高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法
【专利摘要】高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法，涉及一种改性大豆分离蛋白的制备方法。所述制备方法步骤如下：将一定量的大豆分离蛋白和葡萄糖用蒸馏水配制成混合均匀的溶液，控制溶液中蛋白与葡萄糖的质量比为0.5～4∶1，蛋白浓度为8％(w/v)；将上述溶液密封后在70～90℃的条件下进行糖基化反应1～6h。本发明采用湿法糖基化改性来制备高溶解性和乳化性的改性大豆分离蛋白，容易操作，一步处理即可达到效果，节约成本和能源，为拓宽其在食品工业中的应用提供了理论依据。
【专利说明】高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种改性大豆分离蛋白的制备方法，具体涉及一种利用湿热法糖基化改性大豆分离蛋白提高其溶解性和乳化性的方法。
【背景技术】
[0002]大豆分离蛋白(soybean protein isolate, SPI)是以低温豆柏为原料分离提取的一种高纯度植物蛋白质，由于其具有良好的功能性质和较高的营养价值，成为最重要的植物蛋白资源之一。但它常常由于缺乏良好的溶解性及乳化能力使其在某些食品中的应用受到限制，因此为了拓宽大豆分离蛋白的应用范围，需要对其进行改性处理。
[0003]蛋白质糖基化改性是以美拉德反应为理论基础的。美拉德反应，又称“非酶褐变反应”，是蛋白质、多肽、氨基酸与还原糖之间的复杂反应。法国生物化学Louis CamileMaillard于1912年发现了该反应，美国化学家Hodge等人于1953年正式将该反应命名为“MaiIIard(美拉德)反应”，并提出了美拉德反应的网络系统分类图解，系统地阐述了反应机理。
[0004]美拉德反应可分为三个阶段:
[0005](a)初级阶段:还原糖(如葡萄糖)的羰基与具有自由氨基的化合物(如氨基酸、蛋白质中赖氨酸侧链上的ε -氨基及末端氨基酸的α -氨基)之间进行加成反应生成N-糖基胺(Glycosilamine),经Amadori重排形成1-氨基_1_脱氧_2_酮糖。在Amadori产物形成之后，其降解取决于体系的PH值:pH ( 7，Amiadori产物在1，2位置上烯醇化产生糠醒或经甲基糠醒(Hydroxymethylfurfural HMF) ;pH≥7, Amiadori产物在2, 3位置上烯醇化产生还原酮类和一类裂解产物。产生的这些高活性的物质将参与后面阶段的反应。
[0006](b)中级阶段:主要发生Strecker降解。羰基和自由氨基发生缩合反应后，将氮引入终产物中。二羰基化合物继续与氨基酸反应生成醛和α-氨基酮。
[0007](c)高级阶段:成环、脱水、重排、异构等一系列反应均在进行；在最终反应阶段，高级美拉德反应阶段形成的众多活性中间体，又可继续与氨基酸反应，最终都生成类色素-褐色含氮色素，此过程包括醇醛缩合、醛氨聚合、环化合反应等。
[0008]目前用于蛋白质改性的方法很多，包括物理改性、化学改性和酶法改性等。糖基化改性是化学改性的一种类型，是蛋白质的ε -氨基酸与多羟基化合物之间发生美拉德反应，生成糖基化蛋白。由于该方法不需要外加化学试剂，是一个自然、自发的反应，因此成为一种理想的改性方法。国内外已有许多学者研究发现经糖基化改性后的蛋白质其溶解性和乳化能力均发生较大改变。Saeki等人在40°C条件下将鱼肌原纤维蛋白与葡萄糖反应12h，它的溶解性得到显著改善；苏志光等人将大豆分离蛋白与甘露聚糖利用干法糖基化生成糖蛋白，经测定其溶解性显著提高。Moreno等人将酪蛋白与乳糖在40°C下进行糖基化反应，其产物的乳化性得到明显改善。赵海贤等人经研究表明在干热条件下生成的大豆分离蛋白与葡聚糖共价结合物的乳化能力显著提升。目前对大豆分离蛋白进行糖基化改性研究主要用干热法制备多糖-复合物，耗时较长。
【发明内容】
[0009]针对现有大豆分离蛋白功能性比较低的问题，本发明提供一种利用湿热法糖基化改性大豆分离蛋白提高其溶解性和乳化性的方法。
[0010]本发明提供的利用湿热法糖基化改性大豆分离蛋白提高其溶解性和乳化性的方法，具体步骤如下:
[0011]将一定量的大豆分离蛋白和葡萄糖用蒸馏水配制成混合均匀的溶液，溶液中大豆分离蛋白与葡萄糖的质量比为0.5?4: 1，大豆分离蛋白浓度为8% (w/v);将上述溶液密封后在70?90°C的条件下进行糖基化反应I?6h，将样品冷冻干燥后置于4°C下保存备用。
[0012]研究证明:美拉德反应的程度和温度、时间、系统中的组分及反应物浓度有关。湿热法进行的接枝反应是指蛋白质与糖在溶液的条件下加热进行，一般是单糖或双糖，因此选择葡萄糖这种价格低廉的单糖为反应底物。湿热接枝反应是在一个密闭的装置里放入蛋白质和糖的混合液，水浴或者油浴来控制反应的温度从而调节反应的速度，在温度< 90°C时反应速度较慢，温度> 100°C时较快。当温度> 100°C时，反应速度很快，反应不易控制，并且在工业生产中不易达到温度要求，同时在高温下容易形成蛋白与蛋白的聚合物，从而影响蛋白与糖的反应，因此选择70?90°C。又由于在< 90°C条件下反应速度较慢，因此选择反应时间为I?6h。不同配比的反应底物也会对糖基化反应速度和产物的功能性质产生一定的影响，因此选择多个底物配比进行研究。之前研究表明，在高水分活度食品中，反应底物浓度被稀释，不易发生美拉德反应，但在反应底物浓度较高时，又会由于溶液粘度过高而不易流动，从而影响反应的进行，因此选择蛋白浓度为8%。
[0013]201210540762.5公开了 一种复合改性制备高效蛋白乳化剂的方法，该方法是利用物理改性(超声波处理)与化学改性(糖基化改性)相结合的方式来制备高效蛋白乳化剂。而本发明中只单一用了湿法糖基化改性来制备高溶解性和乳化性的改性大豆分离蛋白，只经此一种化学改性同样显著改善了大豆分离蛋白的溶解性和乳化性。与201210540762.5相比，本发明优点在于容易操作，一步处理即可达到效果，节约成本和能源，并且超声波处理由于其成本较高，一般在实验室使用，目前工业上还较少使用。同时，本发明与201210540762.5在反应底物的浓度、配比及反应温度和时间范围均有不同。201210540762.5中使用缓冲溶液是要使反应在固定的pH值下进行，而本发明中是在自然条件下研究大豆分离蛋白糖基化改性对其溶解性和乳化性的影响，本发明使用去离子水同时也是为了排除离子对糖基化反应的影响。
[0014]本发明通过测定各糖基化产物的溶解度、乳化活性和乳化稳定性，研究糖基化温度和时间、蛋白-葡萄糖质量比对大豆分离蛋白溶解性和乳化能力的影响。结果表明:蛋白与葡萄糖质量比为1: 2，反应温度为80°C，反应时间为2h制得的糖基化大豆分离蛋白的溶解度最高，高达92.93%，是未改性SPI的4.38倍；蛋白与葡萄糖质量比为1: 1，反应温度为90°C，反应时间为6h制得的糖基化大豆分离蛋白的乳化活性最高，高达0.63，是未改性SPI的3.94倍；蛋白与葡萄糖质量比为1: 2，反应温度为90°C，反应时间为3h制得的糖基化大豆分离蛋白的乳化稳定性最高，高达50.92，是未改性SPI的1.98倍。糖基化改性可显著提高大豆分离蛋白的溶解性和乳化性能，这为拓宽其在食品工业中的应用提供了理论依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(4: I)对大豆分离蛋白溶解性的影响；
[0016]图2为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(2:1)对大豆分离蛋白溶解性的影响；
[0017]图3为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(I: I)对大豆分离蛋白溶解性的影响；
[0018]图4为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(I: 2)对大豆分离蛋白溶解性的影响；
[0019]图5为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(4: I)对大豆分离蛋白乳化活性的影响；
[0020]图6为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(2:1)对大豆分离蛋白乳化活性的影响；
[0021]图7为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(I: I)对大豆分离蛋白乳化活性的影响；
[0022]图8为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(I: 2)对大豆分离蛋白乳化活性的影响；
[0023]图9为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(4: I)对大豆分离蛋白乳化稳定性的影响；
[0024]图10为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(2:1)对大豆分离蛋白乳化稳定性的影响；
[0025]图11为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(I: I)对大豆分离蛋白乳化稳定性的影响；
[0026]图12为不同糖基化温度和时间及蛋白-葡萄糖质量比(I: 2)对大豆分离蛋白乳化稳定性的影响。
【具体实施方式】
[0027]下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
[0028]本发明利用湿热法制备葡萄糖-SPI复合物，通过测定产物的溶解度、乳化活性和乳化稳定性，研究糖基化温度和时间、蛋白与葡萄糖质量比对大豆分离蛋白溶解性和乳化能力的影响，确定最佳工艺条件。
[0029]1、材料与方法
[0030]1.1材料与试剂
[0031]大豆分离蛋白(蛋白含量≥90% ):哈尔滨高科大豆食品公司；九三非转基因大豆油:九三集团哈尔滨惠康食品有限公司；牛血清白蛋白:Sigma公司；SDS:Solarbio公司；葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等试剂均为国产分析纯。
[0032]1.2仪器与设备
[0033]AL-104型精密电子天平:上海梅特勒_托利多仪器设备有限公司；DK_8B型电热恒温水浴锅:上海精宏实验设备有限公司；冷冻干燥机:北京博医康实验仪器有限公司；QT-1旋涡混合器:上海琪特分析仪器有限公司；TGL-16C型高速离心机:上海安亭科学仪器厂；721型可见分光光度计:上海元析仪器有限公司；T18高速匀浆机:德国IKA公司。
[0034]1.3试验方法
[0035]1.3.1糖基化大豆分离蛋白的制备
[0036]将一定量的大豆分离蛋白和葡萄糖用蒸馏水配制成混合均匀的溶液，溶液中蛋白与葡萄糖的质量比分别为4: 1、2: 1、1: 1、1: 2，其中蛋白浓度为8% (w/v) 0将上述溶液用保鲜膜密封放置在70°C、80°C和90°C的恒温水浴锅中进行糖基化反应，分别在反应开始的0、l、2、3、4、5、6h取出一定量的样品,将样品冷冻干燥后置于4°C下保存备用。双缩脲法测定样品中蛋白质含量。
[0037]1.3.2糖基化大豆分离蛋白溶解性的测定
[0038]参照孙焕等人的双缩脲法，并稍作修改。将制备得到的样品配制成蛋白浓度1%(w/v)的溶液,充分搅拌后，3000r/min离心30min,取上清液ImL于试管中，加入双缩脲试剂4mL，振荡后放置30min，于540nm处进行比色测定，根据标准曲线计算出上清液中蛋白含量。
[0039]1.3.3糖基化大豆分离蛋白乳化能力的测定
[0040]参照Tang等人的浊度法，并稍作修改。将样品溶于0.2mol/L (pH7.0)的磷酸盐缓冲溶液中，使蛋白浓度为lmg/mL，将2mL大豆油和8mL样品溶液放入直径为2.5cm的塑料离心管中高速匀浆lmin，分别于O和IOmin从离心管底部吸取50 μ L匀浆液加入到5mL0.1 %SDS溶液中，振荡混匀后在500nm处测定吸光值，记作Atl和A1(l。用0.1 % SDS溶液作为空白对照。用零时刻的吸光值Atl表示乳化活性(emulsifying activity, EA),乳化稳定性(emulsifying stability, ES)用如下公式表示:
[0041]
【权利要求】
1.高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法，其特征在于所述制备方法步骤如下:将一定量的大豆分离蛋白和葡萄糖用蒸馏水配制成混合均匀的溶液，控制溶液中大豆分离蛋白与葡萄糖的质量比为0.5?4: I ;将上述溶液密封后在70?90°C的条件下进行糖基化反应I?6h。
2.根据权利要求1所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法，其特征在于所述大豆分离蛋白浓度为8% (w/v) 0
3.根据权利要求1或2所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法，其特征在于所述大豆分离蛋白与葡萄糖质量比为1: 2，反应温度为80°C，反应时间为2h。
4.根据权利要求1或2所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法，其特征在于所述大豆分离蛋白与葡萄糖质量比为1: 1，反应温度为90°C，反应时间为6h。
5.根据权利要求1或2所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分离蛋白的制备方法，其特征在于所述大豆分离蛋白与葡萄糖质量比为1: 2，反应温度为90°C，反应时间为3h。
【文档编号】A23J3/16GK103652316SQ201310697737
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】夏秀芳, 孔保华, 吕鸿鹄, 韩建春, 郑环宇, 李芳菲 申请人:东北农业大学