一种预测强直性脊柱炎易感性的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种预测强直性脊柱炎易感性的试剂盒，属于医学生物【技术领域】。通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的DDX39B基因SNP位点的基因型，预测受试者对强直性脊柱炎的易感性。本发明的优点是：首次阐述了DDX39B基因多态性位点与强直性脊柱炎的相关性，提供了一种预测强直性脊柱炎易感性的方法，该方法可用于强直性脊柱炎的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。
【专利说明】一种预测强直性脊柱炎易感性的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种预测强直性脊柱炎易感性的试剂盒，更具体的说是通过测定与AS相关基因DDX39B的多态性预测受试者对于强直性脊柱炎的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis, AS)是一种自身免疫性疾病，多发于16-40岁的青壮年，男女患病比例约为4~10:1。病变常首先发生于骶髂关节，少数重症患者表现为整个脊柱强直。此外，部分患者伴有不同程度的髋关节、眼、肺、心血管、肾等脊柱外病变。AS在白种人群中的发病率约为1%~3%，我国AS患病率约为0.2-0.6%，其中60%以上的患者伴有髋关节受累，致使20%以上AS患者残疾，炎症主要累及关节囊、肌腱和韧带的骨附着点，导致局部关节粘连强直，活动受限。临床上至今尚缺乏可明显缓解和控制疾病发展的药物。AS属多基因疾病，具有明显的遗传倾向，虽然通常认为遗传与免疫因素在AS发病中起主导作用，但确切的病因与发病机制仍不清楚。
[0003]目前进行AS遗传病因研究，多采用SNP作为基因组标志的关联分析方法，是有效的，已得到证明。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需>1%，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.1%为同型碱基之间的转换:如G/A或T/C，29.1%为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C (胞嘧啶)是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T (胸腺嘧啶)，SNP包含了已知 多态性的80-90%，是最常见的遗传变异。
[0004]由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个。SNP以其密度高(平均每Ikb就有I个)、代表性强(位于基因内部的SNP可能直接影响蛋白质结构或表达水平)、遗传稳定性好(同微卫星多态性比较而言)、易于自动化分析(因SNP在人群中多为双等位基因标记，可简单以“+ / 一或1/0”直接分型)等特点成为很好的遗传标志。
[0005]1973年，Brewerton等首先发现了与AS强相关的人类白细胞抗原_B27(HLA_B27 )。随着研究的进展，与AS相关的其他易感基因如肿瘤坏死因子-α (TNF-α )、白介素-1(IL-1)陆续被识别。
[0006]DDX39B基因含有11个外显子，属DEAD box家族成员可编码3种mRNA，但NR_037852.1无法被翻译成蛋白。DEAD box家族蛋白具有一个高度保守的Asp-Glu-Ala-Asp (DEAD)序列，在RNA的代谢过程中起十分重要的作用，可参与mRNA的剪接，RNA通过核孔的过程以及RNA的降解等。DDX39B是U2小核核糖蛋白介导的mRAN前体的剪切过程中的必备因子，同时介导RNA穿过核孔进入细胞质的过程。目前尚无任何关于DDX39B基因与AS相关联的研究结果。
【发明内容】
[0007]本发明的主要目的是提供一种预测强直性脊柱炎易感性的方法。
[0008]本发明的第二个目的是提供一种预测强直性脊柱炎易感性的试剂盒，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。
[0009]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0010]检测强直性脊柱炎易感性的核酸序列，为序列表SEQ ID N0.1所示碱基序列。其+401位即是变异位点，以字母“R”标示出。该核酸序列为DDX39B基因全长序列。图1为DDX39B基因结构及其多态性变异位点的示意图，附图中包含有2个外显子，rsl44802800位点标在DDX39B基因图中第7内含子区的相应位置。
[0011]一种检测强制性脊柱炎易感性的方法，检测受试者DDX39B基因rsl44802800多态性位点的基因型，基因型为CC时，受试者的易感性最低；携带T等位基因时，受试者的易感性升高。[0012]一组检测强直性脊柱炎易感性的引物，能特异扩增得到检测强直性脊柱炎易感性的核苷酸序列SEQ ID N0.1，引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID N0.2和序列表SEQ IDN0.3所示。
[0013]本发明提供了一种检测强直性脊柱炎易感性的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增DDX39B基因rsl44802800的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。本发明试剂盒中的全部组分、含量如下:
[0014]一种检测强直性脊柱炎易感基因的试剂盒，由以下试剂组成:
[0015](I) 10 μ L 10XPCR 缓冲液；
[0016](2 ) 2 μ L IOmMdNTP 混合液；
[0017](3) 2μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/y L ;
[0018](4) IyL Fl弓丨物，为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，浓度为IOpmol/μ L ;
[0019](5) IyL Rl弓丨物，为SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，浓度为IOpmol/μ L ;
[0020](6) 8 μ L IOXLC-Green Plus 饱和荧光染料；
[0021](7)2μ L寡核苷酸内参，由4种内参引物各0.5μ L组成，浓度为lOpmol/μ L，其中低温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列，低温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列；
[0022](8) 64 μ L 纯水。
[0023]使用方法如下:
[0024](I)PCR扩增:通过PCR扩增DDX39B基因的第6内含子区部分片段，制备混合液:10 X PCR 反应缓冲液 I μ L, 10mM/LdNTP0.2 μ L，TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L，10pM/L 上游引物
0.lyL，10pM/L下游引物0.1 μ L，I XLC-Green Plus饱和荧光染料0.8 μ L，寡核苷酸内参
0.2yL (高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05 μ L)(序列见表1)，基因组DNAl μ L，加纯水至10μ L。PCR反应条件为95°C预变性5min，95°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸5s,总共45个循环，72°C总延伸2min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理:95°C 30s, 25°C 2min,94°C 30s, 24°C 4min。PCR 前于每一体系中加入 20 μ L 的石蜡油，以防止液体挥发。[0025](2)基因型判定:将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light Scanner TMHR-196上进行HRM分析,用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析,根据熔解曲线的差异判定基因型。
[0026]DDX39B基因rsl44802800多态性位点在制备诊断或治疗强直性脊柱炎的试剂或药物中的用途。
[0027]本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品来源无限制，如:体液(血液、腹水及尿液等)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。调整基因组DNA的浓度，使其尽可能的一致。以基因组DNA为模板，可扩增出含DDX39B基因突变位点的核酸片段，以获取测定的大量样本。这种通过扩增含DDX39B基因变异点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。
[0028]在进行基因辅助诊断时，本发明优先适用于测定根据DDX39B基因的突变类型存在的辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定DDX39B基因突变类型的方法。按采用的测定方法来选择适当的特定试剂，如DNA片段和/或用于PCR扩增步骤的引物。
[0029]本发明的优点是:本发明首次阐明了 DDX39B基因多态性位点与AS的相关性，提供了一种预测AS易感性的方法，该方法可用于AS的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。
[0030]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步叙述，以便公众对
【发明内容】
有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
【专利附图】
【附图说明】
`[0031]图1DDX39B基因结构及rsl44802800位点示意图
[0032]图2为DDX39B基因变异位点经HRM方法的基因分型图
[0033]图3为DDX39B基因变异位点的测序图
【具体实施方式】
[0034]用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下:
[0035]10XPCR 缓冲液:10mM Tris-HCI (pH=8.3), 500mM 氯化钾(KCl)，IOmM 氯化镁(MgCl2)70.01%(W/V)白明胶
[0036]dNTP:脱氧核苷三磷酸
[0037]EDTA:乙二胺四乙酸二钠
[0038]TE: IOmM Tris-HCl (pH=7.5)，ImM EDTA (pH=8.0)
[0039]实施例1:血液样本收集和基因组DNA的提取:
[0040]一.病例入选:
[0041]按纽约1984年的修订诊断标准入选病例,共选取来自吉林地区无血缘关系的AS患者136例(年龄:14-44岁，平均24岁)，同地区的健康对照志愿者148例(年龄:39-72岁，平均46岁)。所有受检者均为汉族且签署书面知情同意书，这项研究得到卫生部北京医院，卫生部老年医学研究所伦理审核委员会的认可，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》:人体医学研究的伦理原则。
[0042]二.根据下列方法，制备人基因组DNA。
[0043]1.在已标号的1.5mLEP管中加1000 μ L红细胞裂解液，后加入400 μ LEDTA抗凝血(抗凝血加入前颠倒混匀3-5次)，颠倒混匀，室温静置10分钟；
[0044]2.13000rpm离心30秒后，除去上清液；
[0045]3.在所得沉淀中加480 μ L核酸裂解液，弹击管壁，充分混匀后加入20 μ L蛋白酶K (用裂核液稀释20倍稀释蛋白酶K)，颠倒混匀，65°C孵箱10分钟，(期间不时上下混匀，确保无凝块);
[0046]4.拿出后降至室温，加300μ L蛋白沉淀液，充分颠倒混匀，静置10分钟，13000rpm离心2分钟；
[0047]5.将上清液移至新EP管中，加入670 μ L预冷的异丙醇，充分颠倒混匀(10次以上)，可见线状DNA逐渐形成小团块，13000rpm离心2分钟；
[0048]6.弃上清液并确保沉淀留在EP管中，加入670 μ L70%乙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心2分钟；
[0049]7.弃上清，使管内乙醇挥发干净；
[0050]8.加入TE溶液( 400 μ L)，充分溶解，对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分析，吸取部分DNA溶液作为工作液，浓度校正至20ng/ μ L，置于4°C备用，剩余基因组DNA置_20°C冰箱保存。
[0051]实施例2 SNP的识别鉴定
[0052]本发明采用PCR-高分辨率熔解曲线(HRM)分析法和PCR测序技术同时对DDX39B基因rsl44802800 (其等位位点为C/T)的基因型进行检测。
[0053]一.PCR-HRM弓丨物的确定
[0054]从Genebank 中查取 DDX39B 基因 rs 144802800 附近的 DNA 碱基序列(Seq IDN0.1)，引物设计在01igo7.0软件下完成。目的片段定位在DDX39B基因第7内含子区，全长52bp，确定了正义链Fl与反义链Rl的特异性引物序列如下:
[0055]Fl:5，-AGCTGGCGTCTGAGGTAGCAC-3，(Seq ID N0.2)
[0056]Rl:5’ -GCATGTCTGGCAAGTTTGATTTCTG-3’ (Seq ID N0.3)
[0057]二.PCR反应体系及反应条件
[0058]通过PCR扩增DDX39B基因第2内含子区部分片段，PCR反应体系为:10XPCR反应缓冲液 I μ L, 10mM/LdNTP0.2 μ L, TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L, 10pM/L 上游引物 0.1 μ L, IOpM/L下游引物0.1 μ L，IOXLC-Green Plus饱和荧光染料0.8 μ L，寡核苷酸内参0.2 μ L (高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05 μ L)(序列见表1)，基因组DNAl μ L，加去离子水至IOyL0 PCR时于每一体系中加入20 μ L石蜡油，防止液体挥发。PCR反应条件为95°C预变性5min, 95°C变性30s，65。。退火30s, 72°C延伸5s，总共45个循环，72°C总延伸2min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理:95°C 30s, 25°C 2min，94°C 30s,24°C4min。
[0059]表1:高、低温寡核苷酸内参引物序列、退火温度及产物片段长度
[0060]
【权利要求】
1.检测强直性脊柱炎易感性的核酸序列，其特征在于:为序列表SEQID N0.1所示碱基序列。
2.一种检测强制性脊柱炎易感性的方法，其特征在于:检测受试者DDX39B基因rsl44802800多态性位点的基因型，基因型为CC时，受试者的易感性最低；携带T等位基因时，受试者的易感性升高。
3.—组检测强直性脊柱炎易感性的引物，其特征在于:能扩增得到权利要求1所述的检测强直性脊柱炎易感性的核苷酸序列，引物的核苷酸序列分别为序列表SEQID N0.2和序列表SEQ ID N0.3所示。
4.一种检测强直性脊柱炎易感基因的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成: (1)10 μ L 10XPCR 缓冲液；
(2)2 μ L IOmMdNTP 混合液；
(3)2μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/y L ; (4)IyL Fl引物，为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/yL; (5)IyL Rl引物，为SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/yL; (6)8μ L IOXLC-Green Plus 饱和荧光染料； (7)2 μ L寡核苷酸内参，由4种内参引物各0.5 μ L组成，浓度为IOpmol/μ L，其中低温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列，低温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列；
(8)64 μ L 纯水。`
5.DDX39B基因rsl44802800多态性位点在制备诊断或治疗强直性脊柱炎的试剂或药物中的用途。
【文档编号】C12N15/11GK103882113SQ201310713077
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】杨泽, 朱小泉, 杨帆, 孙亮, 史晓红, 唐雷, 原慧萍, 张玉荣, 赵承孝, 赵帆, 王娜娜, 惠娟, 张政 申请人:卫生部北京医院