一种提高新霉素产量的生产方法
【专利摘要】本发明涉及一种提高新霉素产量的生产方法，用花生饼粉、玉米淀粉、大米粉、酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、硫酸铵、氯化钠、轻质碳酸钙、KH2PO4的弗氏链霉菌常规发酵培养基中，加入选自下述的一种或多种添加剂：赖氨酸、乳酸亚铁、酪氨酸、蛋氨酸、水解酪素、维生素B12、果糖、氨基葡萄糖、叶酸、核黄素、色氨酸。本发明的优点是提高新霉素产量5-20％以上，降低成本，发酵效率增高。本发明产品用于治疗人类疾病和畜牧业，作抗生素用。
【专利说明】一种提高新霉素产量的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明提供一种新霉素的生产方法，具体地说，提供一种提高新霉素产量的生产方法。是涉及用微生物发酵并提高新霉素产量的制备方法。
【背景技术】
[0002]新霉素是一种氨基糖苷类抗生素。新霉素是首个被发现的2 — DOS (2—脱氧链霉胺)氨基糖苷类抗生素，它是1949年Waksman等从弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)代谢产物中分离得到的一种氨基环多醇复合抗生素，主要与细菌核糖体30S亚基结合，抑制细菌合成蛋白质。弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)菌株可以商业购买，也是国内新霉素微生物发酵生产工艺中所用的菌株。临床常用硫酸新霉素(Neomycin Salfate),分子式:C23H46N6013.3(H2S04)。该产品为白色或微黄色结晶，无臭，对热稳定，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于有机溶剂，吸湿性强，易潮解。由于其抗菌谱广，对革兰氏阴、阳性菌、结核杆菌等均有抑制作用。口服给药在体内难以吸收，在肠道中保持较高浓度，确保其杀菌效果，适用于胃肠道感染、呼吸道感染、皮肤感染五官科疾病的治疗和腹部手术前的消毒等；同时因其能提高饲料利用率，促进禽畜生长，因此被广泛应用于畜牧业。如今国际上在硫酸新霉素的应用研究上有了新的进展，欧美、西德等国家和地区广泛应用于畜牧业。
[0003]中国于上世纪六、七十年代开始生产新霉素，该药品已成为医药工业中的一种老药品。长期以来，由于生产过程复杂，周期长，产率低。工艺自身发展的局限，生产得率及生产周期似已达到极限。目前该药品的生产发酵周期在130-170小时，提炼收率85%，发酵单位为16000-19000单位/毫升，因此，如何提高新霉素的产菌率，降低生产成本仍是各研究单位的重要课题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现`有技术存在的问题，而提供一种提高新霉素发酵效率的制备方法，显著地提高了新霉素的产量。
[0005]本发明目的是可以通过如下措施来实现:
[0006]本发明提供了一种提高新霉素产量的生产方法，所述方法是采用微生物发酵法，并且使用弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae),其特征在于在常规发酵培养基中加入添加剂，所述添加剂选自如下的一种或者多种:赖氨酸、乳酸亚铁、蛋氨酸、酪氨酸、水解酪素、维生素B12、果糖、氨基葡萄糖、叶酸、核黄素、色氨酸。
[0007]上述所述的生产方法，其中添加剂的加入量，优选为:赖氨酸0.05-0.5克/升、乳酸亚铁0.05-0.5克/升、蛋氨酸0.3-1.0克/升、酪氨酸0.01-0.3克/升、水解酪素0.5-50克/升、维生素B120.02-0.45毫克/升、果糖0.5-25克/升、氨基葡萄糖0.5-25克/升、叶酸0.01-0.2毫克/升、核黄素0.02-0.45毫克/升或者色氨酸0.1-0.3克/升。。
[0008]上述所述的生产方法，其中所述的常规发酵培养基，是指已有的新霉素微生物发酵工艺中所用的发酵培养基，例如，发酵培养基的组成，按培养基体积g/100ml计为:黄豆饼粉0.5、花生饼粉2.8、大米粉5.0、酵母粉0.9、葡萄糖1.5、蛋白胨1.0、硫酸铵0.5、氯化钠0.45轻质碳酸钙0.45、KH2PO40.06、α -淀粉酶0.02、豆油0.12、硅油0.05。
[0009]作为本发明一【具体实施方式】，上述所述的生产方法，其具体包括如下步骤:
[0010](I)斜面培养制得斜面孢子:将弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)接种至斜面培养基内，接后于28 V的恒温室培养10~12天，得斜面孢子，其中，所述的斜面培养基为(g/100ml):葡萄糖1.0、牛肉膏0.2、琼脂1.8~2.2、磷酸氢二钾0.05和DL-天冬素0.05 ；
[0011](2)制备斜面孢子悬浮液:选步骤(1)中生长正常且符合质量要求的斜面孢子，在无菌条件下，加无菌水制成孢子悬液，置0-4°C条件下保存，保存时间为Shr内，得待接种用斜面孢子悬浮液；
[0012](3)繁殖罐培养制备新霉素繁殖培养物:将步骤(2)制得的斜面孢子悬浮液置于繁殖罐中进行扩大培养，种子接入量为扩大培养基体积的2%，培养温度为36°C，培养时间为42小时，得到新霉素繁殖培养物，其中，繁殖罐培养所用的培养基为:按g/100ml计，花生饼粉1.0、玉米淀粉1.0、酵母粉2.25、葡萄糖2.5、蛋白胨0.5、硫酸铵0.1、轻质碳酸钙1.4、Na2HPO40.1、豆油 0.28 ；
[0013](4)发酵罐发酵培养制备新霉素发酵产物:将步骤(3)所制得的新霉素繁殖培养物置于发酵罐中进行发酵培养，种子接入量为发酵培养基体积的15~20%，发酵温度为35°C，发酵时间为130小时，得到新霉素发酵产物，其中，发酵罐培养所用的培养基为:按g/100ml计，黄豆饼粉0.5、花生饼粉2.8、大米粉5.0、酵母粉0.9、葡萄糖1.5、蛋白胨1.0、硫酸铵0.5、氯化钠0.45 、轻质碳酸钙0.45、ΚΗ2Ρ040.06、α -淀粉酶0.02、豆油0.12、硅油0.05，并加入添加剂，按培养基的体积计，所述添加剂选自如下的一种或者一种以上:赖氨酸0.05-0.5克/升，乳酸亚铁0.05-0.5克/升，蛋氨酸0.3-1.0克/升，酪氨酸0.01-0.3克/升，维生素Β12，0.02-0.45毫克/升，水解酪素0.5-50克/升，果糖0.5-25克/升，氨基葡萄糖0.5-25克/升，叶酸0.01-0.2毫克/升，核黄素0.02-0.45毫克/升，色氨酸0.1-0.3 克 / 升；
[0014](5)将步骤(4)所得到的新霉素发酵产物经分离和纯化处理制得新霉素。
[0015]其中，上述所述的生产方法，其中优选在步骤(2)中，通过种子培养考察斜面孢子质量，每只种瓶接种量为3-4cm2斜面孢子，每只种瓶中培养基为80ml，于转速为220-240rpm的摇瓶机上，在温度为35°C的条件下培养6天，得种子发酵液考察斜面孢子质量，其中种子培养所用的培养基为(g/100ml):葡萄糖2.0、DL-天冬素0.06、蛋白胨0.5、花生饼粉2.8、酵母粉0.5、大米粉8.0、玉米浆0.25、淀粉酶0.0025、硫酸铵0.6、轻质碳酸钙0.45。
[0016]作为实施方式之一，上述所述的生产方法，其中所述的分离和纯化处理制得新霉素的过程包括如下步骤:(I)将得到的新霉素发酵产物进行酸化处理至PH值为6-7，得到新霉素酸化液；(2)将得到的新霉素酸化液以732型树脂进行吸附和解吸处理，得到新霉素解析液；(3)将得到的新霉素解析液以711型树脂进行脱色，得到新霉素脱色液；(4)将得到的新霉素脱色液进行薄膜浓缩，制得新霉素浓缩液。
[0017]优选地，上述所述的生产方法，其中还包括如下步骤:(I)将制得的新霉素浓缩液加入硫酸成盐后制得硫酸新霉素成品液；(2)将制得的硫酸新霉素成品液通过嗔雾干媒制得硫Ife新霉素成品。[0018]作为本发明一个【具体实施方式】，提供了一种提高新霉素产量的生产方法，其为:
[0019]斜面培养基(g/100ml)配方:葡萄糖1.0、牛肉膏0.2、琼脂1.8~2.2、磷酸氢二钾 0.05、DL-天冬素 0.05。
[0020]种瓶培养基(g/100ml)配方:葡萄糖2.0、DL-天冬素0.06、蛋白胨0.5、花生饼粉
2.8、酵母粉0.5、大米粉8.0、玉米浆0.25、淀粉酶0.0025、硫酸铵0.6、轻质碳酸钙0.45。
[0021]繁殖罐种子培养基(g/100ml)配方:花生饼粉1.0、玉米淀粉1.0、酵母粉2.25、葡萄糖2.5、蛋白胨0.5、硫酸铵0.1、轻质碳酸钙L 4、Na2HPO40.1、豆油0.28。
[0022]发酵罐发酵培养基(g/100ml)配方:黄豆饼粉0.5、花生饼粉2.8、大米粉5.0、酵母粉0.9、葡萄糖1.5、蛋白胨1.0、硫酸铵0.5、氯化钠0.45轻质碳酸钙0.45、KH2PO40.06、α -淀粉酶0.02、豆油0.12、硅油0.05，加入选自如下的一种或多种添加剂及其加入量:
[0023]
1)赖氨酸0.05-0.5 y_i/升
2)乳酸亚铁0.05-0.5 --/升
3)蛋氨酸0.3-1.0克/升
4)酪氨酸0.01-0.3克/升
5)维生素B120.02-0.45毫克/升
6)水解酪素0.5-50克/升
7)果糖0.5-25克/升
8)氨基葡萄糖0.5-25克/升
9)叶酸0.01-0.2毫克/升
10)核黄素0.02-0.45毫克/升
11)色氨酸0.1-0.3克/升。
[0024]斜面培养基制备:按处方量称取所用物料，溶解均匀，加饮用水至配制全量，然后用氢氧化钠溶液调节PH，使消后pH至6.0左右，分装至250ml茄瓶中，装量为50ml，于压力
0.1MPa，进行121°C、30min湿热灭菌，取出待稍冷后制成斜面，斜面长占茄瓶的2/3，冷却备用。
[0025]斜面接种培养:无菌挖块取生产新霉素用弗氏链霉菌菌种孢子约10_X6mm，用划线法涂布在斜面培养基上，用棉塞塞紧，接后于28°C的恒温室培养10~12天，得斜面孢子。
[0026]斜面孢子悬浮液制备:选2-3瓶生长正常且符合质量要求的孢子斜面，在无菌条件下，各加50ml无菌水制成孢子悬液，然后合并于750ml的三角瓶中，置0_4°C条件下保存，保存时间为8hr内，得待接种用斜面孢子悬浮液。
[0027]种子培养基制备:按处方量称取配料，溶解均匀，加纯化水至配制全量，然后用氢氧化钠溶液调节PH，使消后pH至6.5左右，分装至750ml三角瓶中，装量为80ml，于压力
0.1MPa，进行121°C、30min湿热灭菌，取出冷却备用。
[0028]种子培养:每只种瓶接种量为3-4cm2斜面孢子，每只种子瓶培养基为80ml，于转速为220-240rpm的摇瓶机上，在温度为35°C的条件下培养6天，得种子发酵液考察斜面种
子质量。
[0029]繁殖罐种子培养基制备:按繁殖罐种子培养基配比称量所需的原材料，加饮用水加至实际配制量，进行12rC、30min灭菌，备用。
[0030]繁殖罐种子接种及培养:将新霉素斜面孢子悬浮液置于繁殖罐中进行扩大培养，种子接入量为扩大培养基体积的2%，培养温度为36°C，培养时间为42小时，得到新霉素繁殖培养物。
[0031]发酵培养基制备:按发酵培养基配比称量所需的原材料，加饮用水加至实际配制量，进行121°C、30min灭菌，备用。
[0032]发酵培养:将上述繁殖培养物置于发酵培养基上进行发酵培养，种子接入量为发酵培养基体积的15-20%，发酵温度为35°C，发酵时间为130小时，得到新霉素发酵产物；
[0033]将上步得到的新霉素发酵产物进行酸化处理至pH值为6-7，得到新霉素酸化液；
[0034]将上步得到的新霉素溶液以732树脂进行吸附解吸处理，得到新霉素解析液；
[0035]将上步得到的新霉素解析液以711树脂进行脱色，得到新霉素脱色液；
[0036]将上步得到的新霉素脱色液以薄膜进行浓缩，得到新霉素浓缩液；
[0037]将上步得到的新霉素浓缩液加入硫酸成盐后制得硫酸新霉素成品液；
[0038]将上步得到硫酸新霉素通过喷雾干燥制得硫酸新霉素成品。
[0039]本发明令人意外地发现，在常规的新霉素微生物发酵生产工艺中，在其常规发酵培养基中加入特定的添加剂，能显著提高发酵液中新霉素的产量。且生产工艺相对易于控制，生产工艺改变小，且生产成本更低，能够更好地应用于规模化生产中。改进前生产的硫酸新霉素产品发酵液含量为18000u/ml，本发明生产的硫酸新霉素产品发酵液含量达22000u/mlo本发明相比传统发酵方法具有如下优点:提高新霉素产量5-20%以上，降低成本，增加发酵效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1:新霉素发酵配方增加添加剂发酵效率增幅百分比图表
[0041]具体实施方法
[0042]下面列举实施例，对本发明加以进一步说明，但本发明不只限于这些实施例。
[0043]实施例1:在黄豆饼粉0.5、花生饼粉2.8、大米粉5.0、酵母粉
[0044]0.9、葡萄糖1.5、蛋白胨1.0、硫酸铵0.5、氯化钠0.45轻质碳酸钙0.45、KH2PO40.06、α-淀粉酶0.02、豆油0.12、硅油0.05的弗氏链霉菌常规发酵培养基中，添加赖氨酸，浓度0.3克/升，按常规方法接种弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae-Η菌株)(SY060112)，在ρΗ7.0，培养温度35°C，体积50升的条件下发酵130小时。
[0045]实施方法:
[0046](I)斜面培养基％(g/100ml)配方:葡萄糖1.0、牛肉膏0.2、琼脂1.8~2.2、磷酸氢二钾0.05、DL-天冬素0.05
[0047](2)种瓶培养基％(g/100ml)配方:葡萄糖2.0、DL-天冬素0.06、蛋白胨0.5、花生饼粉2.8、酵母粉0.5、大米粉8.0、玉米浆0.25、淀粉酶0.0025、硫酸铵0.6、轻质碳酸钙
0.45[0048](3)繁殖罐种子培养基％(g/100ml)配方:花生饼粉1.0、玉米淀粉1.0、酵母粉
2.25、葡萄糖2.5、蛋白胨0.5、硫酸铵0.1、轻质碳酸钙L 4、Na2HPO40.1、豆油0.28
[0049](4)发酵罐发酵培养基％(g/100ml)配方:黄豆饼粉0.5、花生饼粉2.8、大米粉5.0、酵母粉0.9、葡萄糖1.5、蛋白胨1.0、硫酸铵0.5、氯化钠0.45轻质碳酸钙0.45、KH2PO40.06、α -淀粉酶0.02、豆油0.12、硅油0.05、赖氨酸浓度0.03
[0050](5)斜面培养基制备:按处方量称取所用物料，溶解均匀，加饮用水至配制全量，然后用氢氧化钠溶液调节ΡΗ，使消后pH至6.0左右，分装至250ml茄瓶中，装量为50ml，于压力0.1MPa，进行121°C、30min湿热灭菌，取出待稍冷后制成斜面，斜面长占茄瓶的2/3，冷却备用。
[0051](6)斜面接种培养:无菌挖块取生产新霉素用弗氏链霉菌菌种孢子约
用划线法涂布在斜面培养基上，用棉塞塞紧，接后于28°C的恒温室培养10~12天，得斜面孢子。
[0052](7)斜面孢子悬浮液制备:选2-3瓶生长正常且符合质量要求的孢子斜面，在无菌条件下，各加50ml无菌水制成孢子悬液，然后合并于750ml的三角瓶中，置0_4°C条件下保存，保存时间为8hr内，得待接种用斜面孢子悬浮液。(8)种子培养基制备:按处方量称取配料，溶解均匀，加纯化水至配制全量，然后用氢氧化钠溶液调节PH，使消后pH至6.5左右，分装至750ml三角瓶中，装量为80ml，于压力0.1MPa，进行121°C、30min湿热灭菌，取出冷却备用。
[0053](9)种子培养:每只种瓶接种量为3_4cm2斜面孢子,每只种子瓶培养基为80ml，于转速为220-240rpm的摇瓶机上，在温度为35°C的条件下培养6天，得种子发酵液考察斜面种子质量。
[0054](10)繁殖罐种子培养基制备:按繁殖罐种子培养基配比称量所需的原材料，加饮用水加至实际配制量，进行12rC、30min灭菌,备用。
[0055](11)繁殖罐种子接种及培养:将新霉素斜面孢子悬浮液置于繁殖罐中进行扩大培养，种子接入量为扩大培养基体积的2%，培养温度为36°C，培养时间为42小时，得到新霉素繁殖培养物。
[0056](12)发酵培养基制备:按发酵培养基配比称量所需的原材料，加饮用水加至实际配制量，进行12rC、30min灭菌，备用。
[0057](13)发酵培养:将上述繁殖培养物置于发酵培养基上进行发酵培养，种
[0058]子接入量为发酵培养基体积的15-20%，发酵温度为35°C，发酵
[0059]时间为130小时，得到新霉素发酵产物；
[0060]实施例2:添加剂是乳酸亚铁，浓度0.6克/升，代替实施例1中的赖氨酸浓度0.3克/升，培养基组成和用量，以及发酵条件均与实施例1相同。 [0061 ] 实施例3:添加剂是蛋氨酸，浓度0.6克/升，代替实施例1中的赖氨酸浓度0.3克/升，培养基组成和用量，以及发酵条件均与实施例1相同。
[0062]实施例4:添加剂是酪氨酸,浓度0.3克/升，代替实施例1中的赖氨酸浓度0.3克/升，培养基组成和用量，以及发酵条件均与实施例1相同。
[0063]实施例5:添加剂是水解酪素,浓度5克/升,代替实施例1中的赖氨酸浓度0.3克/升，培养基组成和用量，以及发酵条件均与实施例1相同。[0064]实施例6:添加剂是维生素B 12，浓度0.05毫克/升，代替实施例1中的赖氨酸浓度0.3克/升，培养基组成和用量，以及发酵条件均与实施例1相同。
[0065]实施例7:添加剂是果糖，浓度2.0克/升，代替实施例1中的赖氨酸浓度0.3克/升，培养基组成和用量，以及发酵条件均与实施例1相同。
[0066]实施例8:添加剂是氨基葡萄糖，浓度1.5克/升，代替实施例1中的赖氨酸浓度
0.3克/升，培养基组成和用量，以及发酵条件均与实施例1相同。
[0067]实施例9:添加剂是叶酸，浓度0.05毫克/升，代替实施例1中的赖氨酸浓度0.3克/升，培养基组成和用量，以及发酵条件均与实施例1相同。
[0068]实施例10:添加剂是核黄素，浓度0.05毫克/升，代替实施例1中的赖氨酸浓度
0.3克/升，培养基组成和用量，以及发酵条件均与实施例1相同。
[0069]实施例11:添加剂是色氨酸，浓度0.3克/升，代替实施例1中的赖氨酸浓度0.3克/升，培养基组成和用量，以及发酵条件均与实施例1相同。
[0070]对照例1:添加剂是 氯化镁，浓度0.3克/升，代替实施例1中的赖氨酸浓度0.3克/升，培养基组成和用量，以及发酵条件均与实施例1相同。
[0071]对照例2:添加剂是葡萄糖酸钠，浓度2.0克/升，代替实施例1中的赖氨酸浓度
0.3克/升，培养基组成和用量，以及发酵条件均与实施例1相同。
[0072]对照例3:添加剂是氯化锌，浓度0.4克/升，代替实施例1中的赖氨酸浓度0.3克/升，培养基组成和用量，以及发酵条件均与实施例1相同。
[0073]对照例:按实施I的方法，但发酵培养基中不添加任何添加剂。黄豆饼粉0.5克/升、花生饼粉2.8克/升、大米粉5.0克/升、酵母粉0.9克/升、葡萄糖1.5克/升、蛋白胨
1.0克/升、硫酸铵0.5克/升、氯化钠0.45克/升、轻质碳酸钙0.45克/升、KH2PO40.06克/升、α -淀粉酶0.02克/升、豆油0.12克/升、硅油0.05克/升的弗氏链霉菌常规发酵培养基中，按常规方法接种弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae-Η菌株)(代号SY060112)，在ρΗ7.0,培养温度35°C，体积50升的条件下发酵130小时。除不添加添加剂外，其他培养基组成和用量，以及发酵条件均与实施例1相同。
[0074]新霉素生物效价测定:
[0075]测量新霉素的生物效价的标准菌种为金黄色葡萄球菌。将已知效价的标准溶液和被检品溶液，滴加在金黄色葡萄球菌的培养基上进行对照培养，产生透明的抑菌圈。比较标准品和被检品抑菌圈的大小，计算新霉素抗菌效价和发酵效率，
[0076]对照例、实施例1 一 11以及对照例I 一 3的新霉素生物效价测定结果见表1和图1o
[0077]表1:添加剂对新霉素发酵单位和发酵效率的影响
[0078]
【权利要求】
1.一种提高新霉素产量的生产方法，所述方法是采用微生物发酵法，并且使用弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae),其特征在于在常规发酵培养基中加入添加剂,所述添加剂选自如下的一种或者多种:赖氨酸、乳酸亚铁、蛋氨酸、酪氨酸、水解酪素、维生素B12、果糖、氨基葡萄糖、叶酸、核黄素、色氨酸。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其中添加剂的加入量优选为:赖氨酸0.05-0.5克/升、乳酸亚铁0.05-0.5克/升、蛋氨酸0.3-1.0克/升、酪氨酸0.01-0.3克/升、水解酪素0.5-50克/升、维生素B120.02-0.45毫克/升、果糖0.5-25克/升、氨基葡萄糖0.5-25克/升、叶酸0.01-0.2毫克/升、核黄素0.02-0.45毫克/升或者色氨酸0.1-0.3克/升。
3.根据权利要求1-2所述的生产方法，其中所述的常规发酵培养基的组成，按g/100ml计为:黄豆饼粉0.5、花生饼粉2.8、大米粉5.0、酵母粉0.9、葡萄糖1.5、蛋白胨1.0、硫酸铵0.5、氯化钠0.45、轻质碳酸钙0.45、KH2PO40.06、α -淀粉酶0.02、豆油0.12、硅油0.05。
4.根据权利要求1-3所述的生产方法，其包括如下步骤: (1)斜面培养制得斜面孢子:将弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)接种至斜面培养基内，接后于28°C的恒温室培养10~12天，得斜面孢子，其中，所述的斜面培养基为(g/100ml):葡萄糖1.0、牛肉膏0.2、琼脂1.8~2.2、磷酸氢二钾0.05和DL-天冬素0.05 ； (2)制备斜面孢子悬浮液:选步骤(1)中生长正常且符合质量要求的斜面孢子，在无菌条件下，加无菌水制成孢子悬液，置0-4°C条件下保存，保存时间为Shr内，得待接种用斜面孢子悬浮液； (3)繁殖罐培养制备新霉素繁殖培养物:将步骤(2)制得的斜面孢子悬浮液置于繁殖罐中进行扩大培养，种 子接入量为扩大培养基体积的2%，培养温度为36°C，培养时间为42小时，得到新霉素繁殖培养物，其中，繁殖罐培养所用的培养基为:按g/100ml计，花生饼粉1.0、玉米淀粉1.0、酵母粉2.25、葡萄糖2.5、蛋白胨0.5、硫酸铵0.1、轻质碳酸钙1.4、Na2HP040.1、豆油 0.28 ； (4)发酵罐发酵培养制备新霉素发酵产物:将步骤(3)所制得的新霉素繁殖培养物置于发酵罐中进行发酵培养，种子接入量为发酵培养基体积的15~20%，发酵温度为35°C，发酵时间为130小时，得到新霉素发酵产物，其中，发酵罐培养所用的培养基为:按g/100ml计，黄豆饼粉0.5、花生饼粉2.8、大米粉5.0、酵母粉0.9、葡萄糖1.5、蛋白胨1.0、硫酸铵0.5、氯化钠0.45、轻质碳酸钙0.45、KH2PO40.06、α -淀粉酶0.02、豆油0.12、硅油0.05，并加入添加剂，按培养基的体积计，所述添加剂选自如下的一种或者一种以上:赖氨酸0.05-0.5克/升，乳酸亚铁0.05-0.5克/升，蛋氨酸0.3-1.0克/升，酪氨酸0.01-0.3克/升，维生素Β12，0.02-0.45毫克/升，水解酪素0.5-50克/升，果糖0.5-25克/升，氨基葡萄糖0.5-25克/升，叶酸0.01-0.2毫克/升，核黄素0.02-0.45毫克/升，色氨酸0.1-0.3克/升； (5)将步骤(4)所得到的新霉素发酵产物经分离和纯化处理制得新霉素。
5.根据权利要求4所述的生产方法，其中在步骤(2)中，通过种子培养考察斜面孢子质量，每只种瓶接种量为3-4cm2斜面孢子，每只种瓶中培养基为80ml，于转速为220_240rpm的摇瓶机上，在温度为35°C的条件下培养6天，得种子发酵液考察斜面孢子质量，其中种子培养所用的培养基为(g/100ml):葡萄糖2.0、DL-天冬素0.06、蛋白胨0.5、花生饼粉2.8、酵母粉0.5、大米粉8.0、玉米浆0.25、淀粉酶0.0025、硫酸铵0.6、轻质碳酸钙0.45。
6.根据权利要求1一 5所述的生产方法，其中所述的分离和纯化处理制得新霉素的过程包括如下步骤:(I)将得到的新霉素发酵产物进行酸化处理至PH值为6-7，得到新霉素酸化液；(2)将得到的新霉素酸化液以732型树脂进行吸附和解吸处理，得到新霉素解析液；(3)将得到的新霉素解析液以711型树脂进行脱色，得到新霉素脱色液；(4)将得到的新霉素脱色液进行薄膜浓缩，制得新霉素浓缩液。
7.根据权利要求1一 6所述的生产方法，其中还包括如下步骤:(I)将制得的新霉素浓缩液加入硫fe成盐后制得硫fe新霉素成品液;(2)将制得的硫酸新霉素成品液通过喂雾干燥制得硫酸新霉素成品。`
【文档编号】C12P19/52GK103740790SQ201310713136
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】尹国民, 齐红革, 郑朝霞, 刘洪海, 唐茂峰 申请人:烟台只楚药业有限公司