一种同时提取血清、双拭子中动物dna病毒和rna病毒核酸的方法

一种同时提取血清、双拭子中动物dna病毒和rna病毒核酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，包括步骤：对待提取物使用异硫氰酸胍裂解液裂解；硅胶膜吸附RNA；洗液Ⅰ除去杂蛋白；洗液Ⅱ洗去杂质；DEPC水洗脱核酸；上述异硫氰酸胍裂解液包括3-7M异硫氰酸胍、0.6%-1.0%TriTon-100、30-50mM?Tris-Cl、5-15mM?DTT、60-90μg/mL蛋白酶K、10-30mM?EDTA，PH在4.3-4.6；上述洗液Ⅰ包括5-6M盐酸胍，53-59%无水乙醇，K70-90μg/mL蛋白酶，PH在6.4-6.6；上述洗液Ⅱ包括70-80%乙醇。本发明的优点在于提取过程简单、周期短、成本低、能同时提取动物血清样本、双拭子样本中的RNA病毒和DNA病毒核酸。
【专利说明】—种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，适用于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]随着分子生物学的快速发展，基因诊断成为检测动物疫病最准确而有效地手段，进行基因诊断的过程中，病毒核酸的提取是进行检测的前提条件，核酸提取的质量也影响检测的准确性。当前，动物病毒核酸提取方法主要有经典Trizol提取法和以Trizol作为裂解液的硅胶模柱式提取法两种方法。经典Trizol提取法过程繁琐、周期长、提取效率低、技术要求高，以Trizol作为裂解液的硅胶模柱式提取法成本较高、提取RNA的质量不高、且只能提取RNA病毒。

【发明内容】

[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，提取过程简单、周期短、成本低、能同时提取动物血清样本、双拭子样本中的RNA病毒和DNA病毒核酸。
[0004]本发明是通过以下技术方案来实现的。
[0005]一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，包括步骤:对待提取物使用异硫氰酸胍裂解液裂解；硅胶膜吸附RNA;洗液I除去杂蛋白；洗液II洗去杂质；DEPC水洗脱核酸；上述异硫氰酸胍裂解液包括3-7M异硫氰酸胍、
0.6%-l.0%TriTon-100、30-50mM Tris-Cl、5_15mM DTT、60_90μ g/mL 蛋白酶 K、10_30mMEDTA, PH在4.3-4.6 ;上述洗液I包括5-6M盐酸胍，53-59%无水乙醇，K70-90 u g/mL蛋白酶，PH在6.4-6.6 ;上述洗液II包括70-80%乙醇。
[0006]进一步地，上述异硫氰酸胍裂解液包括5M异硫氰酸胍、0.8%TriTon-100、40mMTris-ClUOmM DIT、80 μ g/mL 蛋白酶 K、20mM edta,ph在4.5。
[0007]进一步地，上述洗液I包括5.5M盐酸胍，56%无水乙醇，80 U g/mL蛋白酶K，PH在
6.50
[0008]进一步地，上述洗液II包括75%乙醇。
[0009]进一步地，上述操作步骤包括:
[0010](I)取一干净离心管，1OOμ L样品加入200 μL的异硫氰酸胍裂解液中，振荡混匀，放置5分钟；
[0011](2)加入与异硫氰酸胍裂解液等体积的无水乙醇，即200 u L，颠倒反复混匀15秒；
[0012](3)将过滤柱套在2mL收集管上，全部混合液移到过滤柱上，12,OOOrpm离心1分钟；
[0013](4)弃收集管内的液体，往过滤柱加入600 u L的洗液1，12000rpm离心1分钟；[0014](5)弃收集管内的液体，往过滤柱加入600 u L的洗液2，12000rpm离心I分钟；
[0015](6)重复步骤(5)—次；
[0016](7)弃收集管内的液体，过滤柱套在收集管上，12000rpm离心I分钟；
[0017](8)换新的1.5mL离心管套上过滤柱，加20 y LDEPC到过滤柱膜上，室温放置I分钟，12，OOOrpm离心I分钟，收集滤液，保存。
[0018]本发明的有益效果:
[0019]同时提取动物血清样本、双拭子样本中的RNA病毒和DNA病毒核酸，具有方法简便、快速、成本低的特点。该方法为建立动物RNA病毒和DNA病毒多重PCR方法奠定核酸提取基础。
【具体实施方式】
[0020]下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。
[0021]实施案例1:
[0022]制备使用液剂:
[0023]异硫氰酸胍裂解液:成分为5M异硫氰酸胍、0.8%TriTon-100、40mM Tris-ClUOmMDTT,80 u g/mL 蛋白酶 K、20mM EDTA, pH 在 4.5。
[0024]洗液1:成分为5.5M盐酸胍，56%无水乙醇，80 ii g/mL蛋白酶K，PH在6.5。
[0025]洗液I1:成分为75%乙醇。
[0026]实施案例2:
[0027]同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，包括步骤:
[0028](I)取一干净离心管，IOOii L样品加入200 L的异硫氰酸胍裂解液中，振荡混匀，放置5分钟；
[0029](2)加入与异硫氰酸胍裂解液等体积的无水乙醇，即200 u L，颠倒反复混匀15秒；
[0030](3)将过滤柱套在2mL收集管上，全部混合液移到过滤柱上，12,OOOrpm离心I分钟；
[0031](4)弃收集管内的液体，往过滤柱加入600 u L的洗液1，12000rpm离心I分钟；
[0032](5)弃收集管内的液体，往过滤柱加入600 u L的洗液2，12000rpm离心I分钟；
[0033](6 )重复步骤(5 ) 一次；
[0034](7)弃收集管内的液体，过滤柱套在收集管上，12000rpm离心I分钟；
[0035](8)换新的1.5mL离心管套上过滤柱，加20 U LDEPC到过滤柱膜上，室温放置I分钟，12，OOOrpm离心I分钟，收集滤液，保存。
[0036]上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本
【发明内容】
并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，包括步骤:对待提取物使用异硫氰酸胍裂解液裂解；硅胶膜吸附RNA ;洗液I除去杂蛋白；洗液II洗去杂质；DEPC水洗脱核酸；所述异硫氰酸胍裂解液包括3-7M异硫氰酸胍、.0.6%-1.0%TriTon-100、30-50mM Tris-Cl、5_15mM DTT、60_90μ g/mL 蛋白酶 K、10_30mMEDTA, PH在4.3-4.6 ;所述洗液I包括5-6M盐酸胍，53-59%无水乙醇，K70-90 μ g/mL蛋白酶，PH在6.4-6.6 ;所述洗液II包括70-80%乙醇。
2.根据权利要求1所述的同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，所述异硫氰酸胍裂解液包括5M异硫氰酸胍、0.8%TriTon-100、40mMTris-ClUOmM DTT、80 μ g/mL 蛋白酶 K、20mM EDTA，pH 在 4.5。
3.根据权利要求1所述的同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，所述洗液I包括5.5M盐酸胍，56%无水乙醇，80 μ g/mL蛋白酶K，PH在6.5。
4.根据权利要求1所述的同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，所述洗液II包括75%乙醇。
5.根据权利要求1-4所述的同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，所述操作步骤包括: (1)取一干净离心管，100μ L样品加入200 μ L的异硫氰酸胍裂解液中，振荡混匀，放置.5分钟； (2)加入与异硫氰酸胍裂解液等体积的无水乙醇，即200yL，颠倒反复混匀15秒； (3)将过滤柱套在2mL收集管上，全部混合液移到过滤柱上，12,OOOrpm离心I分钟； (4)弃收集管内的液体，往过滤柱加入600μ L的洗液1，12000rpm离心I分钟； (5)弃收集管内的液体，往过滤柱加入600μ L的洗液2，12000rpm离心I分钟； (6)重复步骤(5)—次; (7)弃收集管内的液体，过滤柱套在收集管上，12000rpm离心I分钟； (8)换新的1.5mL离心管套上过滤柱，加20 μ LDEPC到过滤柱膜上，室温放置I分钟，.12，OOOrpm离心I分钟，收集滤液，保存。
【文档编号】C12N15/10GK103614371SQ201310594174
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】赵宏波, 陈帮照 申请人:安徽华卫集团禽业有限公司