别取上清液进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示，其中箭头所指处即为重组表达的纤维素酶，说明本发明构建的里氏木霉工程菌FN3-2能重组表达纤维素酶突变体，里氏木霉工程菌U1-23能重组表达野生型纤维素酶。
[0047]实施例4:酶活测定
[0048]4.1酶活测定方法
[0049]在50°C、pH值为4.8 (中性为pH6.0)的条件下,每分钟从浓度为5mg/ml的轻甲基纤维素钠溶液中降解释放Iymol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U，还原糖以葡萄
糖等量。
[0050]取三支试管各加入0.5mL CMC底物，与待测酶液一起50°C水浴预热5min。在第一、二试管中各加入0.5mL待测液，并计时，50°C水浴中反应15min。反应完后在三支试管中各加入1.5mLDNS试剂，并在第三支试管总补加0.5mL的待测酶液。取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温,用水定到5.0mL。以第三支试管试液为对照在540nm波长条件下测第一、二试管试液的吸光度，吸光度在0.25-0.35之间为宜。待测酶液反应液的吸光度与水平控制酶液反应液吸光度之差的绝对值不超过0.015。
[0051 ] 酶活X =(葡萄糖等量值/180/15/0.5) Xn
[0052]其中:X——酶活力单位，IU/g(mL);
[0053]180—葡萄糖从微克换算成微摩尔；
[0054]15——待测液与底物的反应时间；
[0055]0.5-加入反应的待测酶液量；
[0056]η——稀释倍数；
[0057]4.2、酶活测定[0058]按照上述方法测定里氏木霉FN3-2发酵上清液的酶活为130U/mL，而里氏木霉U1-23发酵上清液的酶活仅为80U/mL，说明纤维素酶突变体在里氏木霉中的表达效率比野生型闻。
[0059]实施例5纤维素酶酶学性质分析
[0060]5.1最适作用温度
[0061]分别在20。。、30。。、35。。、40。。、45。。、50。。、55。。、60。。、65。。、70。。、80。。，pH6.0 条件下测定上述发酵上清液的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，纤维素酶突变体的最适作用温度为50°C;且在40°C条件下，仍能保持70%以上的纤维素酶酶活；而野生型纤维素酶的最适作用温度为55°C，在40°C条件下，仅能保持40%的纤维素酶酶活，与之相较，纤维素酶突变体更适合在较低温度下发挥作用，比野生型具有更高的纤维素酶活力。
[0062]5.2最适作用pH值
[0063]分别用pH 值为 3.0,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 的缓冲液稀释上述发酵上清液,在50°C条件下测定其酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图3所示，纤维素酶突变体的最适作用pH为5.0，且在pH4.5-6.5范围内均能保持80%以上的酶活水平，而野生型纤维素酶仅在pH4.5-5.5范围内维持80%以上的酶活，与之相较，突变体的PH适应范围更加宽泛，具有更大的应用空间。
[0064]实施例6低温纤维素酶在 纺织中的应用
[0065]1、针织面料、梭织面料的除毛染色一浴工艺
[0066]应用温度为35_55°C ；
[0067]处理时间为30-150分钟；
[0068]pH 范围为 4.0-8.5 ;
[0069]上述工艺条件特别适用于染色同浴的情况；适用的浴比范围为1:5-1:30，使用的设备类型为溢流染色机，卷染机，水洗机等，本发明纤维素酶突变体的用量为400-1000U/L，且纤维素酶突变体的耐盐范围为硫酸钠40-100g/L.[0070]该酶除毛干净，对织物强力损失小，其灭活条件为添加纯碱至pH值到10，或升温到70°C以上并保持10分钟。
[0071]2、牛仔面料的起花及除毛应用
[0072]应用温度为35_55°C ；
[0073]处理时间为10-60分钟；
[0074]pH 范围为 4.0-8.5 ;
[0075]上述工艺条件可应用于退浆及单独石磨洗条件下的除毛、起花工艺；适用的浴比范围为1:5-1:30，使用的设备类型为工业水洗机等，纤维素酶突变体的用量为400-1000U/L0
[0076]该酶除毛干净，起花均匀，花点较小，对织物强力损失小，其灭活条件为添加纯碱至pH值到10，或升温到70°C以上并保持10分钟。
[0077]上述实验结果表明，本发明的低温纤维素酶突变体可广泛应用于纺织加工领域，在pH4.0-8.5范围内应用，无需调酸可直接使用，且效果良好；除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点较小，批差稳定；耐盐性好，直接使用可用于中和除氧后的抛光、染色一浴工艺，能大·大节省工时，减少生产成本。
【权利要求】
1.一种纤维素酶，其特征在于，所述的纤维素酶是氨基酸序列为SEQ ID N0:1的纤维素酶第48位氨基酸由Leu变为Phe，第49位氨基酸由Thr变为Lys，第55位氨基酸由Ala变为Ser，第66位氨基酸由Ala变为Pro，第83位氨基酸由Asp变为Asn，第130位氨基酸由Ile变为Val，第144位氨基酸由Gln变为His，第147位氨基酸由Leu变为He，第156位氨基酸由Leu变为He。
2.如权利要求1所述的纤维素酶，其氨基酸序列为SEQ ID N0:3。
3.一种基因，所述的基因用于编码权利要求1所述的纤维素酶。
4.如权利要求3所述的基因，其核酸序列为SEQID N0:4。
5.一种重组质粒，所述的重组质粒携带有权利要求3所述的基因。
6.一种重组里氏木霉，所述的重组里氏木霉携带有权利要求5所述的重组质粒。
7.权利要求1所述的纤维素酶在纺织加工领域中的应用。
【文档编号】C12R1/885GK103589701SQ201310578003
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】黄亦钧, 许丽红, 张青, 刘艳萍, 许韡, 王华明 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司, 上海康地恩生物科技有限公司