富含二萜酚类化合物的见血清提取物及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种富含二萜酚类化合物的见血清提取物及其制备方法和用途，该见血清提取物具有抑制血小板聚集活性和抗肿瘤活性，可用于制备治疗或预防因血小板过度聚集引起的血栓、心肌梗塞等心脑血管疾病的药物和治疗乳腺癌、直肠癌、宫颈癌的药物。
【专利说明】富含二萜酚类化合物的见血清提取物及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种见血清提取物及其制备方法和用途，特别是涉及一种富含二萜酚类化合物的见血清提取物及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]见血清为兰科植物脉羊耳兰Liparis nervosa (Thunb.) Lindl.的全草,又称“立地好”、“黑兰”、“矮胖儿”，性寒，味苦，凉血止血、清热解毒。见血清常生长在山野、溪边等阴湿处，分布于四川、湖北、台湾等地，目前民间用药材均为野生。
[0003]迄今，国内外对见血清的药理作用及临床报道较少，主要集中在见血清的止血活性上，还未见有见血清抑制血小板聚集活性、抗肿瘤活性的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一在于提供一种富含二萜酚类化合物的见血清提取物的制备方法及该方法制得的见血清提取物。
[0005]本发明的目的之二在于提供上述见血清提取物在制备治疗或预防因血小板过度聚集引起的血栓、心肌梗塞疾病药物中的应用。
[0006]本发明的目的之三在于提供上述见血清提取物在制备治疗乳腺癌、直肠癌、宫颈癌药物中的应用。
[0007]本发明提供的一种富含二萜酚类化合物的见血清提取物的制备方法包括如下步骤:
[0008](I)将见血清全草干燥后粉碎，然后加入其重量5~15倍的提取溶剂进行提取，得提取液，所述提取溶剂为水、甲醇、乙醇中的一种或一种以上；
[0009](2)将提取液过滤、浓缩、干燥后用适量水进行分散，然后依次用石油醚或环己烷、乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得浸膏；
[0010](3)将步骤(2)得到的浸膏上正相硅胶柱进行层析，用石油醚-丙酮梯度洗脱，收集体积比90:1~50:1洗脱部位，减压回收溶剂；
[0011](4)将步骤(3)得到的洗脱液进行反相C18填料脱色，采用含甲醇的水溶液进行梯度洗脱，收集60%~80%甲醇水溶液洗脱部分，低温减压回收得到提取物。
[0012]进一步的，步骤(3)中采用体积比100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、30:1、10:1的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，收集体积比90:1~50:1洗脱部位。
[0013]进一步的，步骤(4)中采用浓度为0%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集60%~80%洗脱部分。
[0014]将步骤(4)得到的60%甲醇洗脱部位进行反复重结晶可制备得到迷迭香酚和表迷迭香酚，80%甲醇洗脱部位进行反复重结晶可制备得到鼠尾草酚。
[0015]本发明提供的一种富含二萜酚类化合物的见血清提取物由上述方法制得。
[0016]本发明还提供了上述见血清提取物在制备治疗或预防由血小板过度聚集引起的血栓、心肌梗塞疾病药物中的应用、以及在制备治疗乳腺癌、直肠癌、宫颈癌药物中的应用。[0017]由于见血清中所含鼠尾草酚、迷迭香酚等活性成分为中低极性化合物，在提取时，适宜的醇浓度，可以提高见血清中活性成分的回收率，但对于见血清中活性成分的提取而言，上述提取方法及任意组合都可达到本发明所述的提取物。提取时见血清全草与溶剂的重量比以1:5~15为宜，考虑到提取物中活性成分的稳定性，应尽量在常压及溶剂沸点范围内进行提取。
[0018]本发明所提供的富含二萜酚类化合物的见血清提取物具有抑制血小板聚集活性和抗肿瘤活性，可用于制备治疗或预防因血小板过度聚集引起的血栓、心肌梗塞等心脑血管疾病的药物和治疗乳腺癌、直肠癌、宫颈癌的药物。
[0019]下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
【具体实施方式】
[0020]实施例1见血清提取物的制备
[0021]将见血清全草干燥后粉碎，然后加入其重量12倍的80%乙醇冷浸提取3次，每次24小时，得绿褐色滤液，合并滤液，减压回收乙醇得浸膏，将浸膏加适量水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯部位浸膏上正相硅胶柱(200目)，用体积比100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、30:1、10:1的石油醚-丙酮梯度洗脱，收集体积比90:1~50:1洗脱部位，减压回收溶剂；再将所得浸膏上C18反相柱脱色，采用浓度为0%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集60%~80%洗脱部分，低温减压回收得提取物。
[0022]该提取物对光、氧、热不稳定，极容易被氧化变色，需避光避热密封保存。采用紫外分光光度法测定提取物中总酚含量为80%。采用HPLC法(C18柱；流动相:0.1%磷酸-60%乙腈；流速:1.0ml/min ;检测波长:230nm)检测其中主要成分鼠尾草酚和迷迭香酚的含量之和为37%。
[0023]实施例2见血清提取物的制备
[0024]将见血清全草干燥后粉碎，然后加入其重量10倍的80%甲醇超声提取(IOOKHZ) 3次，每次45min，得浸膏，将浸膏加适量水分散后，依次用正己烷、乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯部位浸膏上正相硅胶柱(200目)，用体积比100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、30:1、10:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比90:1~60:1洗脱部位，减压回收溶剂；再将所得浸膏上C18反相柱脱色，采用浓度为0%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集60%~80%洗脱部分，低温减压回收得提取物。测定提取物中总酚含量为83%，鼠尾草酚和迷迭香酚的含量之和为45%。
[0025]实施例3见血清提取物的制备
[0026]将见血清全草干燥后粉碎，然后加入85%乙醇回流提取3次，每次2h，得到浸膏后用适量水分散，再用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将所得乙酸乙酯部位浸膏上正相硅胶柱(200 目)，用体积比 100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、30:1、10:1 的石油醚-丙酮梯度洗脱，收集体积比90:1~50:1洗脱部位，减压回收溶剂；再将所得浸膏上C18反相柱脱色，采用浓度为0%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集60%~80%洗脱部分，低温减压回收得到提取物。测定提取物中总酚含量为85%，鼠尾草酚和迷迭香酚的含量之和为48%。[0027]实施例4鼠尾草酚、迷迭香酚和表迷迭香酚的制备
[0028]将实施例3中反相柱60%甲醇洗脱部位进行反复重结晶可制备得到迷迭香酚和表迷迭香酚，将80%甲醇洗脱部位进行反复重结晶可制备得到鼠尾草酚。
[0029]实施例5见血清提取物胶囊剂的制备
[0030]配方:实施例2所得见血清提取物50g ;糊精25g ;羧甲基纤维素钠5g ;硬脂酸镁1g
[0031]按上述重量比取见血清提取物、糊精、羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁，将其混匀后过80目筛，用干式制粒机制粒，用60目筛整粒，灌于胶囊中，即得。
[0032]实施例6见血清提取物片剂的制备
[0033]配方:实施例1所得见血清提取物50g ;糊精15g ;羧甲基纤维素钠5g ;羟丙纤维素IOg ;硬脂酸镁Ig
[0034]上述重量比取见血清提取物、糊精、羧甲基纤维素钠、羟丙纤维素和硬脂酸镁，将其混匀后过80目筛，用干式制粒机制粒，用60目筛整粒，压片，包衣，即得。
[0035]实施例7MTT法体外检测实施例3见血清提取物对不同肿瘤细胞系的增殖抑制活性
[0036](I)所用试剂
[0037]DMEM 培养基、胎牛血清、青链霉素双抗、0.25%Trypsin_lmM EDTA.4Na liquid、DMSO 等。
[0038](2)所用肿瘤细胞系
[0039]乳腺癌细胞(MCF7)、大肠癌细胞(HT29)、黑色素瘤细胞(WM451)、胃癌细胞(BGC823)、宫颈癌细胞(HeLa)。
[0040](3)细胞培养
[0041]均用含10%灭活的胎牛血清的DMEM培养液，细胞于37°C、5%C02中孵育，3天传代I次。
[0042](4)实施例3中制备的提取物对不同肿瘤细胞增殖的测定:
[0043]分别收集常规培养的肿瘤细胞，按照3000cell/孔接种96孔板，每种细胞做6个重复孔，培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养24h以后，弃去上清，每孔分别加入100μ g/ml,50y g/ml, 10μ g/ml, I μ g/ml 含提取物的 DMEM0.1ml，继续培养 72h，观察细胞生长情况，采用MTT法检测细胞增殖活性。
[0044]表1见血清提取物对肿瘤细胞生长抑制率(%)
[0045]
Wii乳腺癌细胞大肠癌细胞黑色素廇细胞胃癌细胞宫颈癌细胞
(MCF7)(HT29)(WM451)(BGC823)(HeLa)
100 pg/rnl89Λ5?7823832642
50pg/ml52.630.171.274312.8
10 pg/ml54.313.53.65.33.2
I μ^ηα?5.2---
[0046]结果表明该提取物对乳腺癌细胞(MCF7)、大肠癌细胞(ΗΤ29)、黑色素瘤细胞(WM451)、胃癌细胞(BGC823)、宫颈癌细胞(HeLa)在浓度100 μ g/ml时均具有显著抑制作用，抑制率大于50%。
[0047]实施例8实施例3见血清提取物抑制血小板聚集活性
[0048]大鼠50只，雌雄各半，随机分为提取物高、中、低剂量组、塞氯吡啶阳性对照组和空白对照组5个组，每组10只。各组大鼠灌胃给予相应药物，每日一次，连续5日。其中空白对照组给予等量体积生理盐水灌胃。
[0049]各组大鼠于末次给药Ih后，按腹腔内注射3.5%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血
5.4mL,加入盛有枸橼酸钠(3.8%)溶液0.6mL的离心管内抗凝。以800rpm离心IOmin,取上层液即为富血小板血衆(PRP);余下部分再以3000rpmin离心IOmin,取上清液即为贫血小板血浆(PPP)。按Born比浊法测定血小板最大聚集率，分别精密吸取各组PPP和PRP各300 μ L加入测试杯中，PPP调透光率到100%，PRP在37°C预温槽中预热3min后，加入诱导剂ADPlO μ L (终浓度为5 μ mol/L)检测5min，记录浊度改变曲线及其最大聚集率(MAR%)。各组大鼠血小板聚集率见表2。
[0050]表2见血清提取物ADP诱导的大鼠血小板聚集的作用
【权利要求】
1.一种富含二萜酚类化合物的见血清提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将见血清全草干燥后粉碎，然后加入提取溶剂进行提取，得提取液，所述提取溶剂为水、甲醇、乙醇中的一种或一种以上； (2)将提取液过滤、浓缩、干燥后用适量水进行分散，然后依次用石油醚或环己烷、乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得浸膏； (3)将步骤(2)得到的浸膏上正相硅胶柱进行层析，用石油醚-丙酮梯度洗脱，收集体积比90:1~50:1洗脱部位，减压回收溶剂； (4)将步骤(3)得到的浸膏进行反相C18填料脱色，采用含甲醇的水溶液进行梯度洗脱，收集60%~80%甲醇水溶液洗脱部分，低温减压回收得到提取物。
2.根据权利要求1所述的富含二萜酚类化合物的见血清提取物的制备方法，其特征在于:步骤(3)中采用体积比100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、30:1、10:1的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，收集体积比90:1~50:1洗脱部位。
3.根据权利要求1所述的富集二萜酚的见血清提取物的制备方法，其特征在于:步骤(4)中采用浓度为0%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集60%~80%洗脱部分。
4.一种由权利要求1、2或3制得的富含二萜酚类化合物的见血清提取物。
5.如权利要求4所述见血清提取物在制备治疗和预防血栓药物中的应用。
6.如权利要求4所述见血清提取物在制备治疗乳腺癌、直肠癌、宫颈癌药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK103463443SQ201310412661
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】苟小军, 宋芹, 陈封政, 郭晓强, 颜军, 刘嵬 申请人:成都大学