一种发酵生产达托霉素的方法
【专利摘要】本发明提供一种发酵生产达托霉素的方法，属于达托霉素的生产领域。本发明提供的发酵合成达托霉素的方法中，对菌种种子液浓度、接种量、发酵培养基pH等参数进行优化，维持玫瑰孢链霉菌的生长活性和发酵活性，提高达托霉素的生产量；在发酵过程中，向发酵培养基中流加癸醛溶液，并对其添加时间和添加量进行优化，可以提高达托霉素的抑制浓度，进一步提高达托霉素的合成产量。
【专利说明】一种发酵生产达托霉素的方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于达托霉素的生产领域，尤其涉及一种发酵生产达托霉素的方法。
【背景技术】
[0003]近10年来，革兰氏阳性耐药菌感染的趋势在不断上升。目前临床上治疗细菌感染的难点主要集中于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，耐万古霉素的肠球菌(VRE)，糖肽类敏感的金葡菌(GISA)等，它们也是目前医院中传播率利致死率很高的病原体，虽然万古霉素等糖肽类抗生素治疗这类感染取得了一定疗效，但近几年来，临床上已发现万古霉素的耐药菌，而且这种趋势在逐渐增大。因此抗耐药菌新抗生素的研究又成为热门课题。达托霉素对以上耐药菌均有很好的杀菌效果，且制剂用药方便，毒副作用小，成为“病原菌最后一道防线——万古霉素”的最佳替代品；更具意义的是，达托霉素作为环脂肽类抗生素家族的第一个产品，其化学结构和作用机制不同于已有所有类别的抗生素，是近四十年来继口恶唑烷酮类抗生素后，应用到临床的唯一新结构类别抗生素，而且达托霉素在临床试验中极少致使发生耐药性分离株。 [0004]达托霉素(Daptomycin)是一种从玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)发酵液分离得到的环脂肽类抗生素，其化学结构如式(I)所示。从式(I)可以看出，达托霉素由13个氨基酸和I个长链脂肪酸组成，其中10个氨基酸组成一个氨基酸环，另有3个氨基酸排列成线状，并且在末端的L-色氨酸(L-Trp)上，连接I个正癸酸。
[0005]达托霉素不仅具有新颖的化学结构，其作用模式也与任何现有上市的抗生素不同:达托霉素能扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀菌的目的。达托霉素通过从多个方面破坏细菌细胞膜功能，能迅速杀死革兰氏阳性菌，并且使细菌很难对其产生耐药性(A.Raja et al., Nature Rev.Drug Discov.，2003，2，943-944)。达托霉素除了能作用于大多数临床相关革兰氏阳性菌外，更重要的是，它在体外试验中还对甲氧西林、万古霉素和利奈唑烷等的耐药分离菌株呈现出强力的活性。
[0006]达托霉素的合成方法有化学全合成、化学半合成和生物合成三种工艺，其中前二种由于工艺过程复杂且产率低尚无商业价值。目前，行业内生产达托霉素的常规方法主要是通过玫瑰孢链霉菌菌株发酵制得。
[0007]发酵法合成达托霉素时，由于微生物代谢过程中的反馈抑制作用，当发酵产生的达托霉素达到一定浓度时，就会抑制达托霉素的进一步合成，使得发酵法生产的达托霉素的浓度不高。
【发明内容】
[0008]为解决上述问题，本发明提供一种发酵生产达托霉素的方法，采用如下技术方案:
一种发酵生产达托霉素的方法，其特征在于包括以下内容:
a.制备玫瑰孢链霉菌种子液；
b.接种:将步骤a中得到的种子液接种到发酵培养基中，接种量为10%；
c.发酵培养:将步骤b中得到的接种后的培养基进行培养和发酵，发酵培养温度为30 ~32。。；
d.补加癸醛溶液:当发酵培养18h以后，向发酵液中流加癸醛溶液，保持发酵液中癸醛的浓度为0.1~2mmol/L，直至发酵结束；
e.发酵结束并分离:当发 酵培养48~168h以后，结束发酵，将得到的发酵液进行提取分离，即得所述的达托霉素。
[0009]优选地，步骤a中所述的制备玫瑰孢链霉菌种子液包括以下内容:将保藏的玫瑰孢链霉菌菌株转接于斜面培养基上，30°C培养120h，然后接种于液体培养基中，在30°C的摇床中培养36h，即得所述的玫瑰孢链霉菌种子液。
[0010]优选地，所述的斜面培养基包括以下重量份的组份:可溶性淀粉20份，磷酸氢二钾0.5份，七水硫酸镁0.5份，七水硫酸铁0.01份，硝酸钾1份，琼脂20份，去离子水1000份。
[0011]优选地，步骤b中所述的发酵培养基的pH=6.5^7.0。
[0012]本发明的有益效果如下:
本发明提供的发酵合成达托霉素的方法中，对菌种种子液浓度、接种量、发酵培养基PH等参数进行优化，维持玫瑰孢链霉菌的生长活性和发酵活性，提高达托霉素的生产量；在发酵过程中，向发酵培养基中流加癸醛溶液，并对其添加时间和添加量进行优化，可以提高达托霉素的抑制浓度，进一步提高达托霉素的合成产量。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0014]实施例1
一种流加癸醛发酵生产达托霉素的方法，包括以下内容:
a.培养玫瑰孢链霉菌种子液；
b.接种:将步骤a中得到的种子液接种到发酵培养基中，接种量为10%；
c.发酵培养:将步骤b中得到的接种后的培养基进行培养和发酵，发酵培养温度为30 ~32。。；
d.补加癸醛溶液:当发酵培养18h以后，向发酵液中流加质量浓度为6.0%癸醛溶液(溶剂为油酸甲酯)，流加的速度为:每升发酵液中以1.0~2.0ml/h的流速往发酵罐中补料，直至发酵结束；
e.发酵结束并分离:当发酵培养48~168h以后，结束发酵，将得到的发酵液进行提取分离，即得所述的达托霉素。[0015]实施例2
一种流加癸醛发酵生产达托霉素的方法，包括以下内容:
a.培养玫瑰孢链霉菌种子液:将保藏的玫瑰孢链霉菌菌株转接于斜面培养基上，30°C培养120h，然后接种于液体培养基中，在30°C的摇床中培养36h，即得所述的玫瑰孢链霉菌种子液；
其中，所述的斜面培养基的配制方法如下:将可溶性淀粉20g、磷酸氢二钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、七水硫酸铁0.01g、硝酸钾Ig加入IL去离子水中，调节pH=7.2，然后再加入琼脂20g，经过蒸汽灭菌，然后倒斜面平板，即得斜面培养基；
b.接种:将步骤a中得到的种子液接种到发酵培养基(发酵培养基的pH=6.5^7.0)中，接种量为10% ；
c.发酵培养:将步骤b中得到的接种后的培养基进行培养和发酵，发酵培养温度为30 ~32℃；
d.补加半胱氨酸:当发酵培养18h以后，向发酵液中流加质量浓度为6.0%癸醛溶液(溶剂为乙醇)，流加的速度为:每升发酵液中以1.0~2.0ml/h的流速往发酵罐中补料，直至发酵结束；
e.发酵结束并分离:当发酵培养48~120h以后，结束发酵，将得到的发酵液进行提取分离，即得所述的达托霉素。
【权利要求】
1.一种发酵生产达托霉素的方法，其特征在于包括以下内容: 制备玫瑰孢链霉菌种子液； 接种:将步骤a中得到的种子液接种到发酵培养基中，接种量为10% ； 发酵培养:将步骤b中得到的接种后的培养基进行培养和发酵，发酵培养温度为30~32 0C ； d.补加癸醛溶液:当发酵培养18h以后，向发酵液中流加癸醛溶液，保持发酵液中癸醛的浓度为0.1~2mmol/L，直至发酵结束； e.发酵结束并分离:当发酵培养48~168h以后，结束发酵，将得到的发酵液进行提取分离，即得所述的达托霉素。
2.根据权利要求1所述的发酵生产达托霉素的方法，其特征在于，步骤a中所述的制备玫瑰孢链霉菌种子液包括以下内容:将保藏的玫瑰孢链霉菌菌株转接于斜面培养基上，30°C培养120h，然后接种于液体培养基中，在30°C的摇床中培养36h，即得所述的玫瑰孢链霉菌种子液。
3.根据权利要求2所述的发酵生产达托霉素的方法，其特征在于，所述的斜面培养基包括以下重量份的组份:可溶性淀粉20份，磷酸氢二钾0.5份，七水硫酸镁0.5份，七水硫酸铁0.01份，硝酸钾1份，琼脂20份，去离子水1000份。
4.根据权利要求1所述的发酵生产达托霉素的方法，其特征在于，步骤b中所述的发酵培养基的pH=6.5~7.0。`
【文档编号】C12P21/04GK103695511SQ201310644852
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】朱辉, 邹敬源 申请人:成都雅途生物技术有限公司