一种广西莪术dna条形码标准基因序列的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种广西莪术DNA条形码标准序列，其特征在于所述条形码标准检测基因为ITS基因，具有基因序列SEQ?ID?NO.1。测序结果通过手工校对、序列拼接，并在NCBI中进行Blast相似性搜索，确保所得序列为目标序列。广西莪术的种类鉴定依靠形态学和分子鉴定所实现，从而保证了结果的可靠性。本发明提供的广西莪术的DNA条形码标准基因序列有利于实现广西莪术的快速的鉴定，缩短鉴定时间，提高鉴定准确性。
【专利说明】—种广西莪术DNA条形码标准基因序列
【技术领域】
[0001]本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种广西莪术DNA条形码标准基因序列。
【背景技术】
[0002]广西莪术CurcumakwangsiensisS.G..Lee et C.F.Liang是姜科中的一种多年生草本植物，广泛分布于广西、广东、云南和四川等地，与蓬莪术Curcuma phaeocaμ lisval.和温郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling)是中国药典收载的3种基原莪术。《中华人民共和国药典》(2010版)规定上述三种植物的根状茎为常用中药“莪术”，有行气破血、消积止痛的功效；其块根为中药的“郁金”，具活血止痛、行气解郁、清心凉血、利胆退黄之效。加之莪术类药材往往在采集后就地加工，加工后药材外形相似，形态辨别困难，致使该类药材在流通市场上品种混乱现象普遍存在，药材质量极不稳定，因此对广西莪术类药材基原植物的鉴定和限制是非常重要。因此，对其物种和资源进行鉴定研究，对促进该科植物的开发和利用具有重要意义。
[0003]DNA条形码技术(DNA barcoding)是2003年由加拿大动物学家hebert首次提出，即利用一段DNA片段对物种进行鉴定，该技术自问世以来，因其快速、客观和操作程序化等特点，引起了科学界的广泛关注，是近年来发展最迅速的学科之一。线粒体细胞色素C氧化亚基(Cytochrome C Oxidase CO I)基因是被公认为动物界中标准的DNA条形码，对于植物的DNA barcoding鉴定研究来说，由于植物进化历程中容易发生杂交及网状进化事件，且同一基因在不同种群中进化速率也不一样，致使植物条形码的研究比动物要复杂得多，至今没有找到一条通用的DNA barcoding序列,推荐较多的序列有ITS、psbA_trnH、ITS2、matK等序列，但这些序列是否适合每一个具体的植物科或属，尚需进行针对性的探索研究。从Baldwin第一次把ITS应用于植物系统发研究以来，ITS己经成为系统发育重建中最受欢迎的序列之一。ITS之所以能有这么广的应用，在于它自身的一些特点:第一，ITS在核基因组中是高度重复的，千万个拷贝以串联重复方式出现在一个或多个染色体基因位点上，这样多的拷贝有利`于扩增、克隆和测序。同时，ITS、ITS2分别位于18S —
5.8SrDNA、5.8S — 26SDNA之间，而从细菌、真菌到高等植物的18S、5.8S、26S rDNA的序列又高度保守，这样就可以用与它们序列互补的通用引物对ITS区进行PCR扩增、测序。第二，这一基因家族通过不等交换和基因转换，重复单位间已发生了位点内或位点间的同步进化(concerted evolution),即不同ITS拷贝间的序列趋于相近或完全一致。这个特性可促使根据ITS序列对种间关系进行精确重建。由于变异较快，ITS不适用于较高分类阶元的系统学研究，而适用于科以下分类阶元的系统发育分析。ITS序列在一些起源古老世代较长的植物类群中的变异较低，也为研究那些间隔区进化速度很慢的古老类群间的系和长世代类群内较高阶元的系统重建提供了可能性。同时，ITS序列为杂交和多倍化研究提供了契机。此外，在某些类群，ITS序列已经用于种内的系统发育研究。迄今为止，已有诸多证明ITS基因在植物的分类鉴定中行之有效。因此可采用ITS基因的DNA条形码技术对广西莪术进行分子鉴定，目前Genbank中只有其它莪术类的ITS基因序列，至今尚无广西莪术的ITS的相关基因序列。本发明提供的广西莪术DNA条形码标准序列有利于实现广西莪术的快速鉴定，缩短鉴定时间，提高鉴定结果的准确性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种广西莪术DNA条形码标准基因序列。该基因序列的获得，将大大有助于对其物种和资源进行鉴定研究。
[0005]为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现:一种广西莪术DNA条形码标准检测基因，所述条形码标准检测基因为ITS，具有如下所述的基因序列SEQ ID N0.1:
【权利要求】
1.一种广西莪术DNA条形码标准检测基因，其特征在于所述条形码标准检测基因为ITS基因，具有如下所述的基因序列ITS SEQ ID N0.1:
2.权利要求1所述的广西莪术DNA条形码标准检测基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为:
3.一种广西莪术的分子鉴定方法，包括: O从待测的广西莪术植物组织中分离提取DNA ； 2)以该DNA为模板用一对引物，正向引物:5’TAG GTG AAC TGC GGA AGG AT 3’，反向引物5’ GTG GTC TCG CCT GAT TGG 3’，通过聚合酶链式反应扩增出广西莪术ITS基因； 3)然后取适量步骤2的聚合酶链式反应扩增出的ITS基因用琼脂糖电泳分离，经溴乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果； 4)如果能特异性扩增出600bp的条带，进行切胶回收，连接到T载体上，转化，提取质粒，在3500基因测序仪器上进行测序； 5)根据测序结果，如果与所述基因序列SEQID N0.1的同源性在98%以上，即可判断所述的待测组织为广西莪术。
【文档编号】C12Q1/68GK103695536SQ201310600809
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】王娟, 陈旭, 候艳芳, 曾建红, 付明磊, 刁珂, 白准, 黄凤香 申请人:桂林医学院